Terapia Génica, Farmacogenética e Farmacogenómica PDF

Terapia Génica, Farmacogenética e Farmacogenómica ================================================= **Terapia Génica:** Refere-se à introdução, remoção ou alteração de material genético no interior de células humanas com o objetivo de tratar doenças. Isso pode incluir a introdução de novos genes, a...

Terapia Génica, Farmacogenética e Farmacogenómica ================================================= **Terapia Génica:** Refere-se à introdução, remoção ou alteração de material genético no interior de células humanas com o objetivo de tratar doenças. Isso pode incluir a introdução de novos genes, a inibição de genes defeituosos causadores de doenças ou a substituição de genes para auxiliar na função celular ou no combate a doenças. O conceito é aplicável tanto a doenças genéticas hereditárias quanto a condições adquiridas, como o cancro ou doenças virais​. **Terapia Génica Translacional:** Processo que transforma descobertas da investigação básica em aplicações práticas que beneficiem os pacientes na clínica. Foca-se na ponte entre o laboratório e o ambiente clínico, integrando avanços científicos, como a identificação de genes causadores de doenças e o desenvolvimento de ferramentas de edição genética, com estratégias terapêuticas que podem ser usadas diretamente em seres humanos. - **Exemplo: Investigação básica -** Estudo dos mecanismos moleculares de uma doença genética (como a mutação no gene CFTR na fibrose quística); **Terapia translacional -** Desenvolvimento de vetores ou tecnologias, como CRISPR-Cas9, para corrigir essa mutação diretamente nas células do paciente. **Etapas da Terapia Génica Translacional:** 1. **Identificação da causa genética da doença**: Compreensão detalhada dos genes ou mutações envolvidos; 2. **Desenvolvimento de ferramentas terapêuticas**: Inclui vetores (virais ou não virais), estratégias de edição genética (ex.: CRISPR, TALENs) ou tecnologias de entrega de genes. 3. **Ensaios pré-clínicos:** Testes em modelos celulares e animais para avaliar a segurança, eficácia e viabilidade do tratamento. 4. **Ensaios clínicos:** Aplicação controlada em humanos, dividida em fases, para confirmar os benefícios terapêuticos e monitorar possíveis riscos. **Principais doenças-alvo da Terapia Génica Translacional:** - **Doenças monogénicas** (causadas por mutações em um único gene): fibrose quística (CFTR), atrofia muscular espinhal, beta-talassemia, imunodeficiência combinada severa por deficiência de adenosina-desaminase (ADA-SCID). - **Cancro**: Terapias como CAR-T utilizam células T modificadas geneticamente para atacar tumores específicos. - **Doenças infeciosas:** Como a modificação de genes para aumentar a resistência a vírus/bactérias. - **Doenças autoimunes e metabólicas**: Artrite reumatoide e hipercolesterolemia familiar​. **Vantagens/Potencialidades e Desvantagens/Riscos da Terapia Génica**: ​Vantagens Potencialidades Riscos Desvantagens ------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------- Correção da causa raiz de doenças genéticas Avanços na medicina regenerativa para substituição/reparação de tecidos Resposta imunitária adversa, especialmente com vetores virais Alto custo de produção e administração (400.000€-1.000.000€) Possibilidade de tratamentos personalizados (ex.: células autólogas que minimizam as rejeições) Desenvolvimento de tratamentos para doenças incuráveis (ex.: beta-talassemia) Integração descontrolada no genoma (riscos de oncogénese) Singularidade dos tratamentos dificulta acessibilidade Aplicação em doenças monogénicas e complexas (cancros, fibrose quística) Expansão de terapias imunológicas como CAR-T para vários cancros Expressão não controlada do gene terapêutico pode causar toxicidade Complexidade técnica no desenvolvimento e entrega de terapias Uso de tecnologias avançadas, como CRISPR-Cas9 Redução a longo prazo do custo de tratamentos crónicos Reações imprevisíveis, incluindo mutações em locais não-alvo (off-target) Questões éticas, especialmente na modificação da linha germinal\* **\*Questões Éticas Associadas à Terapia Génica:** - **Modificação da linha germinal humana:** Preocupações quanto às alterações hereditárias permanentes. - **Acessibilidade**: Alto custo torna os tratamentos inacessíveis para a maioria da população. - **Uso inadequado:** Preocupações com aplicações não terapêuticas, como a modificação genética para \"melhoramentos\" humanos​. **Doenças Monogénicas**: Correção direta de mutações genéticas específicas. Alguns exemplos de **abordagens** são: - **Fibrose Quística:** A mutação no **gene CFTR** provoca secreções espessas que afetam pulmões e outros órgãos. A terapia génica visa entregar uma cópia funcional do gene às células epiteliais do trato respiratório, geralmente usando vetores virais como AAV. - **ADA-SCID (Deficiência de Adenosina-Deaminase):** Distúrbio imunológico tratado com introdução do gene funcional em células-tronco hematopoiéticas retiradas do paciente e posteriormente reintroduzidas (terapia ex vivo). Terapias aprovadas, como *Strimvelis*, utilizam vetores retrovirais para corrigir essa deficiência. - **Atrofia Muscular Espinhal (SMA):** Terapias como Zolgensma utilizam vetores AAV para entregar o gene SMN1 funcional diretamente às células musculares (terapia in vivo) **Nota:** Estas abordagens são altamente eficazes porque corrigem diretamente o defeito genético que causa a doença, tornando possível uma solução de longo prazo ou mesmo a cura. **Doenças Complexas**: Exigem abordagens mais sofisticadas devido à interação de **múltiplos genes** e incluem o uso de células geneticamente modificadas para funções específicas. - **Cancros (leucemia, linfoma,...):** Terapias celulares como CAR-T (Chimeric Antigen Receptor T-cell) modificam geneticamente células T do paciente para reconhecer e atacar células tumorais específicas. Esta terapia ex vivo tem demonstrado sucesso em leucemias linfoblásticas e linfomas resistentes a tratamentos convencionais. - **Doenças cardiovasculares:** Terapias génicas visam restaurar a expressão de genes protetores ou reparar danos, como na hipercolesterolemia familiar, onde o gene LDLR pode ser corrigido em hepatócitos