Práctica 3: Preparación de Muestras PDF

Practica 3 Preparación de muestras OBJETIVO El alumno conocerá los procesos básicos de obtención de muestras y los distintos tipos de procedimientos que se les realizan para su análisis, así como los fundamentos básicos sobre las tinciones y su uso. MATERIALES -Microscopio óptico. -Abatelenguas. -...

Practica 3 Preparación de muestras OBJETIVO El alumno conocerá los procesos básicos de obtención de muestras y los distintos tipos de procedimientos que se les realizan para su análisis, así como los fundamentos básicos sobre las tinciones y su uso. MATERIALES -Microscopio óptico. -Abatelenguas. -Portaobjetos. -Cubreobjetos. -Citospray. -Canastilla para laminillas. -Tren de tinción de Arzac. -Sanitas o servitoallas. -Guantes. -Resina sintética o bálsamo de Canadá. -Xilol para limpiar excedente del medio de montaje. Introducción. En el ámbito médico, la intersección entre la histología y la biología celular se convierte en un pilar fundamental para comprender tanto los procesos normales como las alteraciones patológicas a nivel microscópico. La exploración de células y tejidos, aunque desafiante, se beneficia de una variedad de métodos especializados, como la histoquímica, inmunocitoquímica, radioautografía, fraccionamiento celular, y técnicas in vivo, presentes en el estudio de la biología celular. La necesidad de obtener preparados permanentes, como laminillas, para la preservación de células, resalta la importancia de la técnica histológica. La habilidad para preparar tejidos para su observación microscópica se convierte en un proceso crucial, variando según el tipo de microscopio que se emplea. La complejidad de la estructura morfológica celular se ve acentuada por las modificaciones surgidas durante el proceso de fijación y tinción. Este reconocimiento de limitaciones intrínsecas impulsa a la medicina a utilizar estos recursos con cautela, conscientes de que, aunque los preparados permanentes no reproducen fielmente las condiciones originales, siguen siendo vitales para el estudio de células y tejidos. 7  El traslado de la histología a la práctica médica se ve enriquecido por la comprensión de que el análisis microscópico no es simplemente una observación estática, sino una herramienta dinámica para investigar procesos celulares y tisulares en su contexto patofisiológico. Este enfoque integral es esencial para desentrañar los misterios de las enfermedades y avanzar en el desarrollo de diagnósticos más precisos y terapias más efectivas. ¿Cuál es su importancia? Diagnóstico de enfermedades: La observación microscópica de tejidos y células permite a los patólogos identificar anomalías y cambios en la morfología celular asociados con enfermedades. Investigación de procesos patológicos: La histología proporciona una ventana única para estudiar procesos patológicos a nivel celular, como la proliferación celular descontrolada (cáncer), inflamación, degeneración y otras alteraciones morfológicas asociadas a enfermedades. Validación de hallazgos clínicos: Los estudios histológicos respaldan y validan los hallazgos clínicos, permitiendo una correlación más profunda entre los síntomas y las alteraciones estructurales subyacentes. Desarrollo de terapias personalizadas: La comprensión detallada de la biología celular contribuye al desarrollo de terapias más precisas y personalizadas, al identificar blancos terapéuticos específicos a nivel molecular. Formación médica: La enseñanza de la histología y biología celular es esencial en la formación médica para que los profesionales de la salud comprendan las bases celulares de la salud y la enfermedad. ¿Por qué se utiliza? La utilización de la histología y la biología celular en medicina se justifica por varias razones fundamentales que abarcan tanto el diagnóstico clínico como la investigación médica. n Práctica 3  Obtención de muestras, biopsias, tipos y características. La "biopsia" es un procedimiento médico en el que se extrae una pequeña muestra de tejido de un organismo