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SESIÓN IV ANTIBIOGRAMA (METODO DE KIRBY BAUER Y DILUCIÓN EN TUBO) 2024-I ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO: ANTIBIOGRAMA I. INTRODUCCIÓN La actividad de los antimicrobianos (antibióticos y quimioterápicos) debe ser evaluada “in vitro” para obtener la información que permitirá decir si un microorgani...

SESIÓN IV ANTIBIOGRAMA (METODO DE KIRBY BAUER Y DILUCIÓN EN TUBO) 2024-I ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO: ANTIBIOGRAMA I. INTRODUCCIÓN La actividad de los antimicrobianos (antibióticos y quimioterápicos) debe ser evaluada “in vitro” para obtener la información que permitirá decir si un microorganismo es susceptible o resistente a determinado producto. Los antimicrobianos actúan produciendo toxicidad selectiva, no actúan directamente sobre el huésped, sino que se combinan químicamente con determinados sistemas de los microorganismos, enfocando así la acción sobre los microorganismos más que sobre el huésped. La determinación de la mínima concentración inhibitoria (MIC) nos proporciona la dosis mínima necesaria del quimioterápico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que permite hacer estudios de uso clínico y detectar mutantes resistentes. Dos son los procedimientos empleados para conocer esta información, el método del tubo dilución y el del disco difusión en agar, a este último se le denomina: ANTIBIOGRAMA. 1.1. ACCIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS La actividad antimicrobiana in vitro determina:  La potencia de un agente antibacteriano en solución  Su concentración en los líquidos del cuerpo o en los tejidos  La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas del medicamento.  Inhibición de síntesis de la pared celular: Penicilina, Cefalosporinas, Bacitracina, Vancomicina, Novobiocina.  Alteración de la permeabilidad de la membrana celular: Anfotericina B, Colistina, Nistatina, Polimixina.  Inhibición de la síntesis proteica: Aminoglucósidos (Kanamicina, Amikacina, Estreptomicina), Tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrólidos (Eritromicina), Lincomicinas.  Inhibición de síntesis de ácidos nucleicos: Ácido Nalidíxico, Novobiocina, Sulfonamidas, Trimetropin, Rifampicina. 1.2. MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Esta se determina mediante los métodos de dilución o difusión, utilizando un microorganismo standard y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se utilizan las pruebas de dilución en tubos y el método de difusión en placa con discos. 1.2.1. MÉTODO DE DIFUSIÓN La técnica del antibiograma sólo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Previamente la bacteria cultivada se aisla en un tubo con medio líquido apropiado (caldo Nutritivo, Infusión cerebro corazón) o se prepara una suspensión directa a partir del cultivo en placa usando el siguiente método: 1. Tomar una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solución salina frotando en la pared del tubo. 2. Homogeneizar bien y ajustar la densidad óptica con un patrón de turbidez Nº 0,5 de Mac Farland: 0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M a 99,5 ml de ácido sulfúrico 0,36 N 0,18 M. Esto equivale a 10 8 células/ml. Diluir si es necesario la suspensión o añadir más inóculo. 3. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez, sumergir una torunda estéril en la suspensión, rotar la torunda estéril varias veces. Presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del líquido, para remover el exceso de inóculo. 4. Inocular la superficie seca de la placa con agar Mueller Hinton estriando con una torunda en tres direcciones mediante rotación de la placa, para asegurar una distribución uniforme del inóculo, dejar secar la placa a temperatura ambiente por 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido. 5. Colocar los discos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estéril (o con un aplicador automático) presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo son la superficie del agar. 6. Distribuir los discos uniformemente de modo que estén a una distancia de 15 mm del borde de la placa y a 25 mm uno del otro (el diámetro de los discos según las normas de la Organización Mundial de la Salud debe ser de 6 mm), no deben colocarse más de 6 discos en una placa. 7. El uso de un disco para cada antibiótico estandarizado permite dar el informe de S (sensible), I (intermedio) y R (resistente). Existen factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro:  El pH del medio, ya que algunos antibióticos son más activos a pH ácido (Nitrofurantoína), otros a pH alcalino (Aminoglucósidos, Sulfonamidas)  Los componentes del medio, en este caso las proteínas séricas fijan a las penicilinas desde 40 % para la Meticilina y 98 % para la Dicloxacilina.  