autólogos. - **Doenças neurodegenerativas (Huntington,...):** Abordagens como a inibição de genes mutados usando RNA de interferência (siRNA) são exploradas para silenciar genes que causam danos neuronais progressivos. - **Doenças inflamatórias intestinais (IBD):** Terapias baseadas em genes, como a modulação da expressão de IL23R, têm sido exploradas para melhorar a resposta imunitária e reduzir a inflamação As abordagens para tratar doenças monogénicas e complexas variam conforme o tipo de condição e os mecanismos terapêuticos utilizados. Os **Advanced Therapy Medicinal Products (ATMPs)** são um dos avanços mais significativos neste campo, sendo divididos em **3 categorias principais**: 1. **Medicamentos de Terapia Génica (GTMPs):** Contêm genes terapêuticos (recombinantes) que têm efeito direto ao serem inseridos no corpo. - **Mecanismo de ação:** O material genético regula, repara, substitui ou adiciona uma sequência de DNA ausente ou defeituosa. - **Aplicações:** Doenças genéticas como beta-talassemia (ex.: *Zynteglo*); Atrofia muscular espinhal com *Onasemnogene abeparvovec* (Zolgensma®), utilizando vetores AAV para entregar genes corretivos​​. 2. **Medicamentos de Terapia Celular Somática (sCTMPs):** Terapias baseadas no uso de células ou tecidos que foram modificados fora do corpo (ex vivo) para alterar as suas propriedades biológicas ou para realizar uma função terapêutica específica. Essas células/tecidos podem ser alteradas para funções novas/aprimoradas ou usadas para desempenhar funções diferentes das originais. - **Mecanismo de ação:** Podem ser de origem autólogas (do próprio paciente) ou alogénica (de outro dador). - **Aplicações:** Terapia celular para regeneração tecidual (ex.: células-tronco hematopoiéticas para reconstituição imunitária); Doenças cardiovasculares e reparação de tecidos danificados. 3. **Produtos de Engenharia de Tecidos (TEPs)**: Utilizam células/tecidos que foram modificados para reparar, regenerar ou substituir tecidos humanos danificados. - **Mecanismo de ação:** As células são cultivadas e manipuladas para adquirir propriedades terapêuticas específicas antes de serem reintroduzidas no corpo. - **Aplicações:** Regeneração óssea e cartilaginosa em pacientes com lesões traumáticas; Tratamento de feridas crónicas e reparação de órgãos​​. - GTMPs tratam diretamente as mutações genéticas subjacentes. - sCTMPs utilizam células como \"fábricas\" terapêuticas para modificar o ambiente celular. - TEPs ajudam na regeneração de tecidos e órgãos, complementando outras terapias. **Tecnologias de Edição de Genes como Intervenção Terapêutica:** - **CRISPR-Cas9**: Permite a edição precisa do genoma, corrigindo mutações específicas (in situ). - **RNA de interferência (siRNA, miRNA)**: Atua através da inibição da expressão de genes problemáticos, como oncogenes. - **Complementação génica**: Introdução de genes funcionais para substituir genes defeituosos​. - **Marcação de células específicas**: Por exemplo, para eliminar células tumorais usando toxinas conjugadas a anticorpos. **Terapia Génica Germinal vs. Somática** +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | Característica | Terapia Génica | Terapia Génica | | | Germinal | Somática | +=======================+=======================+=======================+ | Definição e | Modificação de genes | Alteração de genes em | | Transmissibilidade | nas células | células somáticas | | | germinativas (óvulos, | (não reprodutivas) -- | | | espermatozoides ou | alterações afetam | | | embriões) -- | apenas o indivíduo | | | alterações são | tratado | | | hereditárias | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | Aplicações e Exemplos | Potencial para | Tratamento de doenças | | | prevenir doenças | genéticas ou | | | genéticas em gerações | adquiridas no | | | futuras. Ex.: Estudos | paciente. Ex.: | | | experimentais para | Tratamentos aprovados | | | corrigir doenças | para condições como | | | hereditárias antes do | ADA-SCID e atrofia | | | nascimento. | muscular espinhal. | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | Complexidade técnica | Requer maior precisão | Focado em tecidos ou | | | devido ao impacto em | órgãos específicos, | | | todo o organismo e em | com menor impacto | | | gerações futuras. | sistémico. | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | Riscos | Possíveis mutações | Efeitos adversos no | | | indesejadas | organismo (ex.: | | | hereditárias. | ativação de | | | | oncogenes). | | | Impactos éticos e | | | | sociais | Possíveis respostas | | | significativos devido | imunitárias ou | | | à manipulação de | toxicidade. | | | embriões e impactos | | | | irreversíveis. | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | Estado atual | Limitada a estudos | Amplamente utilizada | | | experimentais; | em terapias aprovadas | | | proibida para | para doenças | | | aplicações clínicas | genéticas e | | | em muitos países. | oncológicas. | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ **Abordagens Ex vivo e In vivo na Terapia Génica:** **Ex vivo:** As células do paciente são retiradas, modificadas geneticamente em laboratório e reintroduzidas no organismo. A sua vantagem principal é ter um maior controlo sobre a modificação genética e menor risco de reações adversas. **Exemplo**: Terapia CAR-T​​ para cancro. **In vivo**: O vetor é introduzido diretamente no paciente, atingindo as células-alvo. A sua vantagem principal é ter menor complexidade logística. **Exemplo**: Uso de vírus AAV para tratar distúrbios como atrofia muscular espinhal. Vetores Utilizados na Terapia Génica: +-------------+-------------+-------------+-------------+-------------+ | | Tipo de | Característ | Vantagens | Limitações | | | Vetor | icas | | | | | | Principais | | | +=============+=============+=============+=============+=============+ | | **Adenovíru | DNA não | Alta | Altamente | | | s** | integrado | eficiência | imunogénico | | | | no genoma | de entrega | e expressão | | | | do | e rápida | transitória | | | | hospedeiro; | expressão | | | | | | génica | | | | | Capacidade | | | | | | de carga: | | | | | | até 7,5 kb | | | +-------------+-------------+-------------+-------------+-------------+ | | **Adeno-Ass | DNA | Excelente | Baixa | | | ociados | maioritaria | segurança e | imunogenici | | | (AAV)** | mente | longa | dade | | | | não | duração de | e limitação | | | | integrado; | expressão. | de tamanho | | | | | | do gene; | | | | Capacidade | | | | | | de carga: | | Produção | | | | \~4,7 kb | | complexa. | +-------------+-------------+-------------+-------------+-------------+ | | **Retrovíru | Integração | Expressão | Risco de | | | s** | estável no | estável do | inserção | | | | genoma do | gene; | descontrola | | | | hospedeiro; | | da | | | | | Ideal para | (oncogénese | | | | Infecta | terapia ex | ) | | | | apenas | vivo | e não é | | | | células em | | eficaz em | | | | divisão; | | células | | | | | | quiescentes | | | | Capacidade | | | | | | de carga: | | | | | | até 8 kb | | | +-------------+-------------+-------------+-------------+-------------+ | | **Lentivíru | Pode | Estável e | Risco de | | | s** | infetar | eficiente | oncogénese | | | | células em | em células | (menor que | | | | divisão e | não | retrovírus | | | | quiescentes | divididas; | convenciona | | | | ; | Menor | is) | | | | | imunogenici | | | | | Capacidade | dade | | | | | de carga: | que os | | | | | até 10 kb | retrovírus | | +-------------+-------------+-------------+-------------+-------------+ | | **Herpes | Grande | Ideal para | Risco | | | vírus** | capacidade | tecidos | imunológico | | | | de carga: | neuronais e | ; | | | | até 150 kb | alta | | | | | | capacidade | Menor uso | | | | | de entrega | em terapia | | | | | genética | génica | | | | | | comparado a | | | | | | outros | | | | | | vetores | +-------------+-------------+-------------+-------------+-------------+ | | **Lipossoma | Estruturas | Baixa | Eficiência | | | s** | lipídicas | imunogenici | limitada na | | | | biocompatív | dade; | entrega ao | | | | eis | Produção | núcleo e | | | | e | fácil e | expressão | | | | biodegradáv | segura; | geralmente | | | | eis | Capacidade | transitória | | | | que | de carga | | | | | encapsulam | flexível | | | | | material | | | | | | genético | | | +-------------+-------------+-------------+-------------+-------------+ | | **Nanopartí | Estruturas | Alta | Eficiência | | | culas | baseadas em | biocompatib | de entrega | | | Poliméricas | polímeros | ilidade | ao núcleo | | | ** | que | e reduzidas | inferior | | | | transportam | toxicidade | aos vetores | | | | material | e | virais | | | | genético | imunogenici | | | | | | dade | | +-------------+-------------+-------------+-------------+-------------+ | | **Complexos | Combinação | Proteção | Baixa | | | DNA-Lípidos | de DNA | contra | eficiência | | | ** | plasmídico | nucleases | de | | | | com | séricas; | expressão | | | | lípidos/pol | Redução do | génica; | | | | ímeros | risco de | Dificuldade | | | | catiónicos | degradação | em atingir | | | | | | alvos | | | | | | específicos | +-------------+-------------+-------------+-------------+-------------+ | | **Plasmídeo | DNA | Produção | Eficiência | | | s | circular | simples e | extremament | | | Nus** | transportad | barata e | e | | | | o | não | baixa e | | | | diretamente | imunogénico | limitado a | | | | sem uso de | | aplicações | | | | veículos | | locais/espe | | | | complexos. | | cíficas | +-------------+-------------+-------------+-------------+-------------+ - **Vetores virais**: Altamente eficientes, mas associados a riscos como imunogenicidade e oncogénese; melhores para aplicações que exigem expressão estável e em alvos específicos. - **Vetores não virais**: Mais seguros, com baixa imunogenicidade, mas menos eficientes na entrega de genes e na expressão estável. São preferidos em aplicações que exigem baixo risco. **Farmacogenética:** Estuda a associação entre variabilidade genética individual e a resposta a medicamentos. Foca-se em como os polimorfismos em genes específicos influenciam a eficácia e toxicidade de fármacos, permitindo adaptar tratamentos às características genéticas de cada paciente.​ **Farmacogenómica**: Envolve o estudo mais amplo da interação entre o genoma completo e a resposta a medicamentos, integrando biomarcadores genéticos e epigenéticos para prever e otimizar terapias em indivíduos ou populações​. **Benefícios** **Gerais da Medicina Personalizada baseada na Farmacogenética e Farmacogenómica**: - **Eficácia otimizada**: Ajuste da dose e escolha de medicamentos para maximizar os efeitos terapêuticos; - **Redução de efeitos adversos**: Identificação de variantes genéticas associadas à toxicidade medicamentosa; - **Prevenção do método de tentativa e erro**: Reduz o tempo e custo ao evitar medicamentos ineficazes. A **farmacogenómica molecular** (combinação da biologia molecular com a farmacogenética e farmacogenómica) explica como fatores genéticos, epigenéticos e moleculares influenciam a resposta individual a medicamentos. Os **principais mecanismos** são: 1. **Papel dos polimorfismos genéticos no metabolismo de fármacos:** Os polimorfismos nos genes que codificam enzimas metabolizadoras e proteínas-alvo dos medicamentos são determinantes chave na variabilidade individual. Exemplos: CYP450, TPMT (Tiopurina S-metiltransferase). 2. **Regulação epigenética e expressão génica:** - **Metilação do DNA**: Padrões alterados de metilação podem inibir a expressão de genes metabolizadores ou alvos de medicamentos, reduzindo sua eficácia. - **microRNAs**: Atuam como reguladores pós-transcricionais, influenciando a quantidade de proteínas-alvo disponíveis para interação com o fármaco​​. 3. **Impacto nos fármacos e terapias específicas:** - **5-Aminossalicilatos (5-ASA)**: Utilizados como 1ª linha em **doenças inflamatórias intestinais (IBD)**, estimulam os genes que têm expressão reduzida em pacientes com **colite ulcerosa ativa**. O tratamento com mesalazina aumenta a expressão desses genes, melhorando a resposta inflamatória​. - **Corticosteroides**: Variantes nos genes IL-1β e RN6/2 estão associadas à dependência de corticosteroides em pacientes com colite ulcerosa. A expressão aumentada de IL-18 também está ligada ao uso prolongado destes medicamentos​. - **Tiopurinas (azatioprina e 6-MP)**: Variantes nos genes **TPMT** e **NUDT15** afetam diretamente a toxicidade e eficácia. - **Anti-TNF (Infliximabe e Adalimumabe)**: A eficácia é modulada por polimorfismos nos genes **IL23R** e **TNFSF15**, que afetam a resposta inflamatória. Pacientes com variantes específicas apresentam menor resposta e maior risco de complicações​​. - **Anti-integrinas (Etrolizumabe)**: A expressão de **integrina αE** está associada à cicatrização da mucosa em pacientes com **colite ulcerosa** tratados com esta classe de medicamentos​. 