Prueba 2 PDF - Microbiología I

Microbiología I (2159) 11 4. PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA Confección de preparados para observación en fresco: técnica de montaje en fresco La forma más simple de examinar microorganismos vivos es suspenderlos en agua u otro líquido, colocar una gota de esta suspensión en un p...

Microbiología I (2159) 11 4. PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA Confección de preparados para observación en fresco: técnica de montaje en fresco La forma más simple de examinar microorganismos vivos es suspenderlos en agua u otro líquido, colocar una gota de esta suspensión en un portaobjetos y encima un cubreobjetos, utilizando para su observación al microscopio los objetivos secos (10 x a 40x). Para evitar la evaporación y el efecto de las corrientes de aire, se puede rodear la preparación con vaselina, que cierra el espacio exterior entre el portaobjetos y el cubreobjetos. Cuando la observación es inmediata no es necesario el uso de la vaselina. Confección de preparados para coloraciones En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación es un procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias, preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol, formaldehído y ácido acético entre otros, se utiliza para preservar las estructuras celulares. Preparación y coloración de frotis La forma más común de preparar un frotis es extender una pequeña cantidad de muestra sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, con un ansa en anillo, previamente esterilizada a la llama del mechero y enfriada. Luego, se seca el extendido al aire aunque puede acelerarse por calentamiento suave en la cercanía de la llama del mechero. Una vez seco, el preparado debe fijarse; una forma sencilla y rápida consiste en fijar por calor, pasando el frotis suavemente sobre la llama del mechero evitando un recalentamiento excesivo del vidrio. Esto impedirá el arrastre de los microorganismos por las soluciones de colorantes y lavados durante la coloración. Coloraciones Las coloraciones se usan para teñir a las células aumentando así su contraste, de tal manera, que puedan observarse más fácilmente en el microscopio de campo claro. En general, consisten en cubrir el frotis seco y fijado con una o más soluciones de colorantes. Los tiempos, cantidad y tipos de colorantes varían según el tipo de coloración empleada. Finalmente, se lava el portaobjetos con agua, se seca, se coloca una gota de aceite de inmersión y se observa al microscopio con objetivo de inmersión de 100x (Figura 2.2). Los colorantes son compuestos orgánicos que tienen una afinidad particular por sustancias celulares específicas. Las propiedades ácidas o básicas de los colorantes permiten su fácil clasificación en: Colorantes ácidos. Estos ionizan en soluciones acuosas para producir un núcleo colorante con carga negativa, es decir, el grupo iónico que imparte el color tiene carga negativa (anión). Dichos colorantes se combinan con constituyentes celulares cargados positivamente (proteínas). Por ejemplo: eosina, rojo Congo, fucsina ácida. Colorantes básicos. En los que el ion que lleva el color tiene carga positiva. Dichos colorantes tienen afinidad por el material nuclear y otros componentes. Estos son los más usados en microbiología, ya que debido a la gran cantidad de ribosomas que contienen ácido ribonucleico en todo el protoplasma de la célula bacteriana, éstas se tiñen fácilmente. Por ejemplo: azul de metileno, fucsina básica, cristal violeta, safranina. Microbiología I (2159) 12 Figura 2.2. Preparación de un extendido o frotis y tinción simple Para aplicar los colorantes básicos o ácidos los microbiólogos emplean diferentes clases de tinciones: Tinción simple Se utiliza un colorante, generalmente básico, como por ejemplo, azul de metileno, cristal violeta y fucsina. Todos los microorganismos toman el mismo color, con este tipo de coloración no se pretende diferenciar microorganismos o estructuras celulares. La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma, tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y rápido. Las técnicas de coloración simple pueden ser positivas o negativas. En las tinciones positivas el colorante es fijado por las células apareciendo los microorganismos de color oscuro o coloreado sobre un fondo luminoso o claro. Ejemplo: tinción de azul de metileno, tinción de Gram, etc. Mientras que, en las tinciones negativas los microorganismos no fijan el colorante, en cuyo caso el fondo es el que se tiñe y los microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro. Ejemplo: tinción con nigrosina. Tinción diferencial Se denominan así los procedimientos de coloración que ponen de manifiesto diferencias entre las células microbianas o entre subestructuras de una misma célula. Básicamente comprenden el empleo de más de un colorante, mordientes y/o decolorantes específicos. Microbiología I (2159) 13 Ejemplos: tinción de Gram, tinción de endosporas, etc. Generalmente, en las tinciones diferenciales los microorganismos se tiñen con la ayuda de una sustancia