TD3 Préparation des échantillons pour l'observation microscopique à champ clair 2024 PDF

TD3: préparation des échantillons pour l’observation en microscopie à champ clair Vanessa DEHENNAUT Laboratoire : UMR CANTHER Cité scientifique Institut ONCOLILLE Bât SN4, porte 103...

TD3: préparation des échantillons pour l’observation en microscopie à champ clair Vanessa DEHENNAUT Laboratoire : UMR CANTHER Cité scientifique Institut ONCOLILLE Bât SN4, porte 103 Campus CHRU 03 20 43 44 56 [email protected] MOODLE : TD BC1 gp V.DEHENNAUT Clé d’inscription rapide : kzrcgk 1 Préparation de l’échantillon pour l’observation en MP Observation de cellules au sein d’un tissu = TECHNIQUES HISTOLOGIQUES 1) Fixation 2) déshydratation 3) Inclusion 4) Coupes 5) Coloration Nécessité de coupes ! 2  1) Fixation But : Conserver l’échantillon dans un état aussi voisin que possible de l’état vivant tout en le rendant imputrescible. GLUTARALDEHYDE Méthodes physiques: Congélation (-20 °C), fixation à la chaleur (frottis) Méthodes chimiques: Fixateurs : formol, glutaraldéhyde, acide acétique, acide picrique…. Créer des pontages entre les protéines  stabilisation des structures 3  2) Déshydration But : Remplacer l’eau contenu dans l’échantillon par un solvant compatible avec le milieu utilisé pour l’inclusion 4  3) Inclusion But : Durcir l’échantillon et l’inclure dans un milieu solide afin de pouvoir ensuite le couper Inclusion dans résine liquide = paraffine => réalisation d’un bloc 5  PREPARATION DES MOULES D’INCLUSION 6 A. Pourtier-M, USTL-1  COULAGE DE LA PARAFFINE 7 A. Pourtier-M, USTL-1  DEPOT DANS LA PARAFFINE MOULEE MAIS NON FIGEE 8 A. Pourtier-M, USTL-1  DEMOULAGE DU BLOC FIGE 9 A. Pourtier-M, USTL-1  BLOC PRÊT A ETRE TAILLE 10 A. Pourtier-M, USTL-1  4) Coupes But : coupes du spécimen en sections suffisamment fines pour que les photons ou les électrons puissent les traverser Coupes fines : 3-10 µM MICROTOME 11  II.3 coupe Support pour le microtome ELIMINATION DE L’EXCES DE PARAFFINE AUTOUR DE L’ECHANTILLON 12 A. Pourtier-M, USTL-1  BLOC PRÊT A ETRE COLLE SUR LE SUPPORT 13 A. Pourtier-M, USTL-1  COLLAGE DU BLOC SUR LE SUPPORT PAR APPORT DE PARAFFINE LIQUIDE 14 A. Pourtier-M, USTL-1  BLOC POSE SUR LE MICROTOME 15 A. Pourtier-M, USTL-1  APRES CHAQUE COUPE LE BLOC AVANCE DE 7 MICROMETRES ET LA COUPE SE COLLE A LA PRECEDENTE POUR FORMER UN RUBAN 16 A. Pourtier-M, USTL-1  LE RUBAN EST DIVISE EN GROUPES D’UNE DIZAINE DE COUPES 17 A. Pourtier-M, USTL-1  CHAQUE MORCEAU DE RUBAN EST DEPOSE SUR UNE LAME HUMIDE A HAUT POUVOIR ADHESIF 18 A. Pourtier-M, USTL-1  LE RUBAN FLOTTE SUR LE FILM D’EAU, MAIS IL RESTE PLISSE 19 A. Pourtier-M, USTL-1  LES LAMES SONT POSEES SUR UNE PLATINE CHAUFFANTE : LES RUBANS SE DEPLISSENT 20 A. Pourtier-M, USTL-1  APRES ELIMINATION DE L’EAU EXCEDENTAIRE, LES LAMES SONT MISES A SECHER PENDANT AU MOINS 48 HEURES 21 A. Pourtier-M, USTL-1  5) Coloration But : Rendre visible certaines structures Colorations topographiques, réactions cytochimiques, utilisation de fluorochromes = Affinités de certaines molécules colorées pour certaines structures cellulaires Ex: acide et basique: cf coloration MGG TP1 frottis sanguin 22  Principe de la double coloration au May Grünwald Giemsa (MGG) 1) Fixation et coloration au May-Grünwald - dissous dans le méthanol  Fixation - 1 colorant acide (= éosine) + 1 colorant basique (=bleu de méthylène) 2) Coloration au Giemsa - 1 colorant acide (= éosine) + 1 colorant basique (=azur de méthylène) Affinités sélectives pour les colorants selon les structures cellulaires Affinités tinctoriales Coloration Structure cellulaire la