vivo, para su posterior examen bajo un microscopio. Se realiza con el fin de diagnosticar la presencia de enfermedades, identificar la naturaleza de los tumores o investigar anomalías en los tejidos. Dentro de la técnica histológica, no está estrictamente considerada la obtención de tejidos, sin embargo, es importante conocer los tipos de biopsia para comprender en qué situaciones se lleva a cabo cada uno de estos. Tipos de biopsia. Martínez Grau, M., Sanchís Martínez, C., Sanchís Martínez, M. C., Martínez Martínez, A. (2021). Higiene del medio hospitalario y limpieza de material. España: Editorial Editex. n Práctica 3  Biopsia Incisional: Se toma una muestra de tejido representativo mediante la extracción de una pequeña porción de la lesión o área sospechosa con fines diagnósticos. A menudo en tejidos blandos. Ejemplo: Lesión, órgano, tumor. Biopsia Excisional: Se extrae completamente la lesión o el tejido sospechoso. Tiene fines terapéuticos y se debe dejar un margen al momento del procedimiento. Ejemplo: A menudo realizada cuando se sospecha un tumor o una masa, permitiendo una evaluación completa de la lesión. Útil en lesiones pequeñas. Biopsia incisional. (North S, Banks T. Small animal oncology. ed 1. 2009, Saunders/Elsevier) Biopsia con sacabocado: Se utiliza una herramienta cortante para extraer una muestra cilíndrica de tejido. Ejemplo: Común en áreas donde se necesita una muestra más profunda, como en la próstata o el hígado. Biopsia de la piel - Western New York Urology Associates. (s. f.). https://www.wnyurology.com/content.aspx?chunkiid=103941 n Práctica 3  Biopsia por Punción: Se utiliza una aguja fina para aspirar una pequeña muestra de tejido o líquido. Ejemplo: Usada en órganos accesibles por aguja, como la tiroides o el seno. Biopsia por Trepanación: Implica el uso de un instrumento de corte para perforar y extraer una muestra de hueso. Ejemplo: Utilizada para investigar enfermedades óseas, como tumores o infecciones. Biopsia Transoperatoria o Cielo Abierto: Se realiza durante una cirugía, extrayendo una muestra para su evaluación inmediata. Ejemplo: Orientada a obtener un diagnóstico rápido durante la cirugía para guiar las decisiones del procedimiento. Biopsia Colposcópica: Se realiza con un colposcopio, un instrumento para examinar el cuello uterino, y se toma una muestra de tejido. Ejemplo: Principalmente utilizada en la evaluación de lesiones cervicales. Biopsia por Raspado o Legrado: Se raspa o rasga la capa superficial del tejido para obtener una muestra. Ejemplo: Común en la biopsia endometrial o cervical. Biopsia por Punch: Implica el uso de un instrumento llamado "punch" o "bisturí de punch". Este instrumento tiene una pequeña cuchilla circular en el extremo, similar a una pequeña taza afilada. Se realiza una pequeña incisión circular en la piel o en la mucosa, y luego se extrae un cilindro delgado de tejido para su posterior análisis. Ejemplo: Piel, cuero cabelludo, región genital. Técnica histológica. La técnica histológica emerge como un conjunto meticuloso de procedimientos que posibilita la observación detallada de tejidos biológicos. Tiene como finalidad realizar cortes finos a tejidos gruesos para su colocación en láminas y así revelar su compleja estructura microscópica por medio de preparaciones histológicas. n Práctica 3  Técnica histológica, esquema propio (s.f.).- Comité Universitario de Divulgación e Investigación Médica. Técnica de la parafina fundida. - Fijación. Este proceso tiene como objetivo interrumpir los procesos biológicos naturales que suceden después de la extracción del tejido, evitando así la autólisis, descomposición y cambios estructurales indeseados. En esta fase de la técnica histológica, los fijadores reaccionan con los grupos amino, formando enlaces entrecruzados en los extremos de las moléculas. Este mecanismo evita la desnaturalización y descomposición de las estructuras celulares. Con la acción de los fijadores, el tejido experimenta un aumento en su rigidez, se inhiben las proteasas, se