química denominada mordiente. Una de las funciones de un mordiente es aumentar la afinidad de una muestra biológica por un colorante; otra es cubrir una estructura (como un flagelo) para darle mayor espesor y facilitar la observación después del teñido. Algunos ejemplos de mordientes son: soluciones de oxalato amónico, ácido tánico, sales de aluminio, estaño, zinc, cobre, iodo, etc. 5. TINCIONES COMÚNMENTE USADAS EN MICROBIOLOGÍA Coloración de azul de metileno (tinción simple, directa, positiva) Se cubre el frotis ya fijado con la solución de colorante durante aproximadamente 5 minutos. Lavar con agua, secar y observar al microscopio. Coloración de Gram (tinción diferencial) La tinción de Gram fue desarrollada por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1884 y es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información esencial, sobre la forma, tamaño y agrupación celular. La tinción de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos según el tipo y composición de la pared que presentan: bacterias con pared de tipo Gram positiva y bacterias con pared de tipo Gram negativa. PROCEDIMIENTO a) Preparar el frotis en la forma ya indicada. b) Cubrir el frotis ya fijado con cristal violeta y dejar actuar durante 1 min. c) Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la preparación. b) Cubrir con solución de Lugol (I3K), dejar actuar durante 1 min y lavar con agua. c) Cubrir con alcohol-acetona, durante 10 s y lavar con agua (3 veces). d) Cubrir con solución de fucsina básica o safranina (si se usa la fucsina fenicada se diluye 1/10), dejar actuar 30 s y lavar con agua. Secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión (100x). RESULTADOS Con esta coloración las bacterias se presentan de dos colores distintos, las llamadas GRAM POSITIVAS, de color azul a violeta, y las llamadas GRAM NEGATIVAS, de color rosado a rojo (Figura 2.3). FUNDAMENTO Las bacterias reaccionan de modo distinto frente a la tinción de Gram porque las diferencias estructurales en sus paredes determinan la retención o el escape del complejo cristal violeta/yodo (lugol). Entre otras diferencias las bacterias Gram positivas tienen un peptidoglucano en su pared celular más grueso que las bacterias Gram negativas. Por otro lado, las bacterias Gram positivas presentan un polímero con un gran número de uniones cruzadas dando como resultando un plano de malla pequeña, mientras que, las bacterias Gram negativas presentan un polímero con pocos entrecruzamientos que determina una malla planal de “criba” o tamiz grande. Por lo tanto, al agregar el yodo se forma un complejo cristal violeta/mordiente con un tamaño molecular mayor al del tamiz del peptidoglucano de las bacterias Gram positivas y menor al tamiz de las Gram negativas. En consecuencia, cuando se decolora el preparado con alcohol o alcohol-acetona, las células Gram positivas retienen el Microbiología I (2159) 14 complejo colorante-mordiente y permanecen de color violeta. En cambio, en las células Gram negativas el alcohol altera la capa externa de lipopolisacárido y el complejo colorante/mordiente se elimina de la capa delgada de peptidoglucano. Como consecuencia, las células Gram negativas son incoloras hasta que se agrega el colorante de contraste rojo (fucsina o safranina), después de lo cual aparecen de color rosado. Figura 2.3. Tinción de Gram (http://www.mysvarela.nom.es/microbiologia/bacterias3.htm) Coloración de Ziehl-Neelsen (tinción diferencial para bacterias ácido-alcohol resistentes) Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl- Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido- alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (ácido alcohol sensibles) PROCEDIMIENTO a) Sobre el preparado ya fijado se vierte la solución de fucsina de Ziehl sin diluir. b) Se calienta hasta que empiecen a desprenderse vapores blancos, haciendo pasar por debajo del portaobjetos la llama de un hisopo embebido en alcohol. Se repite tres veces el procedimiento. c) Dejar enfriar 5 min y lavar con agua. d) Decolorar con una solución de ácido clorhídrico al 3% (V/V) en etanol de 95% (mezcla alcohol-ácido), hasta la decoloración casi total del frotis. e) Lavar con agua. f) Cubrir unos minutos con solución de Azul de Metileno (según Loeffler). g) Lavar con agua, secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión. RESULTADO Las bacterias ácido-alcohol resistentes (bacilos de la tuberculosis, lepra y otras Micobacterias) se observan de color rojo sobre el contraste azul de otras células bacterianas o restos celulares Microbiología I (2159) 15 pertenecientes a los organismos sensibles a esta decoloración ácida (Figura 2.4). FUNDAMENTO Ciertos microorganismos especialmente los del género Mycobacterium (M. tuberculosis, M. leprae, etc.) y Nocardia tienen dificultades para colorearse con las tinciones simples y aún con la de Gram, por lo cual se los denomina bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR). Dichos microorganismos contienen una gran cantidad de ceras asociadas a la mureina de la pared celular. Estas ceras (lípidos sólidos) contienen