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Molecular Biology Lab: Gel Electrophoresis

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Study Flashcards

53 Questions

¿Cuál es el propósito de la centrifugación rápida en el paso 1 de la preparación del Master Mix?

Para descongelar el Master Mix

¿Qué es la concentración final del/fw primer en el Master Mix?

0.4µM

¿Cuál es el nombre del equipo utilizado para visualizar la electroforesis en gel de agarosa?

CHEMI DOC Touch Imaging System

¿Por qué es importante cerrar inmediatamente la tapa de los microtubos de PCR después de transferir el Master Mix?

Para evitar la contaminación con DNA ambiental

¿Cuál es el volumen del Master Mix que se debe transferir a cada microtubo de PCR?

24µL

¿Cuál es el propósito de realizar una centrifugación a todos los tubos antes de colocarlos en el termociclador?

Evitar la evaporación de las muestras

¿Cuál es la temperatura de desnaturalización en el protocolo de PCR?

95°C

¿Qué es el propósito de agregar bromuro de etidio al gel de agarosa?

Interactuar con el DNA y permitir su visualización

¿Cuál es el volumen total de la reacción de PCR en este protocolo?

25 μL

¿Qué es el propósito de la etapa de extensión final en el protocolo de PCR?

Permitir que la Taq polimerasa complete la síntesis de los fragmentos de DNA

Qué temperatura se utiliza en la etapa de alineamiento durante la reacción de PCR?

47-60oC

¿Cuál es el propósito de la etapa de extensión final en la reacción de PCR?

Completar la extensión de los productos amplificados

¿Qué enzima es responsable de añadir dNTPs durante la reacción de PCR?

Taq polimerasa

¿Qué se busca evitar en la electroforesis en gel de agarosa mediante el uso de un control negativo?

La contaminación con DNA exógeno

¿Cuál es el tamaño esperado del producto específico en la reacción de PCR?

1.5 kb

¿Cuál es el propósito del "loading dye" en la mezcla de reacción de PCR?

Facilitar la visualización de las muestras en la electroforesis en gel de agarosa

¿Cuál es el producto de la reacción de PCR que se amplifica en la región 16S del gen rDNA?

Un fragmento de 1.5 kb

¿Qué sucede si el "primer" forward y el "primer" reverse tienen secuencias de bases complementarias entre sí?

Se forma un dímero de primers

¿Cuántas copias se forman del DNA original después de 30 ciclos de PCR?

2^30 = 1.073.741.824 copias

¿Qué es el propósito de utilizar la gel de agarosa en la electroforesis?

Separar las muestras según su tamaño

¿Cuál es el tipo de cáncer del que se obtuvo la línea celular PANC-1?

Carcinoma de células del conducto pancreático

¿Cuál es el número de cromosomas presente en las células PANC-1?

63 cromosomas

¿Qué es el medio de cultivo utilizado para cultivar las células PANC-1?

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)

¿Cuál es el lugar común donde se produce la metástasis en el caso del adenocarcinoma de células del conducto pancreático?

Hígado y pulmones

¿Cuál es el tiempo de ciclo celular aproximado de las células PANC-1?

52 horas

¿Cuál es el propósito de agregar DTT a la solución?

Inhibir la acción de las proteasas

¿Cuál es el propósito del lavado con DPBS en este protocolo?

Remover residuos del medio

¿Cuál es el nombre del tipo de célula utilizada en este protocolo?

Células PANC-1

¿Cuál es la velocidad de centrifugación utilizada en este protocolo?

1,200 rpm

¿Cuál es el propósito de mantener el tubo en hielo en este protocolo?

Inhibir la acción de las proteasas

¿Cuál es la temperatura y atmósfera necesarias para incubar células?

37°C y atmósfera húmeda con un 5% de CO2

¿Qué es el propósito de los inhibidores de proteasas en la extracción de proteínas?

Inhibir la actividad de proteasas para preservar proteínas

¿Cuál es el nombre del buffer utilizado para la extracción de citoplasma?

Buffer de extracción de citoplasma (BEC)

¿Qué es el propósito del paso de preparativos preliminares en el protocolo de extracción de proteínas?

Colocar el rotor de los microtubos en la nevera

¿Qué es el propósito del uso de Nonidet P-40 en la extracción de proteínas?

Solubilizar las proteínas del citoplasma

¿Cómo se obtiene la absorbancia promedio en la lectura del Microplate Reader iMARK?

Sumando las dos absorbancias y dividiendo entre dos

¿Qué es lo que se representa en la curva de calibración de BSA estándar?

La absorbancia en función de la concentración final de BSA

¿Cuál es el propósito de construir la curva de calibración de BSA estándar?

Determinar la relación entre la absorbancia y la concentración final de BSA

¿Qué es lo que se multiplica por 10 para obtener la concentración final de proteínas totales?

La concentración obtenida mediante la ecuación de regresión

¿Qué es lo que se utiliza para determinar la concentración de proteínas totales en la muestra del citoplasma?

La ecuación de regresión obtenida de la curva de calibración

¿Qué es lo que se requiere para construir la curva de calibración de BSA estándar?

La concentración final de BSA y la absorbancia promedio

¿Cuál es el propósito de utilizar la espectrofotometría en este protocolo?

Medir la concentración de proteínas totales

¿Cómo se construye la curva de calibración para medir la concentración de proteínas?

Utilizando proteínas estándares como BSA o IgG

¿Cuál es el principio del ensayo BCA?

