Production et sécurité virale des médicaments biologiques PDF

Production et sécurité virale des médicaments biologiques Pr Anne Lajoix Sabrina Cogoni, Thèse de Pharmacie, 2013  Production et sécurité virale des médicaments biologiques Introduction III. Le risque viral pour les biomédicament...

Production et sécurité virale des médicaments biologiques Pr Anne Lajoix Sabrina Cogoni, Thèse de Pharmacie, 2013  Production et sécurité virale des médicaments biologiques Introduction III. Le risque viral pour les biomédicaments 1) Les sources de contamination virale I. Les médicaments biologiques 2) Méthodes de détection des virus 1) Les protéines thérapeutiques 2.1 Détection du génome viral 1.1. Les protéines extraites 2.2 Détection des particules virales 1.2. Les protéines recombinantes 2.3 Détection par tests cellulaires in vitro 2) Les médicaments de thérapie innovante 2.4 Détection par tests in vivo 3) Evaluation de la sécurité virale II. Optimisation de la bioproduction 3.1 Contrôle du matériel source 1) Choix des lignées 3.2 Contrôle des lots de produits 2) Optimisation du vecteur recombinant 3) Amplification génique IV. Les méthodes de clairance virale 1) Méthodes d’élimination virale 2) Méthodes d’inactivation virale 3) Validation des méthodes de clairance virale 3.1 Choix des virus 3.2 Plan d’action des études de clairance virale Introduction I. Les médicaments biologiques 1) Les protéines thérapeutiques 1.1. Les protéines extraites Protéines extraites à partir de matières premières d’origine humaine (don) ou animale: Médicaments dérivés du plasma - Immunoglobulines polyclonales : anti-rhésus D, anti-lymphocytes T humains (Thymoglobuline®) - Albumine - Facteurs de coagulation: fibrinogène, facteur VIII, facteur VWB 1.1. Les protéines extraites Fractionnement du plasma 1.2. Les protéines recombinantes Protéines produites à partir de cultures de cellules humaines ou animales = protéines recombinantes 541 biomédicaments commercialisés (US et/ou UE) (- 98 retirés) LEEM, 2014 1.2. Les protéines recombinantes Momab Umab Ximab Zumab 1.2. Les protéines recombinantes  Les 20 meilleures ventes de biomédicaments Walsh, Nature Biotechnology, 2022  1.2. Les protéines recombinantes Bactéries : – Bon rendement – Coût faible – MAIS… Repliements parfois incorrects – Pas de modifications post-traductionnelles (glycosylations, ponts disulfures, …) Levures : – Bon rendement – Coût faible – Modifications post traductionnelles – MAIS… protéases actives (modification génétique des souches) 1.2. Les protéines recombinantes Glycosylation  1.2. Les protéines recombinantes Cellules d’insectes : – Haut niveau d’expression transitoire – Repliements corrects – Coût > levures et bactéries Cellules de mammifère : – Protéines complexes et glycosylées – Rendement faible – Cher  Sélection du clone producteur ADNc Vecteur recombinant Sélection des clones recombinants par antibiotique Clones stables - bactéries, levures: épisomale - cellules de mammifères: intégration de plusieurs copies dans le génome Sélection du clone producteur  1 clone producteur  Master Cell Bank  Working Cell Bank Scale up Mise au point de procédé de production à grande échelle 10 ml 10 l 20 l 50 l Culture en fed-batch Haute densité cellulaire Système disposable Upstream processing (USP) Culture en fermenteur: extensification (volume culture) intensification (nb cellules/volume) haut niveau de production/cellule 250 à 15 000l Cuve inox Cuve avec disposable Downstream processing (DSP) LFB Biomanufacturing, Alès 2) Les médicaments de thérapie innovante (MTI) Quatre catégories Les médicaments de thérapie génique Les médicaments de thérapie cellulaire somatique Les produits issus de l’ingénierie tissulaire Les médicaments combinés de thérapie innovante Règlement (CE) n° 1394/2007 du Parlement européen et du Conseil du 13 novembre 2007 concernant les médicaments de thérapie innovante et modifiant la directive 2001/83/CE ainsi que le règlement (CE) n° 726/2004 Décret n° 2012-1236 du 6 novembre 2012 