4. **Farmacogenómica e microbiota:** - Pacientes com **doenças inflamatórias intestinais** frequentemente apresentam níveis reduzidos de **Faecalibacterium** e aumentados de **Escherichia coli**, o que afeta a resposta a terapias anti-inflamatórias​. Suplementos de **Bifidobacterium** e **Lactobacillus** (probióticos) demonstraram modular a resposta inflamatória em IBD, favorecendo uma maior eficácia dos tratamentos. 5. **Abordagem personalizada: farmacogenética aplicada** - Testes genéticos identificam polimorfismos que influenciam a escolha do medicamento e sua dose. - Exemplos práticos incluem a personalização da dose de warfarina com base em variantes no CYP2C9 e VKORC1 e a escolha de terapias anti-TNF conforme os biomarcadores genéticos dos pacientes​​. Com esta abordagem, a farmacogenómica molecular converge estas diferentes áreas para otimizar tratamentos, minimizar efeitos adversos e implementar estratégias personalizadas para doenças complexas, como IBD, cancro e doenças cardiovasculares. **Epigenética:** Adaptação estrutural das regiões cromossómicas para registar, sinalizar ou perpetuar estados alterados de atividade. **Código epigenético:** Enquanto o código genético se refere à sequência de DNA, o código epigenético envolve modificações no DNA ou nas histonas e RNAs não codificantes que alteram a expressão génica sem mudar a sequência do DNA. A **cromatina** apresenta diferentes níveis de organização, começando pelo **nucleossoma**, que é a unidade básica composta por **DNA enrolado em torno de oito histonas**, **estabilizado pela histona H1**. Estes **nucleossomas** formam uma estrutura semelhante a um \"colar de pérolas\", podendo compactar-se ainda mais em fibras de 30 nm (solenoides). **Tipos de cromatina:** 1. **Eucromatina**: Forma menos compacta, favorável à transcrição; 2. **Heterocromatina**: Mais compacta, associada ao silenciamento génico e pode ser **constituitiva** (regiões repetitivas do DNA tais como os centrómeros) ou **facultativa** (inclui a inativação do cromossoma X em mulheres). Níveis superiores de organização incluem loops de cromatina, que são essenciais para a regulação da expressão génica ao aproximar ou afastar elementos reguladores. As **modificações das histonas** desempenham um papel crucial na **regulação epigenética**: - **Acetilação:** Catalisada pelas **histonas acetiltransferases** (HATs), reduz a compactação da cromatina e favorece a transcrição. A desacetilação, promovida pelas histonas desacetilases (HDACs), reprime a expressão génica ao aumentar a compactação. - **Metilação:** Pode ter efeitos ativadores (H3K4me) ou repressivos (H3K9me, H3K27me) dependendo do local e contexto. Enzimas como as metiltransferases específicas de lisina (ex.: PRMTs) e desmetilases (ex.: LSD1) regulam estas modificações. - **Funções biológicas:** Estas modificações afetam a transcrição, a silenciação de genes, a heterocromatização e processos como a reparação do DNA. Estas modificações têm efeitos a curto prazo (transcrição, reparação do DNA) e longo prazo (memória celular). A **metilação do DNA** consiste na adição de um grupo metilo ao carbono 5 da citosina, ocorrendo frequentemente em di-nucleótidos CpG. Este processo, mediado por **DNA metiltransferases (DNMTs)**, está associado ao silenciamento génico (reduz a expressão de genes), imprinting genómico (regula a expressão de genes com base na origem parental) e inativação do cromossoma X (fundamental na compensação de dose em mulheres). **Enzimas envolvidas na Metilação:** - **Manutenção:** DNMT1 preserva os padrões de metilação após a replicação do DNA. - **De novo:** DNMT3a e DNMT3b estabelecem padrões específicos durante o desenvolvimento embrionário. - **Demetilação ativa:** Enzimas TET oxidam a 5-metilcitosina, promovendo sua remoção. - **Demetilação passiva:** Reduzida expressão de DNMTs durante a divisão celular. A metilação do DNA é um processo dinâmico e essencial em diferentes fases: - **Embrionária:** Após a fertilização, ocorre desmetilação global nos pró-núcleos masculino e feminino, seguida por remetilação na gastrulação. Este processo garante a diferenciação celular e a estabilidade epigenética. - **Gametogénese:** Inclui reprogramação epigenética para estabelecer os padrões de imprinting genómico. - **Vida adulta:** A metilação pode ser alterada por fatores ambientais, envelhecimento e doenças. **Reprogramação epigenética:** Essencial para reverter modificações adquiridas e restaurar padrões epigenéticos adequados. **Terapias epigenéticas** procuram reverter alterações epigenéticas associadas a doenças como o cancro e as hemoglobinopatias (ex.: anemia falciforme). - **Inibidores de DNMTs (DNA Metiltransferase):** Como a decitabina, promovem a reativação de genes silenciados. - **Inibidores de HDACs (histona deacetilase):** Favorecem a expressão génica, sendo usados em contextos como o aumento de hemoglobina fetal (HbF) em anemias. - **Compostos naturais:** têm potencial para reativar genes alvo, reduzindo toxicidades associadas a tratamentos convencionais. - **Epigalocatequina-3-galato (EGCG):** Reduz os níveis de HDAC8 e promove a reativação da HbF. - **Genisteína**: Atua na expressão de DNMTs e genes associados à HbF sem toxicidade significativa. - **Casos Específicos -- Hemoglobinopatias:** Reativação de HbF minimiza sintomas de anemia falciforme e é promissora como terapia de baixo custo e menor toxicidade. A **medicina de precisão** visa adaptar intervenções preventivas, diagnósticas ou terapêuticas a subpopulações específicas de pacientes, utilizando **biomarcadores** para identificar quem mais se beneficiará​​, determinando o risco, diagnóstico, prognóstico e monitorazando terapias​. **A biologia de