Estabilidad de los medicamentos, a la temperatura de la incubadora varios agentes antimicrobianos pierden su actividad.  Cuanto más grande sea el inóculo bacteriano, más baja será la sensibilidad del microorganismo.  Cuanto más tiempo se prolonga la incubación, mayor es la oportunidad de presentarse las mutantes resistentes, igualmente los microorganismos que crecen rápido y activamente son más sensibles a la acción de los antibacterianos que aquellos que se encuentran en fase de reposo. 1.2.2. DILUCIÓN EN TUBO En este ensayo se incorporan cantidades conocidas de los antimicrobianos en medios líquidos, se inoculan después con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se toma cuando la cantidad de sustancias antimicrobiana es capaz de inhibir el crecimiento o de matar a las bacterias en prueba. Se obtiene un resultado cuantitativo, destacando dos características importantes: 1. Concentración mínima inhibitoria (CMI): es la concentración mínima de antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo. 2. Concentración mínima bactericida (CMB): es la concentración que mata a los microorganismos. Normalmente la CMI es suficiente para combatir una determinada infección, ya que los mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar al microorganismo. 1.2.3. MECANIZADOS Y AUTOMATIZADOS  Se aplica el principio del método de dilución  Resultados de identificación y sensibilidad (CMI) en el día: entre 5 y 8 horas.  Información precisa sobre el mecanismo de resistencia de la bacteria estudiada (todos los resultados validados).  Permite un informe rápido y confiable.  Optimiza la elección del tratamiento: recomienda los cambios terapéuticos necesarios para el éxito en el tratamiento cuando se reconoce un fenotipo resistente. II. OBJETIVOS  Entender el fundamento del antibiograma, el modo en que se realiza y las principales fuentes de error.  Conocer los principales métodos de susceptibilidad a un antimicrobiano.  Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibióticos de una bacteria de crecimiento rápido aislada en prácticas anteriores. El método utilizado es el de difusión en agar o de Kirby-Bauer. III. IV. MATERIALES  Caldo de cultivo con suspensión bacteriana a la escala de turbidez de Nº 0,5 de Mc Farland  Placas de Petri con agar Mueller Hinton  Torundas estériles  Discos impregnados con diferentes antibióticos  Pinzas estériles. METODOLOGÍA 1. Sumergir la torunda en caldo tripticasa de soya con cepa bacteriana, presionar firme sobre las paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de la placa de agar Mueller Hinton. 2. Colocar con la ayuda de pinzas, los discos impregnados con diferentes antibióticos sobre la superficie del agar. 3. Los discos deben quedar a una distancia de 25 mm entre ellos. 4. Incubar a 37°C durante 24 horas. 4.1. EXTENDIDO DE LA CEPA BACTERIANA POR EL MÉTODO DE AGOTAMIENTO EN AGAR MH 4.2. LECTURA DE LOS DISCOS DE SENSIBILIDAD: El diámetro de la zona de inhibición se mide con una regla milimetrada, colocada debajo de la placa de Petri. El límite del área de inhibición está dado por la inhibición completa del desarrollo, tal como se puede apreciar a simple vista. Los milímetros de la lectura serán llevados a la tabla correspondiente para traducir su interpretación en los términos: Sensible (S), Intermedio (I), Resistente (R). Resistente Sensible Tomado del Manual de laboratorio para la identificación y prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos de patógenos bacterianos de importancia para la salud pública en el mundo en desarrollo. Organización Mundial de la Salud 2004. LECTURA DE LO HALOS DE INHIBICIÓN DE LOS DISCOS DE SENSIBILIDAD Quimioterápico Ampicilina AM Amikacina AK Ac. Nalidíxico AN Cefalotina CF Cefoxitina CTX Ceftriaxona CRO Cloranfenicol C Kanamicina K Nitrofurantoina FD Sulfatrimetoprim SXT Ciprofloxacino CIP Concentración del Disco mcg 10 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 300 ug 231,2 ug 5 ug Halo de Inhibición Sensible Intermedio Resistente +17 14-16 -13 +17 -15 +19 14-18 -13 +18 15-17 -14 +21 16-10 -15 +21 14-20 -13 +18 15-18 -14 +18 14-17 -13 +17 15-16 -14 +16 11-15 -10 +21 16-20 -15 Antibióticos y Diámetros Críticos para Staphylococcus spp Antibióticos y Diámetros Críticos para Enterobacterias Antibióticos y Diámetros Críticos para Pseudomonas aeruginosa V. RESULTADOS Realizar la lectura, observar y anotar los resultados. Antibiótico S I R CASO CLÍNICO Datos del paciente: Femenino, Espécimen: Orina, Dx presuntivo: Probable IVU (infección de las vías urinarias) Antecedentes: Paciente acude al médico por presentar molestias al orinar, refiere ardor, poliuria, nicturia y malestar general, quien solicita EGO (examen general de orina) y urocultivo. PREGUNTA: ¿Cómo procedería para confirmar el Diagnóstico presuntivo IVU?