Esercitazione 01 preparazione campioni istologici (PDF)

Istologia: preparazione e processazione campioni Nicole Verdile 18 Ottobre, 2024 Le fasi dell’analisi morfologica 1. Tipo di preparati: sezione di campioni o cellule in coltura 2. Allestimento dei preparati: 1. Prelievo 2. Fissazione 3. Sezionamento 4....

Istologia: preparazione e processazione campioni Nicole Verdile 18 Ottobre, 2024 Le fasi dell’analisi morfologica 1. Tipo di preparati: sezione di campioni o cellule in coltura 2. Allestimento dei preparati: 1. Prelievo 2. Fissazione 3. Sezionamento 4. Colorazione 3. Esame dei preparati 1. Microscopia ottica 1. Microcopia in campo chiaro 2. Microscopia a fluorescenza 2. Microscopia elettronica 1. Trasmissione 2. Scansione 1. Pezzi di organo o organi interi 2. Pellets di cellule 3. Cellule coltivate su vetrino 4. Ovociti ed embrioni Prelievo – fissazione nel più breve tempo possibile Eventualmente conservare a freddo fino al momento della fissazione Fissazione: impedisce autolisi e putrefazione a cui vanno incontro cellule e tessuti isolati dall’organismo 1. Blocca tutti i costituenti cellulari e tissutali del campione in uno stato che si avvicini il più possibile a quello vitale 2. consente al campione in esame di supportare stress fisici e chimici dovuti alla processazione (disidratazione, inclusione sezionamento) FISSAZIONE FISICA FISSAZIONE CHIMICA 1. Calore-> citologia, 1. Fissazione per fiamma viva (alcuni perfusione minuti) 2. Fissazione per 2. Essicazione-> citologia, immersione aria a temperatura 3. Fissazione a mezzo di ambiente vapori 3. Congelamento  FISSAZIONE CHIMICA 1. Fissazione per perfusione-> sistema vascolare 2. Fissazione per a mezzo di vapori-> vapori che si liberano dalla soluzione fissativa 3. Fissazione per immersione (tempo/organo/dimensione) Fissativi Semplici Aldeidi (formalina, glutaraldeide) legano tra loro le proteine formando un reticolo (conservazione per lunghi periodi) Alcoli (etilico e metilico) scarsi fissativi, azione parzialmente denaturate proteine, sciolgono i lipidi Acidi (acetico, picrico) conservano la morfologia cellulare non sciolgono i grassi Sali di metalli pesanti (bicromato di potassio, cloruro di mercurio) conservano i glucidi e fissano acidi grassi e proteine Miscele fissative formati da combinazioni di acidi, sali metallici e alcoli, facilitano la penetrazione nei tessuti e consentono una conservazione per lungo tempo (Liquido di Bouin-> pezzi voluminosi, Liquido di Zenker-> granuli di secrezione, Liquido di Carnoy->non interferisce con gli zuccheri->acido periodico Schiff) Campionamento casuale  Disidratazione Inclusione: indurisce il preparato in modo che sia possibile sezionarlo in fette da 5-10 m. Ciò si ottiene infiltrando i campioni con paraffina fusa o con apposite resine. E’ quindi necessario disidratare i campioni con l’alcol che viene poi sostituito con sostanze che siano miscibili in alcol e solventi della paraffina o della resina  Sostanze per inclusione Paraffina: prima scelta per la microscopia ottica, compatibile con tutte le colorazioni istologiche Resine epossidiche e metacrilati: rendono i preparati molto più rigidi e consentono sezioni molto più sottili adatte anche alla microscopia elettronica. Più elaborate e meno flessibili in quando possono essere utilizzate con un ristretto numero di colorazioni OCT: con fissazione fisica (congelamento) in combinazione con, isopentano ed azoto liquido. Molto veloce, massima conservazione della struttura molecolare e quindi adatte al riconoscimento con anticorpi, ma scarsa conservazione della morfologia.  Paraffina Centralina di inclusione Formelle per inclusione Blocchetti di paraffina Microtomo Spessore sezioni:5-10 µm Bagnetto Piastra asciuga vetrini COLORAZIONE: le cellule sono trasparenti se non vengono colorate sono invisibili alla normale microscopia ottica Si basa sull’uso di sostanze con affinità per le diverse componenti della cellula, per esempio: Ematossilina = sostanza basica che si lega agli acidi nucleici colorando il nucleo di viola Eosina = sostanza acida che si lega alle componenti basiche del citoplasma colorandolo di rosa Sezione non colorata Striscio ematico Componente organica: cellule, fibre e matrice Componente inorganica: fosfato e carbonato di calcio OCT Criostato Spessore sezioni:8-10 µm OCT Ultramicrotomo Spessore sezioni: 50-100nm RESINA Ultramicrotomo Spessore sezioni: 50-100nm RESINA Altre colorazioni: Istochimica Utilizza reazioni chimiche per darci informazioni sulla natura chimica dei componenti cellulari (acidi nucleici, enzimi come fosfatasi acide e alcaline o perossidasi). Masson’s tricromica Altre colorazioni: Istochimica Alcian Blu/acido periodico Schiff Altre colorazioni: Istochimica Fosfatasi alcalina Altre colorazioni: Immunoistochimica Utilizza anticorpi contro molecole specifiche, molto più potente attualmente molto utilizzata. Il sistema di rivelazione può essere visibile in campo chiaro o in fluorescenza (maggiore sensibilità e possibilità di vedere più molecole contemporaneamente) Come funziona Anticorpo primario, specifico Anticorpo secondario comune Nelle specie veterinarie la disponibilità di un primario è spesso limitante  Nuclei colorati con ematossilina  PCNA/AP  Nuclei colorati con DAPI  Nuclei colorati con DAPI Altre colorazioni: Ibridazione in situ Invece di utilizzare anticorpi utilizza sonde di acidi nucleici, invece di evidenziare la proteina evidenzia il suo mRNA o frammenti specifici di DNA (FISH) Come funziona? Ibridazione-> appaiamento di mRNA due sequenze complementari In situ-> sul posto Custom probe Biologia molecolare/Istologia Come funziona? Si usa una sonda “senso” di controllo e “antisenso” per la marcatura Le sonde possono essere sintetizzate a basso costo Non c’è problema di limitazioni legate alla specie Whole-mount in situ hybridization (WISH) No anticorpi commercialmente disponibili? Fluorescence in situ hybridization (FISH) (162) ACD RNAscope in situ Hybridization (ISH) Technology Overview - YouTube VALUTAZIONE DELL’INTEGRITA’ mRNA Nuclei colorati con DAPI  Nuclei colorati con DAPI  Nuclei colorati con DAPI Sox9+ Hopx+ DAPI  Nuclei colorati con DAPI Altre colorazioni: Cellule non colorate E’ il caso di cellule vive coltivate in vitro o di sezioni colorate con anticorpi o sonde fluorescenti quando vengono osservate in campo chiaro. Si usano delle ottiche e dei sistemi di illuminazione specifici: contrasto di fase o contrasto interferenziale. Osservazione del campione Il potere di risoluzione Risoluzione dell’occhio umano è di 0.2 mm = distanza Per essere utile minima di due punti l’ingrandimento per essere percepiti deve essere come distinti proporzionale alla risoluzione Le dimensioni medie di una cellula sono di 10-30 µm. Le cellule più grandi (ovocita) raggiungono i 100- Quindi per vedere un 150 µm cellula è necessario ingrandire l’immagine Ingrandimento Campione Microscopio ottico  Microscopio Leitz HM-LUX 3 Oculari Tubo portaottica binoculare Revolver Braccio Obiettivi Traslatore Tavolino porta oggetti Condensatore Vite per messa a fuoco: micro- e macro-metrica Lampada alogena Trasformatore 220V/6V Risoluzione della microscopia ottica Il condensatore fa convergere i raggi luminosi sul preparato da cui escono come un cono di luce di diametro pari a quello dell’obiettivo. Olio che ha lo stesso indice di rifrazione del vetro→ Sistema di lenti continue→ limita la perdita della luce→ risoluzione e prestazione fini Contrasto di fase: → sfrutta le diverse densità ottiche in un campione→ variazioni di intensità luminose → crea immagini chiare e scure senza uso di coloranti Contrasto interferenziale: Utilizza il principio dell’interferenza della luce → luce divisa in due fasci con angoli divergenti Dopo che si ricombina → crea un’immagine tridimensionale ad alto contrasto Epifluorescenza: microscopio ottico modificato per localizzare molecole o strutture specifiche Un raggio UV colpisce dall’alto il campione che emette una luce fluorescente di colore caratteristico per i diversi fluorocromi. Il filtro di sbarramento fa passare la luce colorata, ma non i raggi UV Microscopio ottico Campo chiaro Contrasto di fase Fluorescenza Contrasto interferenziale Miscroscopio diritto Microscopio diritto: vetrini, alto ingrandimento Microscopio rovesciato Microscopio Rovesciato: per cellule in coltura, ingrandimento minore Stereo Microscopio Stereo microscopio per immagini tridimensionali a basso ingrandimento  Microscopia elettronica La risoluzione di un microscopio è la capacità di riconoscere come distinti due punti estremamente vicini tra loro.  Microscopia a trasmissione (TEM) Evita i limiti fisici della risoluzione del microscopio luce spingendosi fino a risoluzioni dell’ordine di pochi Angstrom. Ciò si ottiene “illuminando” il campione con un fascio di elettroni che avendo una minore lunghezza d’onda consente una maggiore risoluzione. Per sfruttare questa capacità bisogna utilizzare sezioni ultrasottili colorate Inclusione lipidica Citoplasma di una cellula pancreatica Reticolo Mitocondrio Endiplasmatico Rugoso Microscopio ottico TEM Microscopio elettronico a scansione I campioni non vengono sezionati, ma ricoperti da un sottile strato d’oro (Sputter Coating- 10nm). Si utilizza sempre un fascio di elettroni come fonte “luminosa”. E’ l’equivalente elettronico del microscopio stereo Immagine trdimensionale della struttura esterna Artefatti in preparati istologici