Questions and Answers
¿Cuál es el propósito de la centrifugación rápida en el paso 1 de la preparación del Master Mix?
Para descongelar el Master Mix
¿Qué es la concentración final del/fw primer en el Master Mix?
0.4µM
¿Cuál es el nombre del equipo utilizado para visualizar la electroforesis en gel de agarosa?
CHEMI DOC Touch Imaging System
¿Por qué es importante cerrar inmediatamente la tapa de los microtubos de PCR después de transferir el Master Mix?
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¿Cuál es el volumen del Master Mix que se debe transferir a cada microtubo de PCR?
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¿Cuál es el propósito de realizar una centrifugación a todos los tubos antes de colocarlos en el termociclador?
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¿Cuál es la temperatura de desnaturalización en el protocolo de PCR?
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¿Qué es el propósito de agregar bromuro de etidio al gel de agarosa?
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¿Cuál es el volumen total de la reacción de PCR en este protocolo?
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¿Qué es el propósito de la etapa de extensión final en el protocolo de PCR?
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Qué temperatura se utiliza en la etapa de alineamiento durante la reacción de PCR?
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¿Cuál es el propósito de la etapa de extensión final en la reacción de PCR?
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¿Qué enzima es responsable de añadir dNTPs durante la reacción de PCR?
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¿Qué se busca evitar en la electroforesis en gel de agarosa mediante el uso de un control negativo?
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¿Cuál es el tamaño esperado del producto específico en la reacción de PCR?
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¿Cuál es el propósito del "loading dye" en la mezcla de reacción de PCR?
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¿Cuál es el producto de la reacción de PCR que se amplifica en la región 16S del gen rDNA?
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¿Qué sucede si el "primer" forward y el "primer" reverse tienen secuencias de bases complementarias entre sí?
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¿Cuántas copias se forman del DNA original después de 30 ciclos de PCR?
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¿Qué es el propósito de utilizar la gel de agarosa en la electroforesis?
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¿Cuál es el tipo de cáncer del que se obtuvo la línea celular PANC-1?
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¿Cuál es el número de cromosomas presente en las células PANC-1?
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¿Qué es el medio de cultivo utilizado para cultivar las células PANC-1?
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¿Cuál es el lugar común donde se produce la metástasis en el caso del adenocarcinoma de células del conducto pancreático?
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¿Cuál es el tiempo de ciclo celular aproximado de las células PANC-1?
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¿Cuál es el propósito de agregar DTT a la solución?
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¿Cuál es el propósito del lavado con DPBS en este protocolo?
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¿Cuál es el nombre del tipo de célula utilizada en este protocolo?
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¿Cuál es la velocidad de centrifugación utilizada en este protocolo?
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¿Cuál es el propósito de mantener el tubo en hielo en este protocolo?
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¿Cuál es la temperatura y atmósfera necesarias para incubar células?
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¿Qué es el propósito de los inhibidores de proteasas en la extracción de proteínas?
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¿Cuál es el nombre del buffer utilizado para la extracción de citoplasma?
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¿Qué es el propósito del paso de preparativos preliminares en el protocolo de extracción de proteínas?
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¿Qué es el propósito del uso de Nonidet P-40 en la extracción de proteínas?
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¿Cómo se obtiene la absorbancia promedio en la lectura del Microplate Reader iMARK?
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¿Qué es lo que se representa en la curva de calibración de BSA estándar?
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¿Cuál es el propósito de construir la curva de calibración de BSA estándar?
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¿Qué es lo que se multiplica por 10 para obtener la concentración final de proteínas totales?
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¿Qué es lo que se utiliza para determinar la concentración de proteínas totales en la muestra del citoplasma?
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¿Qué es lo que se requiere para construir la curva de calibración de BSA estándar?
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¿Cuál es el propósito de utilizar la espectrofotometría en este protocolo?
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¿Cómo se construye la curva de calibración para medir la concentración de proteínas?
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¿Cuál es el principio del ensayo BCA?
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¿Qué se observa cuando las proteínas se encuentran en bajas concentraciones?
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¿Cuál es el propósito de leer la absorbancia a 570 nm en el Microplate Reader iMARK?
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¿Qué se utiliza para construir la ecuación de regresión para determinar la concentración de proteínas?
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¿Cuál es el propósito del icono Reader Set Up en el protocolo de detección de proteínas?
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¿Cuál es el paso previo a la lectura del plato en el protocolo de detección de proteínas?
