Procesamiento de Muestras Animales para Estudio Anatomopatológico PDF

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS ANIMALES PARA SU ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO Parte 1 INTRODUCCIÓN Entre las técnicas de laboratorio especiales se encuentran los estudios anatomopatológicos. Se basan en técnicas histológicas que estudian los tejidos y técnicas citológicas para estudiar las...

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS ANIMALES PARA SU ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO Parte 1 INTRODUCCIÓN Entre las técnicas de laboratorio especiales se encuentran los estudios anatomopatológicos. Se basan en técnicas histológicas que estudian los tejidos y técnicas citológicas para estudiar las células. Se trata de estudios que requieren del uso del microscopio y por tanto permiten llegar más allá del ojo clínico y van a revelar mucha información. En esta unidad se explicarán las dis@ntas técnicas empleadas y el procesamiento de las muestras. TIPOS DE MUESTRAS PARA EL ESTUDIO Biopsia: estudio microscópico de un pequeño trozo de tejido obtenido por extracción o punción sobre el animal vivo. ANATOMO-PATOLÓGICO Excisional, incisional, endoscópicas, ;po punch, PAFF… Citología: estudio celular de una muestra obtenida a par;r de un raspado o hisopo. Autopsia: a realizar en cadáver. Técnicas especiales: histoquimíca, inmunohistoquímica, molecular. MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS. BIOPSIA La palabra biopsia es compuesta y procede del griego bio, vida, y opsia, ver. Es el procedimiento diagnóstico basado en la extracción de una muestra de tejido para su posterior examen microscópico. Las biopsias pueden ser: Excisionales (extirpación completa de un órgano o un tumor). Incisionales (extirpación parcial de un órgano o tumor). Endoscópicas: De tipo “punch” (sacabocados). De aguja fina (PAAF). De aguja gruesa (tru-cut o corebiopsia, mediante pistola automática). MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS. BIOPSIA Supone la extirpación del tejido a analizar (lesión, tumor...) en un solo tiempo mediante una excisión o ablación. Suele incluirse tejido normal sano adyacente para tener un margen de seguridad. Se utiliza cuando las muestras EXCISIONAL son pequeñas. Suele usarse en lesiones grandes donde se extirpa únicamente una porción de ésta. También se usa para el estudio de procesos inflamatorios y úlceras en INCISIONAL piel. MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS. BIOPSIA Se realiza accediendo desde un orificio del cuerpo de animal o mediante una pequeña incisión quirúrgica, con un endoscopio. El endoscopio es un instrumento en forma de tubo flexible que cuenta con un sistema de luz y de visualización que observar las lesiones de órganos huecos o cavidades corporales. En el extremo ENDOSCÓPICA lleva unas pinzas con las que se realiza la extirpación de fragmentos de tejido. Llamada también biopsia por perforación. Se realiza con el sacabocados. Se trata de una cuchilla cilíndrica hueca que obtiene un cilindro de tejido de 2 a 4 milímetros. PUNCH MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS. BIOPSIA PUNCIÓN-ASPIRACIÓN CON AGUJA FINA Consiste en la punción con una aguja de escaso calibre conectada a una jeringa PAAF y la realización de una aspiración enérgica MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS. BIOPSIA BIOPSIA PUNCIÓN CON AGUJA GRUESA Recibe el nombre de core biopsia o tru-cut. Para la obtención de la muestra se recurre a pistolas automáticas. Para ello, mediante palpación o guiado por pruebas de imagen se coloca la BAG aguja en posición de predisparo. A continuación se presiona el disparador y la parte interior de la aguja, succiona el tejido al proyectarse y atravesar la lesión. MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS. CITOLOGÍA Consiste en el estudio microscópico de las células (estudio citológico). Podemos usar distintas técnicas para su obtención. Impronta. Raspado. Frotis. Punción-Aspiración con aguja fina (PAAF). MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS. CITOLOGÍA. IMPRONTA Esta técnica consiste en improntar un portaobjetos sobre el tejido lesionado. Al apoyar las células desprendidas de la lesión se adhieren al porta. La impronta se puede aplicar sobre fragmentos de tejido obtenidos por biopsia o bien en lesiones externas, en animales vivos. Cuando se usa en lesiones externas se realizarán de modo rutinario dos improntas. En la primera apoyaremos ligeramente el porta sobre la zona afectada, antes de lavar la lesión. Para realizar la segunda realizaremos un lavado de la lesión con una gasa y suero fisiológico, posteriormente reavivaremos la lesión mediante raspado con una cuchilla de bisturí, secaremos con material absorbente, y a continuación apoyaremos el porta sobre la zona a improntar. MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS. CITOLOGÍA. RASPADO Consiste en la aplicación de una hoja de bisturí sobre la superficie de la lesión. MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS. CITOLOGÍA. FROTIS Consiste en la obtención de la muestra mediante aplicación de un hisopo o bastoncillo de algodón al deslizarlo suavemente sobre una superficie orgánica. Es conveniente humedecer el hisopo en suero fisiológico para no dañar las células obtenidas. La muestra se depositará sobre un porta aplicando movimientos de rotación, sin ejercer mucha presión y sin pasar dos veces por el mismo sitio. Esta técnica se usa en citología vaginal, del conducto auditivo... y en zonas donde no es posible realizar improntas o raspados. MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS. CITOLOGÍA. PAAF La PAAF consiste en la obtención de material proveniente de una masa neoformada, de un órgano o de una cavidad. Para el caso de masas externas o lesiones vésicopustulares de piel, debe interpretarse como el método diagnóstico de elección. Suelen utilizarse agujas de calibre 22 y jeringas de 10 cc. No es necesaria anestesia y simplemente con una buena sujeción del animal es posible realizarla. Para muestras subcutáneas, bastará con limpiar la zona de piel con alcohol. Cuando vayamos a recoger por punción de la cavidad abdominal, cavidad torácica o articulaciones, la zona de piel deberá prepararse como un campo quirúrgico. MÉTODOS Y TÉCNICAS PARA LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS. CITOLOGÍA. PAAF A continuación y a modo esquemático se muestran las distintas etapas de una PAAF: 1) Se introduce la jeringa con la aguja acoplada en la zona de punción. 