sistemas** analisa interações entre elementos-chave (DNA, RNA, proteínas e metabólitos), promovendo uma visão holística dos processos biológicos​​. **Ciências ómicas:** Envolve a análise em larga escala, como genómica, transcriptómica, proteómica e metabolómica, abordando complexidades regulatórias​​. As **ciências genómica, transcriptómica, proteómica e metabolómica** estão interligadas, com a proteómica refletindo funções diretamente e a metabolómica abordando produtos finais​​. O fluxo de informação genética é: DNA → RNA → Proteína. Nas atualizações são adicionados mecanismos como RNA não codificante e modificações pós-traducionais​. **Genótipo:** Refere-se à informação genética codificada no DNA de um organismo e é fixo para cada indivíduo (com exceção de mutações somáticas). É estudado principalmente por meio da **genómica**, que avalia sequências de DNA e variações genéticas como SNPs (polimorfismos de nucleótido único). É essencial para compreender pré disposições e desenvolver intervenções personalizadas. - **Utilidades:** - **Previsão de predisposição:** Identifica variantes genéticas associadas a doenças, ajudando a prever riscos antes do início dos sintomas. - **Estudos populacionais:** Deteta padrões hereditários e variações que influenciam a suscetibilidade a doenças. - **Medicina de precisão:** Auxilia na personalização de tratamentos com base no perfil genético. - **Limitações:** - Nem toda informação genética leva diretamente a uma manifestação fenotípica (devido a interações epigenéticas ou ambientais). - Muitas doenças complexas, como diabetes ou câncer, dependem de múltiplos fatores, e o genótipo sozinho pode não ser suficiente para prever sua ocorrência. **Fenótipo:** Representa as **características observáveis** de um organismo, resultantes da **interação entre genótipo e fatores ambientais**. Inclui aspetos como a expressão de proteínas, metabolitos e características físicas. É estudado por ciências como a **proteómica**, **metabolómica** e **fenómica**, que avaliam o que está a acontecer funcionalmente no organismo e é fundamental para entender o estado atual do organismo, especialmente em doenças complexas, onde a manifestação depende de interações multifatoriais. - **Utilidades:** - **Reflexo da condição atual:** Oferece uma visão direta do estado fisiológico do organismo em resposta a fatores genéticos e ambientais. - **Estudos de mecanismos biológicos:** Identifica processos moleculares ativos, como alterações em vias metabólicas, respostas inflamatórias ou stress celular. - **Descoberta de biomarcadores:** Facilita a identificação de indicadores específicos de doenças ou efeitos terapêuticos. - **Limitações:** - Pode ser mais desafiador de interpretar, pois mudanças fenotípicas podem ter múltiplas causas (genéticas ou ambientais). - Muitas vezes exige técnicas complexas para coleta e análise, como espectrometria de massa e RMN. Resumindo, enquanto o **genótipo** pode indicar uma mutação associada a maior risco de cancro, o **fenótipo** revelará se essa mutação está ativa, quais as vias que estão a sofrer alterações e como o organismo está a reagir ao ambiente ou terapias. Em estudos clínicos, o fenótipo geralmente é mais relevante para identificar respostas terapêuticas e biomarcadores funcionais​. A screenshot of a computer Description automatically generated **Proteómica: É o e**studo abrangente de proteínas, incluindo identificação, quantificação, localização, análise de modificações pós-traducionais (PTMs)​​ e interações (como as proteínas interagem entre si ou com outras moléculas biológicas.). **Modificações pós-traducionais (PTMs):** São alterações químicas que ocorrem em proteínas após a sua tradução e são essenciais para funções regulatórias. Estas modificações criam **micro-heterogeneidade**, ou seja, diferentes versões de uma mesma proteína com funções diversas, aumentando significativamente a complexidade do proteoma​​, incluindo: - **Fosforilação**: Adição de um grupo fosfato (via quinases) em resíduos de serina, treonina ou tirosina. Regula a ativação e inativação de proteínas em cascatas de sinalização celular e impacta processos como divisão celular, resposta a stress e apoptose. - **Glicosilação**: Adição de carbohidratos, comum em proteínas de membrana; afeta o reconhecimento celular e estabilidade de proteínas. - **Acetilação e Metilação**: Modificações em histonas que regulam a expressão génica (epigenética). - **Ubiquitinação**: Marca proteínas para degradação no proteassoma. - **Hidroxilação/Sulfatação/Farnesilação**: Regulam a estabilidade, localização subcelular e interações moleculares. **Importância das PTMs:** - **Regulação Funcional**: As PTMs funcionam como \"interruptores\" moleculares, ativando ou desativando proteínas em momentos específicos. - **Sinalização Celular**: Modificações como fosforilação desempenham papéis centrais na transmissão de sinais entre células. - **Patologia**: Alterações anormais nas PTMs estão associadas a várias doenças, incluindo cancro (hiperfosforilação), diabetes e doenças neurodegenerativas. - **Biomarcadores**: PTMs específicas podem servir como indicadores diagnósticos e prognósticos. **Técnicas para Análise de PTMs:** - **Espectrometria de Massa (MS): Identificação de modificações em nível molecular com alta sensibilidade.** - **Imunoblotting e Anticorpos Específicos: Detetam PTMs como fosforilação com anticorpos específicos para o sítio modificado.** - **Eletroforese 2D: Separa proteínas com base em modificações que alteram sua carga e massa.** Técnicas em Proteómica: **Cromatografia:** Método para separar componentes de uma mistura, utilizando interações entre uma fase estacionária (geralmente um material sólido ou gel) e uma fase móvel (líquido ou gás). A cromatografia é frequentemente o 1º passo para purificar proteínas antes de análises mais detalhadas, como espectrometria de massa. - **Cromatografia Líquida: Útil para separar proteínas, péptidos e metabólitos. O gradiente de solventes é usado para eluir as proteínas da coluna. Exemplo: HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) oferece alta resolução e sensibilidade.** - **Cromatografia de troca iónica: Separa moléculas com base na carga e é amplamente usada em purificação de proteínas.