ácidos grasos de cadena muy larga (ácidos micólicos) que serían la causa de la resistencia a los métodos habituales de tinción. Por lo tanto, es necesario usar una alta concentración del colorante primario (fucsina de Ziehl o carbolfucsina) y aplicar calor suave sobre la preparación (el calentamiento derrite la cera y aumenta la penetración y la retención del colorante). A continuación el extendido se trata con ácido-alcohol, un decolorante que elimina el color rojo de las bacterias que no son ácido- alcohol resistentes. Los BAAR retienen el color rojo porque las ceras vuelven a solidificarse al enfriarse y por lo tanto, no actúa el decolorante. Las células que no son ácido-alcohol resistentes permanecerán incoloras hasta que se coloree el extendido con azul de metileno, que actúa como colorante de contraste. Las bacterias que no son ácido-alcohol resistentes aparecerán de color azul después de la aplicación del colorante de contraste. Figura 2.4. Tinción de Ziehl-Neelsen (http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen) Coloración de endosporas (tinción diferencial) Las endosporas bacterianas pueden distinguirse en las preparaciones microscópicas sin previa coloración debido a la gran refringencia de su protoplasma, que las diferencia de las células vegetativas. En las preparaciones teñidas por métodos comunes, las endosporas no se colorean debido a la resistencia que ofrece su gruesa cubierta a la impregnación por los colorantes habituales utilizados en la coloración de Gram y azul de metileno, permaneciendo incolora rodeada por la parte coloreada (vegetativa) de la bacteria. No obstante, es posible lograr la tinción de las endosporas por medio de métodos especiales en los que se emplea el calor como mordiente. Las endosporas, debido a las características de sus envolturas no se tiñen con procedimientos habituales. El método más empleado es el de Schaeffer-Fulton donde la suspensión de microorganismos se tiñe en caliente con el colorante verde de malaquita, un colorante soluble en agua por cuya razón no se utiliza habitualmente en tinciones convencionales. El calor modifica la permeabilidad de las endosporas y permite la entrada del colorante a través de las capas externas. A continuación, el lavado con abundante agua produce la decoloración de las formas vegetativas así como de los extremos de las bacterias esporuladas, que se tiñen por último con un colorante de contraste, la safranina PROCEDIMIENTO a) Realizar un frotis colocando una capa fina del cultivo sobre el portaobjeto, dejar secar y fijar con la mínima cantidad de calor. Microbiología I (2159) 16 b) Cubrir la preparación con solución al 5% de verde de malaquita, calentar con hisopo hasta la emisión de vapores y dejar enfriar durante 5 min. c) Lavar con agua. d) Colorear durante 30 s con solución acuosa de safranina al 0,5%. e) Lavar con agua, secar con papel y observar con el objetivo de inmersión. RESULTADOS: Las endosporas se tiñen de verde y las células vegetativas de rojo a rosado (Figura 2.5). Figura 2.5. Tinción de endosporas (http://es.wikipedia.org/wiki/Endospora) Coloración de cápsulas bacterianas (tinción negativa) Las cápsulas bacterianas no tienen la misma afinidad por los colorantes que otros componentes de la misma, por lo que se emplean coloraciones especiales. Algunas, colorean la célula y el fondo, pero no la cápsula, de manera que ésta se aprecia por contraste (método de Anthony). Otras se basan en colorantes diferenciales cuando la cápsula toma un colorante y la bacteria otro (método de Muir). Existe otro procedimiento que utiliza el principio de la coloración negativa, en el cual las cápsulas se observan como un halo claro contra un fondo oscuro (método de la tinta china). PROCEDIMIENTO a) Colocar sobre un portaobjetos una pequeña cantidad de solución fisiológica, agua o caldo, con un ansa en anillo, dispersar en ella una pequeña cantidad del inóculo bacteriano joven. b) Agregar con un ansa en anillo, una pequeña cantidad de tinta china, mezclar bien y cubrir inmediatamente con un cubreobjetos, dejando que el líquido se extienda formando una delgada película. Se debe evitar la formación de burbujas de aire en el preparado. c) Examinar con el objetivo de inmersión. FUNDAMENTO La cápsula desplaza a las partículas de carbono coloidal de la tinta china, apareciendo un halo claro alrededor del microorganismo (Figura 2.6.A). Coloración de flagelos (tinción diferencial) Los flagelos bacterianos son estructuras de locomoción demasiado finas para visualizarlos con el microscopio óptico sin tinción. Para lograr su coloración se trata de engrosarlos aplicando soluciones coloidales inestables de ácido tánico, que se depositan sobre estas estructuras Microbiología I (2159) 17 engrosando el diámetro aparente de los mismos, de tal manera que se hacen visibles al microscopio óptico con una tinción con fucsina básica (Figura 2.6.B). En la coloración de flagelos requiere mucho cuidado la fijación de la bacteria en la confección del preparado, dado la facilidad con que pueden desprenderse los flagelos por daños mecánicos.