2) Aspirar reiteradamente en forma de tridente, sin retirar totalmente la jeringa con la aguja. Evitar la contaminación del material aspirado con sangre. 3) Retirar del nódulo la jeringa con la aguja acoplada. 4) Desacoplar. 5) Tomar aire con la jeringa. 6) Acoplar nuevamente y hacer presión a fin de eliminar el material obtenido en la aguja. Se depositará en forma de gota sobre un portaobjetos limpio y desengrasado. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIO HISTOLÓGICO. Comprende de: Obtención del material histológico para estudiar. Fijación. Lavado. Deshidratación. Aclaramiento. Infiltración. Inclusión. Corte. Tinción. Observación. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIO HISTOLÓGICO. Obtención de la muestra La obtención de la muestra para su estudio histológico se realiza mediante alguna de las técnicas de biopsia descritas en el punto anterior. La toma de muestra debe considerar tejido representativo, en cantidad y condiciones adecuadas. Se debe fijar inmediatamente la muestra tras su extracción, preferentemente en formol al 10% (1 parte de formol comercial en 10 de agua). El fiador debe cubrir la totalidad de la muestra. La muestra se introducirá en un bote hermético, de boca ancha y preferiblemente de plástico. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIO HISTOLÓGICO. Fijación Cuando extraemos un tejido del animal comienzan procesos de degradación, por acción enzimática intracelular (autolisis) y bacteriana (putrefacción). Es necesario mantener las estructuras celulares y moleculares inalterables durante el procesamiento posterior. Para ello se fijará la muestra con una solución líquida. Cuando la muestra sea sensible a la fijación química y pueda verse alterada se puede utilizar la congelación rápida. No existe un fijador universal. Usaremos distintos tipos dependiendo de las características que vayamos a estudiar. Los de uso más frecuente son los fijadores químicos. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIO HISTOLÓGICO. Fijación FIJADORES SIMPLES: Etanol, metanol, acetona, ácido acético, ácido pícrico, formaldehído. MEZCLAS FIJADORAS: Líquido de Bouin, carnoy, mezclas con formaldehído. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIO HISTOLÓGICO. Lavado, deshidratación, aclaramiento. LAVADO: Una vez realizada la fijación se debe lavar el tejido a fin de quitar el exceso de fijador. El exceso de fijador puede afectar a los pasos posteriores. DESHIDRATACIÓN: La deshidratación se realiza empleando diferentes soluciones de alcohol de concentración creciente. ACLARAMIENTO: El alcohol será sustituido por un disolvente de parafina. El más usado es el xilol, porque penetra bien, ya que la muestra está deshidratada. El tejido pierde color y adquiere un tono acaramelado. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIO HISTOLÓGICO. Lavado, deshidratación, aclaramiento. INFILTRACIÓN: La muestra se coloca en parafina líquida para técnica histológica. Tanto la deshidratación, como aclaramiento e infiltración pueden ser realizadas manualmente pero actualmente se realizan de modo automático en máquinas específicas. INCLUSIÓN: Tiene como finalidad proporcionar al tejido un soporte sólido que posibilite realizar un corte muy fino. En esta etapa tiene lugar la solidificación de las sustancias infiltradas CORTE: Para poder observar la muestra histológica al microscopio es imprescindible obtener una sección muy fina, de entre pocos nanómetros hasta unos centenares de micras como máximo. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIO HISTOLÓGICO. Lavado, deshidratación, aclaramiento. La muestra resultante es por lo general un tejido incoloro. Para poder apreciarla al microscopio necesitamos realizar una tinción que facilite la delimitación celular y la discriminación entre diferentes tejidos. Las técnicas de tinción más comunes se dividen en las siguientes categorías: Tinciones generales. Aquellas que se basan en sustancias coloreadas que se unen a componentes tisulares por afinidad química. Inmunocitoquímica. Son técnicas histológicas basadas en la alta especificidad de unión de los anticuerpos a los antígenos contra los que se produjeron. Hibridación. Son técnicas basadas en la unión complementaria de las bases de ácidos nucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo, y de la guanina con al citosina). PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA ESTUDIO HISTOLÓGICO. OBSERVACIÓN: Para poder observar la muestra procesada necesitamos recurrir a algún instrumento que aumente la imagen con suficiente resolución para ser percibida por el ojo humano. También llamado microscopio de campo claro. Utiliza la luz visible y lentes de cristal que permiten un aumento de las muestras de unas 1000 veces, con un poder de resolución de unos 0,2 micrómetros. Esto es la máxima resolución que permite la luz visible, por sus propiedades de onda. Se usan para observaciones generales, características celulares y tisulares, y están presentes en todos los laboratorios de histología. Gracias por su atención