relatif aux médicaments de thérapie innovante Médicaments ≠ Préparation de Thérapie Innovante Thérapie cellulaire Manipulation substantielle ou non Substantielle Non substantielle Culture cellulaire Découpage Broyage Transfert de gènes Centrifugation Séparation, concentration Modification du génome Irradiation Filtration Altération du phénotype Lyophilisation Congélation Cryoconservation Médicaments Vitrification Thérapie Innovante Préparation de Thérapie cellulaire Source: ANSM Préparation de thérapie cellulaire Autogreffes de cellules souches hématopoiétiques Sélection progéniteurs hématopoïétiques CD34+ Moelle Osseuse Congélation Réinjection au patient après chimiothérapie  Médicaments de thérapie cellulaire somatique Contient des cellules ou tissus qui ont fait l’objet d’une manipulation substantielle de façon à modifier leurs caractéristiques, ou des cellules ou tissus qui ne sont pas destinés à être utilisés pour les mêmes fonctions chez le receveur et le donneur ET Permet de traiter une maladie à travers l’action métabolique, immunologique ou pharmacologique de ces cellules ou tissus Alofisel® (Takeda et Tigenix) cellules souches mésenchymateuses allogéniques amplifiée d’origine adipeuse injection Intralésionnelle 4 x 6 ml (30 M cell) fistules périanales de la maladie Crohn Médicaments «issus de l’ingénierie cellulaire ou tissulaire » Cellules ou tissus soumis à une manipulation substantielle, de façon à obtenir des caractéristiques utiles à la régénération, à la réparation ou au remplacement recherchés ET/OU Cellules ou tissus ne sont pas destinés à être utilisés pour les mêmes fonctions chez le receveur et chez le donneur Apligraf® (Organogenesis) Médicaments de thérapie génique Substance active qui contient ou constitue un acide nucléique recombinant ET Effet thérapeutique qui dépend directement de la séquence d’acide nucléique recombinant ou du produit de l’expression génétique de cette séquence. Strimvelis® (GSK, EMA, FDA): Luxturna® (Voretigene neparvovec; retrovirus-ADA Spark Therapeutics, EMA, FDA): AAV-RPE65 Zolgensma® (Onasemnogene abeparvovec; Novartis): AAV9-SMN1 Médicaments de thérapie génique  CAR (Chimeric Antigen Receptor) T cells Kymriah® (Tisagenlecleucel) Yescarta® (Axicabtagene ciloleucel ou axi-cel) Maus et al., Blood, 2014  Sécurité virale des médicaments biologiques Introduction III. Le risque viral pour les biomédicaments 1) Les sources de contamination virale I. Les médicaments biologiques 2) Méthodes de détection des virus 1) Les protéines thérapeutiques 2.1 Détection du génome viral 1.1. Les protéines extraites 2.2 Détection des particules virales 1.2. Les protéines recombinantes 2.3 Détection par tests cellulaires in vitro 2) Les médicaments de thérapie innovante 2.4 Détection par tests in vivo 3) Evaluation de la sécurité virale II. Optimisation de la bioproduction 3.1 Contrôle du matériel source 1) Choix des lignées 3.2 Contrôle des lots de produits 2) Optimisation du vecteur recombinant 3) Amplification génique IV. Les méthodes de clairance virale 1) Méthodes d’élimination virale 2) Méthodes d’inactivation virale 3) Validation des méthodes de clairance virale 3.1 Choix des virus 3.2 Plan d’action des études de clairance virale II. Optimisation de la bioproduction Desai et al., Biotechnology Advances, 2010  1) Choix des lignées Lignées cellulaires de mammifères: CHO (S) BHK NSO (myélome murin) YB2/0 (hybridome rat) Lignées cellulaires humaines: Per C6 HEK 293 ADNc Vecteur recombinant Obtention des clones recombinants 1) Choix des lignées densité longévité 2) Optimisation du vecteur recombinant  Optimiser le vecteur σ70 2) Optimisation du vecteur recombinant  2) Optimisation du vecteur recombinant Ac entier Chaîne légère κ des Ig produite dans YB2/0 LFB Biotechnologies, Fontayne et al. 2) Optimisation du vecteur recombinant  Optimiser les codons 2) Optimisation du vecteur recombinant aa 2) Optimisation du vecteur recombinant (Kim CH et al., Gene, 1997) 3) Amplification génique CHO déficiente Milieu