detiene el metabolismo celular y se erradican microorganismos no deseados. Este proceso de fijación contribuye no solo a la preservación de la estructura original del tejido, sino también a la creación de un entorno propicio para los pasos subsiguientes de la técnica histológica. - Deshidratación. El objetivo es eliminar el agua presente en los tejidos y sustituirla con compuestos hidrofóbicos, con el fin de poder crear las condiciones óptimas para la posterior inclusión en medios tales como la parafina. Este proceso se lleva a cabo mediante la sustitución gradual del agua por alcohol, utilizando una serie de soluciones de etanol de concentración creciente. Mediante el proceso de difusión, se permite que el alcohol reemplace gradualmente el agua en los tejidos. Además de eliminar el agua, este proceso también cumple con la función de eliminar el formaldehído, un agente fijador utilizado previamente. n Práctica 3  Este paso adquiere relevancia, ya que sienta las bases para la introducción de una sustancia altamente hidrófoba: la parafina, que conocerás más adelante, se mezclará con los tejidos previamente deshidratados, permitiendo una infiltración adecuada. Técnica histológica. Elysium. (s. f.). Elysium. https://elysiumbham.wixsite.com/elysium/tecnica-histologica-y-microscopia - Aclaramiento. Se busca reemplazar el alcohol (etanol) con un compuesto químico miscible con grasas, preparando así las muestras para la inclusión en parafina. Para eliminar el etanol, se emplea típicamente el xileno o xilol, ya que este solvente es soluble con el etanol y con la parafina. Es importante destacar que la parafina (una sustancia que se volverá prominente en las siguientes etapas) es una cera y, por lo tanto, hidrofóbica, similar a las utilizadas en la fabricación de velas. - Inclusión. Se enfoca en transformar la muestra de una consistencia gelatinosa y blanda a una más sólida. Este proceso es crucial para la posterior obtención de cortes finos y precisos en las secciones de tejido. Para lograrlo, el tejido se sumerge en parafina caliente a 60 grados Celsius. La parafina en estado líquido penetra los espacios intercelulares de la muestra. Al enfriarse se solidifica, creando un bloque que encapsula la muestra en su interior. Es crucial señalar que la deshidratación previa con etanol y el aclaramiento con xileno son pasos fundamentales para preparar la muestra para la inclusión en parafina. Si la parafina se agrega directamente al tejido después de la fijación, no se lograría una unión efectiva debido a la presencia de agua en las células. Esto se debe a que, como se sabe, agua y grasa no son compatibles. n Práctica 3  Pombal, M. M. P. M. M. Á. (s. f.). Técnicas hitológicas. 4. Corte. Microtomo de parafina. Atlas de Histología Vegetal y animal. https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/4- mparafina.php - Microtomía. El bloque sólido que contiene la muestra biológica se corta en secciones delgadas utilizando un equipo especializado conocido como microtomo. Una cuchilla de diamante se desplaza a través del bloque de parafina, generando cortes extremadamente finos. Estos cortes, que pueden tener un grosor variable según la configuración del microtomo (1-50 micras), se sumergen luego en un baño de flotación con agua a 45°C. La finalidad de este paso es extender y desplegar los cortes de manera uniforme, preparándose para ser transferidos a portaobjetos. La razón detrás de la delgadez específica de los cortes reside en la necesidad de permitir que la luz del microscopio atraviese la muestra de manera eficiente. La fina sección proporciona una visión nítida y detallada de las estructuras celulares y tisulares, facilitando así la observación microscópica y la interpretación precisa de los resultados histológicos. Myr. (2023, 24 noviembre). Microtomo rotacional semiautomático M-240 | MYR. Myr | Especialidades Médicas Myr, S.L. https://myr.com.es/index.php/productos/microtomo- rotacional-semiautomatico-m-240 n Práctica 3  Técnica de congelación. Es un