basophilie : les éléments acides retiendront - Cytoplasme des monocytes et des plaquettes bleu violette ainsi le bleu de méthylène - Granulations des basophiles l'acidophilie ou éosinophilie : les éléments - Cytoplasme des hématies et des granulocytes rose orangé basiques vont retenir l'éosine - Granulations des éosinophiles - Noyaux des cellules (40 % acides nucléiques- la neutrophilie : les colorants acide et basique rose/violacé 60 % protéines basiques) sont retenus l'un et l'autre - Granulation des neutrophiles - Fines granulations des monocytes et des l'azurophilie : l'azur de méthylène (bleu) est rouge (métachromasie *) plaquettes retenu par les éléments cellulaires azurophiles 23 * Qualifie la modification de couleur d'un colorant en se fixant sur une structure cytologique ou histologique.  5) Coloration, contraste But : Rendre visible certaines structures Coloration topographique, réactions cytochimiques, utilisation de fluorochromes = Affinités de certaines molécules colorées Les techniques cytochimiques permettent de pour certaines structures cellulaires visualiser spécifiquement un composant cellulaire sur la base de ses propriétés chimiques Ex: acide et basique: cf coloration MGG TP1 frottis sanguin Une réaction cytochimique engendre la formation d’un produit coloré à l’endroit de la réaction chimique Ex: mise en évidence de l’ADN par la réaction de Feulgen mise en évidence des polysaccharides par la technique APS 24  Mise en évidence des polysaccharides par la technique APS (Acide Périodique - Schiff) Acide Périodique : hydrolyse les liaisons a-glycol (fonctions alcool) des polysaccharides (ex: glycogène, amidon, cellulose) => libération de groupements aldéhydiques glycogène Réactif de Schiff: fixe les groupements aldéhydiques => coloration rouge 25 Mise en évidence de l’ADN par la réaction de Feulgen 26  Mise en évidence de l’ADN par la réaction de Feulgen Acide Chlorhydrique : hydrolyse ménagée de l’ADN à 60° => hydrolyse des bases puriques de l’ADN (A,G) => obtention d’acides apurinique avec fonction aldéhyde libre Réaction avec le réactif de Schiff => précipité rouge 27 EXERCICE 28  Mise en évidence de l’ADN par la réaction de Feulgen Comment être certain que la coloration est bien due à la présence d’ADN et non à la présence de fonctions aldéhydiques autres ? Nécessité de contrôle ! 2 réactions en parallèle ▪ Coupe avec Feulgen complet => coloration ▪ Coupe contrôle : Schiff mais pas HCl Si coloration: on a mis en Si pas de coloration : évidence des molécules non on a bien mis en évidence issues de l’ADN que de l’ADN 29  Mise en évidence de l’ADN par la réaction de Feulgen Comment être certain que la coloration est bien due à la présence d’ADN et non à la présence de fonctions aldéhydiques autres ? Nécessité de contrôle ! Réaction contrôle : traiter la coupe avec une DNAse avant de réaliser la coloration de feulgen 2 réactions en parallèle ▪ Coupe avec feulgen => coloration ▪ Coupe contrôle avec DNAse +feulgen Si coloration: on a mis en Si pas de coloration : évidence des molécules non on a bien mis en issues de l’ADN évidence que de l’ADN 30 Mise en évidence des polysaccharides par la technique APS (Acide Périodique - Schiff) Comment être certain que la coloration est bien due à la présence de polysaccharides et non à la présence de fonctions aldéhydiques autres ? Nécessité de contrôle ! 2 réactions en parallèle) ▪ Coupe avec AP + S => coloration ▪ Coupe contrôle : Schiff sans AP Si pas de coloration : Si coloration: on a mis en on a bien mis en évidence que évidence des molécules non de la cellulose issues de la cellulose 31