de culture dépourvu + en DHFR d’hypoxanthine et thymidine Méthotrexate 3) Amplification génique Détection d’une protéine taggée ClonePix Détection d’un anticorps Colonies de CHO 3) Amplification génique 1 clone producteur  Master Cell Bank  Working Cell Bank ICH Q5B: Analysis of the Expression Construct in Cells Used for Production of r-DNA Derived Protein Products: Rechercher la présence des mutations: Par séquençage du vecteur recombinant Par analyse de la protéine produite ICH Q5D: Derivation and Characterization of Cell Substrates used for Production of Biotechnological/Biological Products Source, origine, nombre génération lignées cellulaires Caractérisation du clone: nombre copies, site intégration….  Production et sécurité virale des médicaments biologiques Introduction III. Le risque viral pour les biomédicaments 1) Les sources de contamination virale I. Les médicaments biologiques 2) Méthodes de détection des virus 1) Les protéines thérapeutiques 2.1 Détection du génome viral 1.1. Les protéines extraites 2.2 Détection des particules virales 1.2. Les protéines recombinantes 2.3 Détection par tests cellulaires in vitro 2) Les médicaments de thérapie innovante 2.4 Détection par tests in vivo 3) Evaluation de la sécurité virale II. Optimisation de la bioproduction 3.1 Contrôle du matériel source 1) Choix des lignées 3.2 Contrôle des lots de produits 2) Optimisation du vecteur recombinant 3) Amplification génique IV. Les méthodes de clairance virale 1) Méthodes d’élimination virale 2) Méthodes d’inactivation virale 3) Validation des méthodes de clairance virale 3.1 Choix des virus 3.2 Plan d’action des études de clairance virale  III. Le risque viral pour les biomédicaments Virus: parasite intracellulaire obligatoire Génome: Enveloppe virale ADN simple ou double brin (facultative) ARN Capside virale Nucléocapside  Sécurité virale des médicaments biologiques Introduction Matériel source Procédé production Directive 2003/63/CE : code communautaire relatif aux médicaments à usage humain Protéines recombinantes: ICH Q5A R1: Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin Thérapie cellulaire: EMA/CHMP/410869/2006: Guideline on human cell-based medicinal products  Sécurité virale des médicaments biologiques Introduction Maîtrise de la sécurité virale Clef n°1: Clef n°3: Contrôle du Clef n°2: Clairance virale et matériel source Contrôle du validation (cellules) produit à différentes étapes III. Le risque viral pour les biomédicaments 1) Les sources de contamination virale Contamination du matériel source: Contamination au cours de la production/purification: - Réactifs biologiques - Personnel manipulateur - Equipements - Locaux Virus endogène Virus contaminant (« adventice ») 2) Méthodes de détection des virus 2.1 Détection du génome viral Par hybridation moléculaire: Sonde marquée: - radioactivité - épitope: biotin,digoxigénine (DIG) Fixation sur membrane nitrocellulose (chaleur 80°) nylon (UV) Hybridation Révélation par autoradiographie colorimétrie 2) Méthodes de détection des virus 2.1 Détection du génome viral Par (RT)-PCR: 1 seul virus/PCR Par microarray? Un panel de virus Virochip 36 000 sondes (1 500 virus) Méthode très sensible: détection nM (pM) Contaminations! Génomes très variables: faux négatifs 2) Méthodes de détection des virus 2.2 Détection des particules virales Par ELISA: antigène viral ou anticorps anti-virus Méthode très sensible: détection nM voire pM 2) Méthodes de détection des virus 2.2 Détection des particules virales Par microscopie électronique: Coloration négative avec des sels Immunosorbent electron microscopy de métaux lourds (ISEM): adsorption des particules coronavirus virales avec anticorps Par immunofluorescence: herpès virus VP22 2) Méthodes de détection des virus 2.3 Détection par tests cellulaires in vitro Virus capables de se multiplier sur des cultures de cellules:  mise en évidence du caractère infectieux Détection de l’effet cytopathogène (ECP): cellules MDCK, BHK, HEK… 2) Méthodes de