enfoque alternativo en histología que se utiliza para preparar muestras de tejido para su observación microscópica. A diferencia de la técnica de inclusión en parafina, que implica la creación de bloques sólidos, la congelación se centra en mantener la muestra en un estado congelado para permitir cortes finos y rápidos. Después de la fijación y deshidratación, la muestra se sumerge en una solución crioprotectora que ayuda a preservar la estructura celular durante el proceso de congelación. La rapidez en el proceso ayuda a evitar la formación de cristales de hielo grandes, que podrían dañar las estructuras celulares. Corte en Criostato: El tejido congelado se coloca en un instrumento llamado criostato, que mantiene la muestra a temperaturas muy bajas mientras se realiza el corte. Se obtienen secciones muy finas de tejido, de 5 a 20 micras. Montaje de Secciones: Las secciones cortadas se transfieren a portaobjetos y se pueden teñir directamente sin necesidad de pasar por procesos de desparafinado y rehidratación, como en la técnica de inclusión en parafina. Kalstein. (2023, 16 mayo). ¿Qué es un criostato? Kalstein. https://kalstein.com.mx/que- es-un-criostato/ n Práctica 3  Técnica citológica (por pasos). La técnica citológica comprende una serie de pasos en los cuales, a partir de células obtenidas de las mucosas de diversas cavidades del ser humano, como la boca, el ano, la vagina, entre otras, se lleva a cabo un análisis microscópico. El propósito de este análisis es examinar la estructura, función y características de estas células, con el fin de detectar posibles anomalías y lograr un diagnóstico preciso. Recolección de muestra: La obtención de muestra puede ser mediante una biopsia (extracción de tejidos o células de un organismo vivo) o una necropsia (extracción de tejidos o células de un organismo muerto). Extensión de la muestra (frotis): Existen diferentes maneras en la que se puede extender una muestra en un portaobjetos. Extensión por barrido o deslizamiento: Se coloca una pequeña cantidad de muestra en el centro del portaobjetos y después se utiliza el extremo de otro portaobjetos para extender la muestra por medio de un barrido. Extensión con hisopo: Se coloca una pequeña cantidad de muestra en el centro del portaobjetos y después se extiende la muestra. Técnica de impronta o sello: Se coloca una pequeña cantidad de muestra en el centro del portaobjetos, después se va a presionar ligeramente con otro portaobjetos. Universidad Autónoma de Baja California. (s. f.). Tinción de Hematoxilina- Eosina (HE). peces.ens.uabc.mx. http://peces.ens.uabc.mx/bcym/practica/TincionHE.html Fijación. La fijación de muestras citológicas es un paso crítico que debe llevarse a cabo de manera inmediata tras la obtención del frotis. Su función principal es prevenir la citólisis, es decir, la descomposición de los tejidos. La fijación logra inmovilizar las estructuras celulares de manera que se asemeje lo más posible a su estado original, evitando cambios autolíticos y el crecimiento bacteriano. Este proceso induce la muerte celular súbita y es esencial para preservar la integridad de las células y facilitar su estudio. n Práctica 3  Los fijadores pueden clasificarse en dos categorías: Físicos y químicos, cada uno con sus propias variantes. Fijadores Físicos: Calor: Se emplea un mechero, comúnmente utilizado en bacteriología. Frío: La fijación a bajas temperaturas también es una opción. Fijadores Químicos: Aldehídos: Estos compuestos reaccionan con los grupos amino, estableciendo enlaces cruzados con proteínas y coagulando las proteínas tisulares. Oxidantes: Ejemplificado por el tetraóxido de osmio, este fijador forma enlaces cruzados con proteínas y precipita los lípidos no saturados, siendo especialmente útil en microscopía electrónica. Desnaturalizantes de Proteínas: Involucran interacciones iónicas con moléculas de agua. Ácido acético, alcohol metílico, alcohol etílico y acetona son ejemplos de sustancias que pueden usarse solas o en combinación. Variantes