Complejación de proteínas con cupric sulfate

¿Qué se observa cuando las proteínas se encuentran en bajas concentraciones?

Un color verde

¿Cuál es el propósito de leer la absorbancia a 570 nm en el Microplate Reader iMARK?

Medir la concentración de proteínas totales

¿Qué se utiliza para construir la ecuación de regresión para determinar la concentración de proteínas?

La concentración de proteínas como variable dependiente

¿Cuál es el propósito del icono Reader Set Up en el protocolo de detección de proteínas?

Seleccionar el largo de onda del filtro según el protocolo

¿Cuál es el paso previo a la lectura del plato en el protocolo de detección de proteínas?

Presionar el icono Reader Set Up

¿Cuál es el rango de largos de onda que se pueden utilizar en el protocolo de detección de proteínas?

De 405 a 750 nm

¿Cuál es el propósito de seleccionar el largo de onda del filtro en el protocolo de detección de proteínas?

Configurar la longitud de onda según el protocolo

¿Cuál es el paso posterior a la selección del Template en el protocolo de detección de proteínas?

Ingresar la información del experimento en el Template

¿Cuál es el propósito de ingresar el Mix time y el Mix Speed en el protocolo de detección de proteínas?

Configurar los parámetros de mezcla del experimento

Study Notes

Marcador 1kb y Equipos

  • El marcador 1kb se utiliza para medir el tamaño del DNA.
  • Las bandas más importantes del marcador son las últimas tres: 0.5, 1.0 y 1.5 kb.

Materiales y Equipos

  • 2X Go Taq Green Master Mix (Promega #M7122)
  • Universal Forward and Reverse Primers
  • gDNA aislado (50 ng)
  • Microtubos 1.5 mL estériles
  • Tubos de PCR estériles
  • Micropipetas (P10 y 100)
  • Puntas con filtro estériles P10 y P100
  • Agarosa
  • Matraz 125 mL
  • Probeta de 50 mL IX TBE
  • Cámara de electroforesis (3)
  • Soporte
  • Power supply (3)
  • Microcentrífuga
  • Thermal Cycler
  • CHEMI DOC Touch Imaging System (BioRad)

Procedimiento PCR

  • Preparar el master mix en un microtubo estéril de 1.5 mL.
  • Añadir cada componente en orden: Agua, Go Taq Green Master Mix, FW primer, Rv primer.
  • Realizar una centrifugación rápida.
  • Rotular todos los microtubos de PCR (control -, experimental).
  • Transferir 24 μL del master mix a cada microtubo de PCR.
  • Añadir 1 µL de agua ultrapura al control negativo.
  • Añadir 1 µL de gDNA (template) de 20-30 ng/µL al microtubo con el grupo experimental.

Electroforesis

  • Preparar el gel de agarosa al 1%.
  • Preparar las muestras y control: remover los tubos de PCR del Thermal Cycler y colocarlos en hielo.
  • Realizar una centrifugación rápida y cargar las fosas del gel directamente con 10 µL de la muestra.

Resultados

  • La electroforesis permite determinar:
    • Presencia del producto específico (Muestras experimentales) en las muestras o grupos experimentales que contenían gDNA de la bacteria de interés 16SrDNA de tamaño esperado de 1.5 kb.
    • Presencia de productos no específicos (Muestras experimentales) en las muestras o grupos experimentales que contenían gDNA de la bacteria de mayor o menor tamaño (kilobases) que el producto específico esperado de 1.5 kb.
    • Contaminación de DNA exógeno (Control negativo).

Discusión

  • Referirse a la figura del gel.
  • Identificar los carriles con la muestra correspondiente (Marcador 1kb, controles negativos, grupos experimentales con gDNA).

Preguntas

  • ¿Qué pasa si el “primer” “forward” y “reverse” tienen secuencias de bases complementarias entre sí?
  • ¿Cuántas copias se formaron del DNA original después de 30 ciclos?

Extracción de proteínas totales del citoplasma

  • Objetivos: explicar las características de las células PANC-1 y aislar las proteínas totales obtenidas del citoplasma de las células PANC-1.

Materiales y Equipos

  • Células PANC-1 tripsinizadas en suspensión
  • Buffer de extracción de citoplasma (10X)
  • Inhibidores de proteasas (Sigma P8340- 1 mL o Thermo Scientific 78440 -1mL)
  • Dithiothreitol (DTT) 1M (Sigma 43816)
  • Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (Sigma D8537)
  • Nonidet P-40 (NP-40) 10% (Sigma 98379-10 mL)
  • Tubos de centrífuga estériles de 15 mL
  • Microtubos estériles 1.5 mL
  • Pipetas serológicas 5 mL y Aspiradores de vacío 10 mL

Procedimiento

  • Preparación del buffer de extracción de citoplasma (BEC) 1X
  • Lavado del cultivo celular
  • Preparación de la solución BEC 1X/ DTT 0.1M/Inhibidores de Proteasas
  • Extracción de proteínas totales del citoplasma

Microplate Reader iMARK (Bio-Rad)

  • Utiliza espectrofotometría para obtener la absorbancia a 570 nm.
  • Construye una curva de calibración de BSA estándar utilizando proteínas estándares como Bovine Serum Albumin (BSA) o Inmunoglobulina G (IgG).
  • Aplica la ecuación de regresión (y=mx+b) para determinar la concentración de proteínas totales en las muestras desconocidas.

Learn about the preparation and analysis of DNA samples in a molecular biology lab, including the use of loading dye and gel electrophoresis. Identify key markers and understand the migration patterns of DNA samples.

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