** - **Cromatografia de Fase Reversa:** **Baseia-se na hidrofobicidade das proteínas e é geralmente combinada com espetrometria de massa para análise de péptidos.** - **Cromatografia de Exclusão por Tamanho: Separa** **proteínas com base no tamanho e forma molecular. É útil para analisar agregados de proteínas.** **Eletroforese**: Técnica que utiliza um campo elétrico para separar proteínas com base no seu tamanho e carga. Em termos de aplicação na proteómica, esta serve para identificar diferenças no perfil proteico entre amostras, como mudanças associadas a doenças ou estímulos experimentais​. - **PAGE (Poliacrilamida Gel Electrophoresis)**: Usada para analisar proteínas em estado nativo. As proteínas migram no gel com base nas suas cargas e tamanhos. - **SDS-PAGE (PAGE com Dodecil-Sulfato de Sódio)**: Proteínas são desnaturadas (perdem a sua estrutura tridimensional) e revestidas com SDS, que lhes confere carga negativa uniforme. Sob um campo elétrico, as proteínas migram pelo gel em direção ao polo positivo, ocorrendo uma separação exclusivamente por peso molecular (tamanho -- menores migram mias rápido). O resultado é um padrão de bandas em que cada uma representa proteínas de tamanhos específicos - **Isoeletrofocalização (IEF)**: Separa proteínas com base no ponto isoelétrico (pI), onde a carga líquida da proteína é zero. - **Eletroforese Bidimensional (2D-PAGE)**: Combina IEF (separação por pI) e SDS-PAGE (separação por tamanho), permitindo análise de complexos proteomas. Cada ponto no gel corresponde a uma proteína específica ou variante. **Espetrometria de massa (MS):** Técnica analítica que mede a massa de iões para identificar e caracterizar moléculas em uma amostra. Os seus componentes básicos são a **fonte de ionização** (pode ser MALDI (Ionização por Dessorção a Laser Assistida por Matriz) ou ESI (Ionização por Eletrospray), um **analisador de massa** (TOF -- tempo de voo, Quadruplo e Orbitrap) e um **detetor** (mede a intensidade dos iões e converte-os em sinais elétricos que depois são processados em espetros). - **Modos de Análise:** - **MS1:** Identifica os iões totais numa amostra. - **MS1-MS2**: Fragmenta os iões específicos peptídicos para identificar as proteínas e determinar a sua quantidade em amostras biológicas complexas. Este processo é muito utilizado em proteómica bottom-up e ocorre em **2** **etapas**: - Os iões gerados (MALDI ou ESI) são separados com base na relação massa/carga pelo 1º analisador de massa (MS1). Este passo deteta a presença de péptidos, mas não fornece informações específicas sobre suas sequências. - Os iões selecionados no MS1 são fragmentados em pequenas porções no 2º analisador de massa (MS2), geralmente por colisão com um gás inerte (CID - Dissociação Induzida por Colisão). Cada fragmento corresponde a uma porção do péptido, permitindo reconstruir a sua sequência. - **Aplicações:** - **Identificação de Proteínas**: Ao comparar os fragmentos obtidos com bancos de dados de referência, a sequência do péptido é determinada e, assim, a proteína original é identificada. - **Quantificação de Proteínas**: A intensidade dos sinais obtidos é proporcional à abundância relativa das proteínas. Métodos como **Label-Free Quantification** e técnicas de marcação isotópica (ex. iTRAQ e SILAC) são frequentemente usados para medições quantitativas. - **Estudo de Modificações Pós-Traducionais (PTMs)**: A fragmentação permite localizar sítios de modificações, como fosforilação e acetilação, em péptidos específicos, fornecendo insights sobre regulação proteica. - **Problema comum**: As proteínas mais abundantes por vezes podem mascarar o sinal das proteínas menos abundantes durante a análise por espetrometria de massa pois geram sinais mais intensos, dificultando a deteção das proteínas menos abundantes. A compreensão deste problema é crucial para a aplicação de estratégias eficazes que visam quantificar proteínas menos abundantes num meio com proteínas mais abundantes, contribuindo para uma análise proteómica mais abrangente e precisa. - **Solução**: Estratégias de **pré-fração de amostras**, como a separação de proteínas por c**romatografia líquida**, podem ser empregues para reduzir a complexidade da amostra. Além disso, técnicas de marcação isotópica, como iTRAQ, podem ser utilizadas para marcar e quantificar proteínas em diferentes condições, permitindo a comparação relativa entre amostras e a identificação de proteínas menos abundantes.  Estas técnicas geralmente são **combinadas** para maximizar a eficiência. Por exemplo, proteínas podem ser separadas por eletroforese 2D, digeridas em péptidos e identificadas por espetrometria de massa ou a cromatografia líquida é frequentemente usada para fracionar amostras antes da análise por MS, aumentando a sensibilidade e especificidade. Estas abordagens permitem estudar o proteoma de forma detalhada, ajudando a desvendar mecanismos biológicos e identificar alvos terapêuticos​. **Proteómica Bottom-up: As proteínas são primeiro digeridas em pequenos fragmentos peptídicos por meio de enzimas específicas, como a tripsina, que cliva as proteínas em locais específicos. Esses péptidos são então analisados por Espetrometria de Massa (MS) para determinar as suas sequências e, posteriormente, essas sequências são comparadas a bancos de dados de proteínas conhecidas, permitindo a identificação das proteínas originais.** - **Vantagens: Altamente sensível, permite identificar proteínas em amostras complexas e quantificar proteínas em grande escala.** - **Limitações: Perde informações sobre modificações pós-traducionais (PTMs) ou isoformas de proteínas, já que a proteína é fragmentada.** **Proteómica Top-Down: Neste método, as proteínas são analisadas intactas, i.e., sem digestão prévia. A espetrometria de massa de alta resolução é utilizada para medir diretamente a massa das proteínas e seus fragmentos após fragmentação controlada (geralmente usando técnicas como ETD - Dissociação por Transferência de Eletrões). Esta abordagem permite identificar modificações pós-traducionais (PTMs) e analisar isoformas de proteínas diretamente.** - **Vantagens: Preserva informações sobre a estrutura completa da proteína, PTMs e isoformas.