modernas incluyen alcohol absoluto, alcohol-éter en partes iguales y alcohol-cetona en partes iguales. En la actualidad, el Citospray, compuesto por PVP, vehículo y propelente, ha ganado popularidad como fijador debido a su practicidad y seguridad. La elección del fijador dependerá del tipo de muestra y del análisis que se llevará a cabo. Es crucial comprender la importancia de este proceso, ya que una fijación adecuada garantiza la preservación óptima de las células y estructuras tisulares, permitiendo una interpretación precisa en estudios citológicos. Tinción: Los tejidos se someten a la aplicación de colorantes con el propósito de realzar el contraste natural y destacar de manera más evidente los distintos componentes celulares, tisulares y cualquier material extrínseco presente. Esta técnica desempeña un papel crucial al permitir una visualización más clara y detallada de las estructuras bajo observación. La mayoría de los colorantes utilizados se encuentran en forma de soluciones acuosas, aunque algunos también se emplean en soluciones alcohólicas. Esta diversidad en los solventes se selecciona según las propiedades específicas de los colorantes y la naturaleza de las muestras, asegurando una interacción óptima para la revelación precisa de detalles celulares y tisulares. n Práctica 3  Clasificación de Técnicas de Tinción: Vitales y Supravitales: Vitales: Estas técnicas se aplican en material biológico vivo sin provocar la muerte celular. El azul de metileno y el rojo neutro son ejemplos destacados. Al emplear estos colorantes, es posible observar las células en su estado natural, revelando procesos fisiológicos y estructuras celulares sin alteraciones significativas. Supravitales: En contraste, las técnicas supravitales se utilizan después de fijar el material biológico, una vez que las células ya han perdido su vitalidad. A pesar de esto, estas técnicas tiñen estructuras que persisten únicamente en células vivas, gracias a la fijación que conserva estas características. El moreno de Bismarck es un ejemplo representativo de la técnica supravital. Mecanismo de Aplicación del Colorante: Directas: En este tipo de tinción, el colorante se aplica directamente sobre la muestra sin requerir tratamientos previos. La simplicidad de estas técnicas hace que sean ampliamente utilizadas para visualizar estructuras celulares específicas de manera rápida. Un ejemplo común es la tinción con cristal violeta para resaltar la pared celular en bacterias. Indirectas: Antes de la tinción, el tejido se trata con un mordiente que ayuda a fijar el colorante, mejorando la adhesión y estabilidad de la tinción. La tinción de Gram es un ejemplo emblemático de técnica indirecta, donde el mordiente permite la clasificación de bacterias en Gram-positivas o Gram-negativas. Progresivas: Estas técnicas involucran la aplicación secuencial de varios colorantes en tiempos sucesivos. Cada colorante tiñe estructuras específicas, permitiendo una visualización detallada y diferenciada de diferentes componentes celulares. La tinción de hematoxilina y eosina en histología es un ejemplo de técnica progresiva. Regresivas: En contraste, las técnicas regresivas comienzan con un sobretinte intenso que se decolora progresivamente hasta alcanzar el contraste deseado. La tinción de Feulgen para la identificación de ADN es un ejemplo de técnica regresiva. Selectividad de la Tinción: Pancromáticas: Utilizando un solo colorante, estas técnicas generan diferentes tonos en los distintos componentes celulares. La tinción con azul de toluidina es un ejemplo de técnica pancromática que permite la visualización general de estructuras celulares. Totales: En este caso, todo el tejido se tiñe del mismo color. La tinción con eosina y azul de metileno es un ejemplo de técnica total, empleada comúnmente en histología. n Práctica 3  Tipos Especiales: Fluorescentes: Estos colorantes emiten fluorescencia al ser excitados por luz ultravioleta, resaltando regiones celulares específicas. La tinción con DAPI para la