Ejercicio 6 BIOL 4605 Extracción de proteínas totales.pdf

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Ejercicio 6. Extracción de proteínas totales del citoplasma OBJETIVOS 1. Explicar las características de las células PANC-1. 2. Aislar las proteínas totales...

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Ejercicio 6. Extracción de proteínas totales del citoplasma OBJETIVOS 1. Explicar las características de las células PANC-1. 2. Aislar las proteínas totales obtenidas del citoplasma de las células PANC-1. INTRODUCCIÓN La línea celular PANC-1 fue obtenida de un hombre de 56 años caucásico. De un adenocarcinoma de células del conducto pancreático. El cáncer (tumor) en el páncreas puede crecer sin presentar síntomas y usualmente cuando se diagnóstica ya se encuentra en etapas avanzadas. La metástasis, de este tipo de cáncer, puede ocurrir al hígado, pulmones y huesos. Las células PANC-1 son adherentes con 63 cromosomas. El ciclo celular de esta línea es aproximadamente de 52 horas. Estás células son cultivadas en Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) suplementadas con un 10% de suero bovino fetal (fetal bovine serum- FBS), antibióticos (penicilina y estreptomicina) y glutamina. Estas se incuban a una temperatura de 37oC y en una atmósfera húmeda con un 5% de CO2. 1 MATERIALES Y EQUIPO Células PANC-1 tripsinizadas en suspensión Buffer de extracción de citoplasma (10X) (HEPES 100mM, MgCl2 15mM, KCl 100mM, EDTA 1mM) (4oC) Inhibidores de proteasas (Sigma P8340- 1 mL o Thermo Scientific 78440 -1mL (-20oC Nevera 3, en alícuotas) Dithiothreitol (DTT) 1M (Sigma 43816) (-20oC Nevera 3, en alícuotas) Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (Sigma D8537) (4oC) Nonidet P-40 (NP-40) 10% (Sigma 98379-10 mL-F) (RT, alícuotas, gabinete de reactivos orgánicos) Tubos de centrífuga estériles de 15mL Microtubos estériles 1.5 mL Pipetas serológicas 5 mL y Aspiradores de vacío 10 mL Puntas estériles de 10, 100, 1000 µL Seis (6) Beakers de 150 mL con cloro 10% (UNO para cada grupo) Hielo Cubetas Centrífuga refrigerada Precauciones a considerar cuando se realice el protocolo Todos los pasos deben realizarse en frío. Todos los reactivos tales como buffer de extracción de citoplasma (BEC), Dithiothreitol (DTT), Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) e Inhibidores de proteasas deben mantenerse en hielo. PROCEDIMIENTO Preparativos preliminares Colocar el rotor de los microtubos en la nevera previo a realizar la extracción. Antes de iniciar el procedimiento encienda la centrífuga y ajuste la temperatura a 4°C. Dilución del buffer de extracción de citoplasma (BEC) 10X a 1X Rotule el microtubo estéril con el nombre BEC 1X. Añada 100 µL de BEC (10X) al microtubo. Añada 900 µL de dH2O fría Mezcle por inversión Mantenga el tubo en hielo. Dilución del DTT de 1M a 0.1M Rotule el microtubo estéril con el nombre DTT 0.1M Añada 27 µL dH2O fría a un microtubo estéril Añada 3 µL de DTT. Mezcle por inversión. Mantenga el tubo en hielo. Inhibidores de proteasas Descongelar una (1) alícuota con 20 µL de la solución de inhibidores de proteasas. Mantener las alícuotas en hielo. Preparación de la solución BEC1X/ DTT 0.1M/Inhibidores de Proteasas En un microtubo estéril añada: ▪ 980 µL BEC 1X ▪ 10 µL de inhibidores de proteasas ▪ 10 µL DTT 0.1M. ▪ Mezcle por inversión. Colocar la mezcla en hielo Lavado del cultivo celular 1. Cada grupo transferirá 4.5 mL de las células PANC-1 a un tubo de centrífuga de 15 mL. 2. Rotule su tubo con el nombre del grupo. 3. Centrifugue cada tubo con la suspensión celular a 1,200 rpm, 4 °C durante 7 minutos. 4. Remueva el medio que se encuentra en el sobrenadante con una pipeta serológica o decante el mismo en un beaker con 5 mL de cloro al 10%. 5. Una vez termine de usar la pipeta serológica enjuague la misma con el cloro al 10%, colocarla nuevamente en la envoltura y descartarla en el envase asignado. 6. A las células PANC-1 (pellet, sedimento) añada 2 mL de Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline 1X (DPBS) frio. Este buffer se usa para lavar las células y remover residuos del medio. 7. Centrifugue cada tubo con la suspensión celular a 1,200 rpm, 4 °C durante 7 minutos. 8. Remueva el DPBS (sobrenadante) y descarte en un beaker con cloro. 9. Repita los pasos 6 al 8. Las células se deben colocar en hielo. Extracción de proteínas totales del citoplasma 1. A las células PANC-1 (pellet) añada 100 µL de la solución hipotónica BEC 1X/DTT 0.1M/Inhibidores de proteasas previamente preparado a las células. 2. Resuspenda cuidadosamente la muestra aspirando y expulsando con una micropipeta. Se recomienda utilizar la P100. 3. Transfiera toda la muestra a un microtubo 1.5 mL estéril. Asegúrese de que esté rotulado con el nombre del grupo. 4. Incube las células durante 15 minutos en hielo (cubeta). 5. Añada 6 µL de la solución de Nonidet P-40 (NP-40) al 10% a cada tubo. La proporción debe ser 6 µL de NP-40 al 10% por cada 100 µL de volumen de extracción. 6. Mezcle en el vortex a la máxima velocidad (10) durante 10 segundos. 7. Cambie el rotor de la centrifuga para trabajar con microtubos. 8. Centrifugue a 8900 rpm durante 30 segundos a 4°C. Se debe programar la centrifuga refrigerada para 1 minuto, cuando llegue a 30 segundos detenga la misma. 9. Transfiera el sobrenadante (proteínas totales) a un microtubo nuevo rotulado: Proteínas totales, PANC-1, nombre del grupo. Se recomienda utilizar la micropipeta P100. 10. Almacene sus muestras a -80°C.