** - **Limitações: Requer equipamentos de alta resolução e é menos eficiente para analisar amostras muito complexas com proteínas em baixa abundância.** **Imunoblotting:** É um método imunológico usado para detetar proteínas específicas em uma amostra complexa, que combina técnicas de eletroforese, transferência de proteínas para uma membrana e uso de anticorpos específicos para identificar e quantificar proteínas de interesse. **Western Blot:** Exemplo mais comum de imunoblotting, amplamente utilizado em pesquisas biomédicas e proteómicas. Os passos desta técnica são: 1. **Preparação da amostra**: Extração das proteínas da amostra de interesse através de lise celular (libertação das proteínas), redução (quebra das pontes dissulfeto através de agentes como o DTT) e desnaturação (utilizando detergentes como o SDS para desfazer a estrutura tridimensional das proteínas e torná-las lineares). 2. **Separação por SDS-PAGE** 3. **Transferência por membrana:** Transferir as proteínas separadas no gel para uma membrana sólida (geralmente de nitrocelulose ou PVDF) através de um campo elétrico, tornando-as acessíveis aos anticorpos. Após a transferência, a membrana contém uma réplica das proteínas separadas. 4. **Bloco da Membrana:** A membrana é incubada numa solução bloqueadora (leite desnatado ou albumina sérica bovina, BSA) para \"saturar\" as áreas livres da membrana e assim prevenir a ligação inespecífica dos anticorpos à membrana. 5. **Deteção por Anticorpos:** O anticorpo primário, específico para a proteína de interesse, liga-se diretamente ao epítopo (região específica da proteína-alvo) e o anticorpo secundário, que reconhece o primário, está ligado a uma enzima/marcador (HRP -- peroxidase de rábano por exemplo) e amplifica o sinal, permitindo assim a deteção. 6. **Revelação e análise:** Após a incubação com os anticorpos, a membrana é tratada com um substrato químico que reage com a enzima do anticorpo secundário, produzindo um sinal visível. Os métodos de deteção mais comuns são a **quimioluminescência** (emissão de luz detectada por filmes fotográficos ou sistemas digitais), a **colorimetria** (produção de um precipitado colorido visível a olho nu) e a **fluorescência** (marcadores fluorescentes detetados por scanners específicos). As **aplicações** **do Western Blot** são a **deteção de proteínas específicas** em amostras complexas, como lisados celulares, a **validação de biomarcadores** (confirma alterações na expressão de proteínas observadas em análises mais amplas, como proteómica), o **estudo de PTMs** através da utilização de anticorpos específicos para os sítios modificados e o **diagnóstico clínico**. **Vantagens e Limitações do Western Blot:** A screenshot of a computer screen Description automatically generated Estratégias para o Estudo da Fosforilação de Proteínas: 1. **iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation):** Envolve a marcação de péptidos fosforilados com tags isobáricas para quantificação relativa e absoluta. Isso é feito usando espetrometria de massa para calcular a razão de péptidos fosforilados em diferentes condições. 2. **Imunoprecipitação de Péptidos Fosforilados:** Após a marcação dos péptidos fosforilados, estes podem ser imunoprecipitados para isolamento e análise posterior por cromatografia líquida acoplada à espetrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). 3. **Análise de Pathway Metabólico:** Esta estratégia visa aumentar a compreensão dos mecanismos biológicos subjacentes à fosforilação de proteínas, permitindo a descoberta de mecanismos não revelados. 4. **Espetrometria de Massa Baseada em Proteómica de Top-Down:** Esta abordagem envolve a análise de proteínas não digeridas/inteiras, utilizando espetrómetros de massa de alta resolução, como MALDI ou Orbitrap, para identificar e quantificar proteínas fosforiladas. **Micro-arrays de Proteínas Analíticas:** Estes microarranjos são baseados em arrays de anticorpos para detetar proteínas. As proteínas podem ser detetadas por marcação direta ou usando um anticorpo de reportagem em ensaios de sanduíche. **Micro-arrays de Proteínas Funcionais:** Usados para estudar interações proteicas, incluindo ligações proteicas e reações enzima-substrato. **Micro-arrays de Proteínas de Fase Reversa:** Baseados na imobilização de diferentes amostras de lisados num mesmo chip, permitindo a comparação de múltiplas amostras em um único experimento. Tipos de Ensaios ELISA: **Deteção Direta:** O antigénio é adsorvido diretamente no fundo de um poço de microplaca, um anticorpo conjugado com uma enzima é adicionado e vai ligar-se ao antigénio. Após a lavagem para remover o anticorpo não ligado, um substrato é adicionado e a enzima ligada ao anticorpo catalisa a reação, produzindo um sinal detetável. Este tipo de ensaio ELISA é o mais rápido, mas menos rigoroso, sendo ideal para **leituras rápidas, porém com menor precisão**. **Deteção Indireta:** O antigénio é adsorvido no fundo do poço da microplaca, um anticorpo primário é adicionado e liga-se ao antigénio. Após a lavagem, um anticorpo secundário conjugado com uma enzima é adicionado e liga-se ao anticorpo primário. Após nova lavagem, um substrato é adicionado e a enzima ligada ao anticorpo secundário catalisa a reação, produzindo um sinal detetável. Este tipo **melhora a especificidade da deteção direta, aumentando a precisão, mas mantendo a rapidez.