visualización de núcleos celulares en microscopía de fluorescencia es un ejemplo de técnica fluorescente. Negativas: En este tipo de tinción, el colorante resalta más el fondo que la muestra, siendo útil en microbiología para destacar la presencia de microorganismos. La tinción de tinta china es un ejemplo de técnica negativa. Principios Básicos de Tinción: La afinidad entre colorantes ionizables (ácidos o básicos) y las proteínas celulares de carga opuesta es crucial. Los ácidos (acidófilos) se unen a componentes básicos, mientras que los básicos (basófilos) tienen afinidad por ácidos. Este fenómeno está intrínsecamente ligado al pH relativo del entorno. Origen de los Colorantes: Los colorantes pueden clasificarse según su origen: Naturales: Provenientes de fuentes animales o vegetales, como la hematoxilina extraída de la madera de un árbol. Artificiales sintéticos: Elaborados en laboratorios mediante procesos químicos, como el cristal violeta. Indiferenciados: Colorantes que no poseen características ácidas ni básicas, como el azul de toluidina. n Práctica 3  Montaje: Representa la fase conclusiva en la preparación de muestras destinadas a la observación microscópica. Este procedimiento asegura la estabilidad de la muestra, previene la deshidratación y facilita la transmisión de la luz. La muestra montada se dispone sobre un portaobjetos y se cubre con una lámina de vidrio delgada, la cual se sella para resguardarla contra contaminantes. Dos opciones comúnmente empleadas son el "Bálsamo del Canadá" y la "Resina sintética". Bálsamo del Canadá: Es una oleorresina extraída de la corteza de ciertas variedades de abeto presentes en la mitad oriental de Canadá, característica por su transparencia en capas delgadas. Este material se adhiere de manera firme al vidrio y alcanza una consistencia muy dura sin granulación apreciable. Además, es altamente soluble en xileno, facilitando su manipulación. Resina sintética, solubilizada al 60% en xileno, se posiciona como otra opción valiosa. Esta resina, al ser soluble en xileno, ofrece una solución práctica para el montaje, asegurando una correcta fijación de la muestra al portaobjetos. Su versatilidad y capacidad de disolución en xileno contribuyen a simplificar el proceso de preparación de muestras para observación microscópica. n Práctica 3  Pombal, M. (s. f.-a). Técnicas. ampliaciones. tabla de colorantes. Atlas de Histología vegetal y animal. https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/ampliaciones/tabla- colorantes.php n Práctica 3  PRÁCTICA Paso 1: Obtención de la muestra. Utilizando un abatelenguas o una laminilla portaobjetos, se toma una muestra de células del carrillo o del labio inferior de un alumno voluntario por equipo. Paso 2: Realización del frotis por deslizamiento. Con el abatelenguas o la laminilla que contiene la muestra, se realiza un frotis por deslizamiento inclinando aproximadamente 45°, tal como se ilustra en las fotografías 2.1 y 2.2. Paso 3: Fijación de la muestra. Se procede a fijar la muestra con citospray. El rocío se aplica de manera uniforme a una distancia de aproximadamente 15 a 20 cm, cubriendo toda la muestra según se visualiza en la Fotografía 2.3. Paso 4: Tinción siguiendo el tren de tinción de Arzac. Paso 5: Montaje con resina sintética. Se aplica una o dos gotas de resina sintética en sentido longitudinal de la muestra. Luego, se coloca el cubreobjetos en la laminilla, asegurándose de evitar la formación de burbujas. n Práctica 3  Paso 6: Limpieza del exceso de resina y colorante. Antes de la observación al microscopio, se limpia cualquier exceso de resina y colorante utilizando un algodón humedecido en xilol para evitar manchar la platina. Paso 7: Observación al microscopio. Se procede a la observación al microscopio (ver Fotografía 2.5), donde las células teñidas y fijadas previamente pueden ser visualizadas con mayor detalle. Este protocolo garantiza la obtención de resultados claros y detallados durante el proceso de observación microscópica. n Práctica 3