détection des virus 2.4 Détection par tests in vivo Inoculation chez l’animal du produit à tester: pour les virus ne se développant pas sur lignées cellulaires  mise en évidence du caractère infectieux Plusieurs espèces animales: souris, rats, hamsters, œufs de poule  viabilité à 6 semaines Identification des virus:  analyse des antigènes viraux  détection des anticorps anti-virus: selon les espèces “Mouse, Rat & Hamster Antibody Production (MAP, RAP and HAP) tests » 3) Evaluation de la sécurité virale des biomédicaments 3.1 Contrôle du matériel source Objectif : minimiser la contamination virale - Détection des virus endogènes et contaminants - Tests spécifiques d’un virus de l’espèce d’origine - Sensibilité et spécificité adaptée - Cellules d’origine humaine: tests VIH, hépatite Tests cellulaires in vitro (au – une lignée humaine/primate) Tests in vivo (souriceaux, souris, œufs embryonnés) Production d’Ac antivirus Tests pour les rétrovirus  3) Evaluation de la sécurité virale des biomédicaments 3.1 Contrôle du matériel source Différents Tests M CB WCB EOPC Pour les rétrovirus et virus endogènes Infectivité (cellules) + - + Microscopie électronique + - + (pouvant détecter d’autres agents que les virus) Reverse Transcriptase (pas nécessaire si positif par le test + - + d’infectivité pour les rétrovirus) Autres virus - Tests spécifiques si approprié - si approprié Pour Virus Non Endogènes Test cellulaire in vitro + - + In vivo (souris, œufs…) + - + Recherche et dosage d’anticorps antivirus (habituellement pour les lignées cellulaires de + - - rongeurs) (MAP, RAP, HAP) Autres virus - Tests spécifiques + - - 3) Evaluation de la sécurité virale des biomédicaments 3.2 Contrôle des lots de produits Lots non traités (« bulk »): Constitué de plusieurs récoltes de cellules ou de milieu Tests réalisés sur un échantillon représentatif retiré du fermenteur  Résultats de 3 lots fournis dans le dossier d’AMM  Si lot contaminé: pas utilisé pour purifier le produit source de contamination? Produit purifié Tests définis en fonction des résultats obtenus lors des précédents tests  Production et sécurité virale des médicaments biologiques Introduction III. Le risque viral pour les biomédicaments 1) Les sources de contamination virale I. Les médicaments biologiques 2) Méthodes de détection des virus 1) Les protéines thérapeutiques 2.1 Détection du génome viral 1.1. Les protéines extraites 2.2 Détection des particules virales 1.2. Les protéines recombinantes 2.3 Détection par tests cellulaires in vitro 2) Les médicaments de thérapie innovante 2.4 Détection par tests in vivo 3) Evaluation de la sécurité virale II. Optimisation de la bioproduction 3.1 Contrôle du matériel source 1) Choix des lignées 3.2 Contrôle des lots de produits 2) Optimisation du vecteur recombinant 3) Amplification génique IV. Les méthodes de clairance virale 1) Méthodes d’élimination virale 2) Méthodes d’inactivation virale 3) Validation des méthodes de clairance virale 3.1 Choix des virus 3.2 Plan d’action des études de clairance virale IV. Les méthodes de clairance virale Deux stratégies de clairance virale différentes: Élimination virale Clairance virale Inactivation virale Choix de la méthode de clairance virale dépend: – de la protéine – des virus qui sont visés (virus détectés ou non)  combinaison de méthodes orthogonales IV. Les méthodes de clairance virale 1) Méthodes d’élimination virale Séparation physique des particules virales et du produit Deux types de méthodes: - chromatographies - filtration 1) Méthodes d’élimination virale Chromatographies Chromatographies échangeuse d’ions *** d’affinité *** exclusion adsorption  retenir la protéine à purifier ou les contaminants Chromatographie sur membrane:  élimination des petits virus enveloppés (Sartobind) Méthode de purification de la protéine Méthode de réduction virale: 4 à 6 log pour virus SV40 1) Méthodes d’élimination virale Nanofiltration Deux types de filtration: - ultrafiltration - nanofiltration: 15 à 35 nm  élimination