** **Sandwich:** O anticorpo de captura é adsorvido no fundo do poço da microplaca, o antigénio é então adicionado e liga-se ao anticorpo de captura. Após a lavagem, um anticorpo secundário conjugado com uma enzima é adicionado e liga-se a uma região diferente do antigénio. Após nova lavagem, um substrato é adicionado e a enzima ligada ao anticorpo secundário catalisa a reação, produzindo um sinal detetável. Este tipo de ensaio ELISA é **de 2 a 5 vezes mais sensível do que os ensaios de deteção direta ou indireta**, sendo **ideal para detetar pequenos analitos,** como lipídios, **em** **misturas complexas**, como plasma, soro ou extratos celulares. **Metabolómica:** Estudo abrangente dos metabólitos presentes em um organismo, tecido ou célula num determinado momento, que procura identificar e quantificar os metabólitos (produtos do metabolismo celular) e compreender como estas moléculas estão envolvidas em processos biológicos. - Combina técnicas analíticas avançadas, como espetrometria de massa e ressonância magnética nuclear, com métodos estatísticos e computacionais para analisar e interpretar os dados obtidos. Esta abordagem permite uma compreensão mais profunda dos processos biológicos e pode ser aplicada em áreas como medicina, biotecnologia, agricultura e pesquisa biomédica. **Tipos Análises de Metabolómica:** - **Não direcionada:** Esta abordagem é exploratória e procura investigar perfis moleculares globais num sistema biológico, sem hipóteses pré-definidas. Utiliza técnicas **como LC-MS/MS e espectrometria de massa** para capturar uma ampla gama de moléculas, proporcionando uma visão holística. É ideal para descobrir novos biomarcadores ou compreender vias metabólicas desconhecidas. - **Direcionada:** Após identificar alvos/biomarcadores através de uma análise não direcionada, a abordagem direcionada concentra-se em quantificar ou caracterizar essas moléculas específicas. É realizada com base em hipóteses e usa técnicas mais específicas, como **ELISA ou cromatografia direcionada**, para medições precisas e reprodutíveis. Esta combinação garante descobertas iniciais amplas e análises subsequentes detalhadas. - **Vias Metabólicas:** Concentra-se na compreensão e na visualização das vias metabólicas, identificando como os metabólitos interagem e são transformados ao longo de uma via metabólica específica. **Principais Técnicas da Metabolómica:** - **Ressonância Magnética Nuclear (RMN):** Técnica não destrutiva para identificar e quantificar metabólitos com base em propriedades magnéticas dos núcleos atómicos. Ideal para análise global de amostras complexas, como biofluidos e tecidos; tem menor sensibilidade comparada a LC-MS e GC-MS, mas fornece informações estruturais valiosas. - **Cromatografia Líquida (LC-MS):** Separa e identifica metabólitos com base nas suas propriedades químicas e massa. Utilizada para análises direcionadas e não direcionadas, tem alta sensibilidade e capacidade para detetar compostos com concentrações muito baixas. - **Cromatografia Gasosa (GC-MS):** Análise de metabólitos voláteis ou facilmente volatilizáveis, frequentemente usada para lipídios, ácidos gordos e açúcares. Exige derivação química de metabólitos não voláteis, aumentando a complexidade da preparação da amostra. **Nota:** A complementaridade entre estas técnicas é crucial na análise do metaboloma pois permite uma cobertura mais abrangente do mesmo, aumentando a probabilidade de identificação precisa de metabólitos e a compreensão dos processos metabólicos, e pode ajudar a validar os resultados e a fornecer uma visão mais completa do perfil metabólico de uma amostra. - **Espetroscopia de Infravermelho (IR):** Técnica que analisa a interação entre a radiação infravermelha e as moléculas, fornecendo informações sobre as ligações químicas presentes em uma substância. É usada para identificar grupos funcionais em metabólitos, o que pode ajudar na caracterização e identificação de compostos. **Biomarcadores**: São características biológicas mensuráveis que indicam processos normais, patológicos ou respostas a intervenções terapêuticas. Biomarcadores baseados em metabólitos são particularmente relevantes pois fornecem informações diretas sobre a atividade metabólica num sistema biológico. **Exemplos**: Metabólitos específicos podem ser usados para diagnosticar doenças, monitorar o progresso do tratamento ou identificar novas vias metabólicas associadas a condições patológicas. **Biofluidos**: Representam amostras biológicas como sangue, plasma, soro, urina ou saliva, amplamente utilizadas em estudos de metabolómica. - **Vantagens**: - Coleta minimamente invasiva (urina e saliva). - Representam um \"retrato dinâmico\" do metabolismo em tempo real. - **Desafios**: - Menor especificidade comparada ao tecido-alvo pois os biofluidos refletem uma mistura de metabólitos de diferentes órgãos e sistemas. - Variações ambientais e individuais podem influenciar a composição metabólica, exigindo cuidados rigorosos na padronização das amostras. A **análise de biofluidos** em conjunto com a metabolómica permite a identificação de biomarcadores robustos para diagnóstico precoce de doenças, avaliação de terapias e compreensão de mecanismos fisiopatológicos. **Limitações dos Ensaios em Proteómica**: - Alta complexidade do proteoma devido às modificações pós-traducionais (PTMs) e isoformas. - Dificuldade em detetar proteínas de baixa abundância pois proteínas altamente expressas podem mascarar o sinal. - Dependência de técnicas sensíveis, como espetrometria de massa, que requer equipamentos caros e preparação rigorosa da amostra. - Limitação na cobertura completa do proteoma em amostras complexas. **Limitações dos Ensaios em Metabolómica**: - O metaboloma é altamente dinâmico, variando em resposta a fatores ambientais, genéticos e temporais. - Ausência de uma técnica única capaz de detetar todos os metabólitos presentes em uma amostra. - Complexidade na análise de dados, exigindo softwares avançados e algoritmos de integração. Modelos preditivos: Modelos matemáticos ou estatísticos usados para prever resultados com base em dados biológicos. Algumas **métricas** utilizadas para **avaliar a precisão dos modelos** são a **sensibilidade** (capacidade de identificar os verdadeiros positivos), a **especificidade** (capacidade de evitar falsos positivos) e **AUC-ROC** (área sob a curva ROC que avalia o desempenho global do modelo)​. Os **modelos de treino** são usados para ajustar parâmetros preditivos com base em dados conhecidos. Já os **modelos de teste** validam o desempenho em dados independentes, garantindo a generalização do modelo **Pesquisa de Biomarcadores:** A **dimensão da população estudada** e a **diversidade de estados fisiopatológicos** são cruciais para a robustez dos biomarcadores. Populações maiores e heterogéneas aumentam a representatividade dos resultados. Além disso, a **validação com amostras independentes** é essencial para confirmar a aplicabilidade clínica dos biomarcadores descobertos