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¿Cuál es el rango de largos de onda que se pueden utilizar en el protocolo de detección de proteínas?
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¿Cuál es el propósito de seleccionar el largo de onda del filtro en el protocolo de detección de proteínas?
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¿Cuál es el paso posterior a la selección del Template en el protocolo de detección de proteínas?
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¿Cuál es el propósito de ingresar el Mix time y el Mix Speed en el protocolo de detección de proteínas?
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Study Notes
Marcador 1kb y Equipos
- El marcador 1kb se utiliza para medir el tamaño del DNA.
- Las bandas más importantes del marcador son las últimas tres: 0.5, 1.0 y 1.5 kb.
Materiales y Equipos
- 2X Go Taq Green Master Mix (Promega #M7122)
- Universal Forward and Reverse Primers
- gDNA aislado (50 ng)
- Microtubos 1.5 mL estériles
- Tubos de PCR estériles
- Micropipetas (P10 y 100)
- Puntas con filtro estériles P10 y P100
- Agarosa
- Matraz 125 mL
- Probeta de 50 mL IX TBE
- Cámara de electroforesis (3)
- Soporte
- Power supply (3)
- Microcentrífuga
- Thermal Cycler
- CHEMI DOC Touch Imaging System (BioRad)
Procedimiento PCR
- Preparar el master mix en un microtubo estéril de 1.5 mL.
- Añadir cada componente en orden: Agua, Go Taq Green Master Mix, FW primer, Rv primer.
- Realizar una centrifugación rápida.
- Rotular todos los microtubos de PCR (control -, experimental).
- Transferir 24 μL del master mix a cada microtubo de PCR.
- Añadir 1 µL de agua ultrapura al control negativo.
- Añadir 1 µL de gDNA (template) de 20-30 ng/µL al microtubo con el grupo experimental.
Electroforesis
- Preparar el gel de agarosa al 1%.
- Preparar las muestras y control: remover los tubos de PCR del Thermal Cycler y colocarlos en hielo.
- Realizar una centrifugación rápida y cargar las fosas del gel directamente con 10 µL de la muestra.
Resultados
- La electroforesis permite determinar:
- Presencia del producto específico (Muestras experimentales) en las muestras o grupos experimentales que contenían gDNA de la bacteria de interés 16SrDNA de tamaño esperado de 1.5 kb.
- Presencia de productos no específicos (Muestras experimentales) en las muestras o grupos experimentales que contenían gDNA de la bacteria de mayor o menor tamaño (kilobases) que el producto específico esperado de 1.5 kb.
- Contaminación de DNA exógeno (Control negativo).
Discusión
- Referirse a la figura del gel.
- Identificar los carriles con la muestra correspondiente (Marcador 1kb, controles negativos, grupos experimentales con gDNA).
Preguntas
- ¿Qué pasa si el “primer” “forward” y “reverse” tienen secuencias de bases complementarias entre sí?
- ¿Cuántas copias se formaron del DNA original después de 30 ciclos?
Extracción de proteínas totales del citoplasma
- Objetivos: explicar las características de las células PANC-1 y aislar las proteínas totales obtenidas del citoplasma de las células PANC-1.
Materiales y Equipos
- Células PANC-1 tripsinizadas en suspensión
- Buffer de extracción de citoplasma (10X)
- Inhibidores de proteasas (Sigma P8340- 1 mL o Thermo Scientific 78440 -1mL)
- Dithiothreitol (DTT) 1M (Sigma 43816)
- Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (Sigma D8537)
- Nonidet P-40 (NP-40) 10% (Sigma 98379-10 mL)
- Tubos de centrífuga estériles de 15 mL
- Microtubos estériles 1.5 mL
- Pipetas serológicas 5 mL y Aspiradores de vacío 10 mL
Procedimiento
- Preparación del buffer de extracción de citoplasma (BEC) 1X
- Lavado del cultivo celular
- Preparación de la solución BEC 1X/ DTT 0.1M/Inhibidores de Proteasas
- Extracción de proteínas totales del citoplasma
Microplate Reader iMARK (Bio-Rad)
- Utiliza espectrofotometría para obtener la absorbancia a 570 nm.
- Construye una curva de calibración de BSA estándar utilizando proteínas estándares como Bovine Serum Albumin (BSA) o Inmunoglobulina G (IgG).
- Aplica la ecuación de regresión (y=mx+b) para determinar la concentración de proteínas totales en las muestras desconocidas.
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