des virus enveloppés et non enveloppés  pas de risques de dénaturation pour le produit IV. Les méthodes de clairance virale 2) Méthodes d’inactivation virale Destruction des particules virales sans altérer l’intégrité et l’activité biologique des protéines Techniques d’inactivation virales validées: La pasteurisation Chauffage à sec des produits lyophilisés Chauffage par la vapeur des produits lyophilisés Traitement détergent Traitement par solvant-détergent (lipides) Traitement par pH acide Traitement par caprylate 2) Méthodes d’inactivation virale Pasteurisation Chauffage de qq secondes à 55-65°C en présence de stabilisants (aa, sucres, citrate):  détruire les microorganismes  dénature protéines virales: inactive virus enveloppés (VIH, VHC, VHB) ou non (poliovirus) Pas toujours applicable aux biomédicaments sensibles à la température  LFB: albumine; Genzyme: Thymoglobuline® Lyophilisation et chauffage Protéines résistantes à la chaleur si préalablement lyophilisées Chauffage à sec: 80°C pendant 72h nécessité d’une humidité résiduelle du lyophilisat Chauffage à vapeur  inactive VIH, VHC, VHB, VHA 2) Méthodes d’inactivation virale Solvant-détergent Solvant: tri n-butyl phosphate (TNBP): 0,3% Détergent non ionique: Tween 80 ou Triton X-100: 1%  incubation à 24°C pendant 4-6 heures Action sur la membrane lipidique des virus enveloppés: VIH, VHC, VHB Inefficace sur virus non enveloppés Caprylate Perturbe la membrane et les protéines associées à la membrane des virus enveloppés (HSV, VSV…)  20°C pendant 1 heure  2) Méthodes d’inactivation virale Exemple du procédé appliqué pour un anticorps monoclonal IV. Les méthodes de clairance virale 3) Validation des méthodes de clairance virale Tests de surcharge virale réalisés à l’échelle réduite:  Réduction virale efficace : R > 4 log F. Barin, Virology 2008 3) Validation des méthodes de clairance virale 3.1 Choix des virus Virus ressemblant le plus possibles aux virus susceptibles de contaminer produit Virus avec différentes propriétés physico-chimiques  3 catégories - Virus pertinents: virus identifiés virus de la même espèce que le virus connu virus susceptibles de contaminer les cellules ou autres réactifs - Virus modèles spécifique: virus proche d’un virus connu ou potentiel (VMS) ayant les mêmes propriétés physiques et chimiques virus du même genre et de la même famille - Virus modèles non spécifiques: virus possédant des propriétés différentes des virus connus ou potentiels  pour caractériser la robustesse du procédé 3) Validation des méthodes de clairance virale 3.1 Choix des virus LFB, 2011  3) Validation des méthodes de clairance virale 3.2 Plan d’action des études de clairance virale * * Cas A Cas B Cas C Cas D Cas E STATUT VI RAL des cellules et/ou du lot non traité Présence de virus - - + + + Particules virus-like - - - - + Particules Rétrovirus-like - + - - + Virus identifié N/A + + + - Virus pathogènes pour les humains N/A - - + Inconnu ACTI ON Procédé de caractérisation de la clairance virale en utilisant un virus modèle non- Oui Oui Oui Oui Oui spécifique Procédé d’évaluation de la clairance virale en utilisant un virus pertinent ou un Non Oui Oui Oui Oui virus modèle spécifique Tests pour des virus dans le lot purifié N/A Oui Oui Oui Oui  3) Validation des méthodes de clairance virale 3.2 Plan d’action des études de clairance virale Virus dopant Virus enveloppés Virus non enveloppés utilisés VIH-1 Sindbis PRV SV 40 EMCV PPV Traitement SD ≥4,4 ≥5,4 ≥4,1 NA NA NA Nanofiltration 4,3 4,3 4,3 5,4 ≥4,8 4,3 20nm Chromatographie NT NT NT NT 1,3 5,6 échange d’ion Facteur de ≥8,7 ≥9,7 ≥8,4 5,4 ≥6,1 9,9 réduction global Tableau 1 : adapté de Facteurs de réduction (log10) d’infectiosité virale pour les étapes du procédé de fabrication de Clairyg® (Immunoglobuline) LFB NA : Non applicable ; NT: Non testé PRV (Pseudorabbies virus) EMCV : virus de l’encéphalomyocardite PPV parvovirus porcin Conclusion Complémentarité des 3 clefs de sécurité virale Diminution du risque de contamination virale