Clonagem Molecular e Vetores de Clonagem PDF

Clonagem molecular e vetores de clonagem Profa Ana Eliza Zeraik LQFPP/CBB/UENF  Clonagem Reprodutiva Clonagem terapêutica Clonagem molecular Clonagem de DNA amplificação seletiva...

Clonagem molecular e vetores de clonagem Profa Ana Eliza Zeraik LQFPP/CBB/UENF  Clonagem Reprodutiva Clonagem terapêutica Clonagem molecular Clonagem de DNA amplificação seletiva de um determinado gene ou segmento de DNA  Clonagem molecular: Viabilização Descobertas que viabilizaram o processo de clonagem molecular: 1 - Enzimas de restrição, ligase, polimerase 2 - Vetores de clonagem 3 - Métodos de transformação de células eucarióticas e procarióticas Histórico Frederick Griffith: transformação bacteriana (1928) O bacteriologista britânico Frederick Griffith conduziu uma série de experimentos usando a bactéria Streptococcus pneumoniae e ratos para criar uma vacina contra a pneumonia. Griffith concluiu que as bactérias da cepa R teriam adquirido o que ele chamou de "princípio transformante" da bactéria S morta por calor, permitindo que elas se "transformassem" em bactérias S, tornando-se virulentas.  Clonagem molecular: Aplicações Ferramentas para pesquisa básica:Pesquisa em estrutura e função de proteínas Diagnóstico: Produção em larga escala de proteínas recombinantes (para kits de ELISA, etc) Fármacos: anticorpos terapêuticos, vacinas, hormônios, fatores de coagulação Produção de organismos trangênicos: melhores índices de produtividade; imunidade a doenças e pragas; modelos de estudo em pesquisa (animais knockouts) Em 1982, foi aprovado pela Food and Drug Administration, o primeiro biofármaco recombinante, a insulina humana, um marco para pesquisa genética e biotecnológica Clonagem e expressão de proteínas recombinantes  Por que expressar proteínas recombinantes Dificuldade de se purificar do tecido original Proteínas do tecido podem estar contaminadas Proteínas recombinantes podem ser engeinheiradas Processo completamente controlado Especificidade Quantidade (produção em larga escala)  Etapas para clonagem e expressão de uma proteína 1) Selecionar o modelo do estudo: Schistosoma mansoni 2) Selecionar um gene alvo: Gene actina de S. mansoni 3) Identificar a sequência em banco de dados Busca em banco de dados​ NCBI Um dos maiores repositórios de informações biológicas existentes Parte do NIH (National Institutes of Health) dos EUA.​ The National Institutes of Health is the largest public funder of biomedical research in the world. In fiscal year 2022, NIH invested most of its $45 billion appropriations in research seeking to enhance life, and to reduce illness and disability. NIH-funded research has led to breakthroughs and new treatments helping people live longer, healthier lives, and building the research foundation that drives discovery. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Sequência em formato FASTA Formato mais utilizado para reconhecimento de sequências por programa de bioinformática Primeira linha possui um sinal > seguido pela descrição da seqüência Linhas seguinte contem a sequência Precisamos da sequência de nucleotídeo para a clonagem Existem bases de dados específicas: humanos, parasitos, plantas, câncer, etc.. E se não sei o nome da proteína e só tenho a sequência?  O BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Ferramenta utilizada para comparar sequências de DNA ou proteínas. Ele permite a pesquisa em bancos de dados de sequências para identificar similaridades com outras sequências conhecidas.  Interpretação dos resultados do BLAST Os resultados do BLAST são apresentados em uma tabela, com cada linha representando um "hit" - uma sequência do banco de dados que apresenta similaridade com a sequência de pesquisa. A tabela mostra o score da alinhamento, o E-value, a identidade e a cobertura. Score de Alinhamento Indica a qualidade do alinhamento, quanto maior o score, maior a similaridade. E-value Probabilidade de encontrar um alinhamento com um score tão alto por acaso. Identidade Percentual de posições idênticas entre a sequência de pesquisa e a sequência do hit. Cobertura Percentual da sequência de pesquisa que está coberta pela sequência do hit. Espaços com letras na linha do meio do alinhamento indicam conservação do aminoácido Traços horizontais representam “gaps” Query- sequência submetida ao programa Subject- sequência do banco de dados alinhada a sequência submetida Sinal + neste espaço indica uma substituição com escore positivo segundo a matriz de substituição utilizada Alinhamento de nucleotídeos Traços verticais representam identidade entre nucleotídeos 2) Selecionar um gene alvo: Gene actina de S. mansoni 3) Identificar a sequência em banco de dados 4) Selecionar um par de primers (sequências curtas de DNA simples fita) para serem usadas na PCR  O que é um primer? Um primer é uma sequência curta de ácidos nucleico que serve para iniciar a síntese de DNA.  Como “desenhar” um primer - O comprimento do primer influencia a uniqueness e as temperaturas de melting e anelamento. - Quanto maior o comprimento do primer, maior a possibilidade deste ser exclusivo; da mesma forma que maiores serão as temperaturas de melting e anelamento. - De uma forma geral, o comprimento do primer não deve ser inferior a 15 bases para assegurar a uniqueness. - Geralmente ~ 17-28 bases. - A existência desta faixa está baseada no fato de se buscar primers únicos que apresentem temperatura de anelamento dentro da faixa considerada como a mais adequada.  Como “desenhar” um primer Composição de Bases % GC 40 a 60 %​ -Temperatura de Melting, Tm – (a temperatura na qual metade das fitas de DNA está na forma de fitas simples e a outra metade na forma de dupla hélice) 65 a 75 °C/ ± 5 Temperatura de anelamento, Tanneal – É a temperatura na qual os primers se pareiam ao DNA molde. Pode ser calculada a partir da Tm. Tanneal = Tm_primer – 4° C Tanneal é o fator mais significante que afeta a estringência no anelamento do primer.  Como “desenhar” um primer -A estringência determina a especificidade no produto de DNA a ser amplificado. Tanneal : muito baixa menor estringência primer pareia em qualquer lugar. muito alta maior estringência primer pode não parear. https://www.thermofisher.com/br/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific- web-tools/tm-calculator.html  Como “desenhar” um primer Estrutura Interna dos primers Se os primers puderem parear com eles mesmos, ou parearem um com o outro mais facilmente do que com o DNA molde, a eficiência do PCR irá ser reduzida significativamente. Primers com estas características devem ser evitados.  Como “desenhar” um primer Deve existir somente um sítio de pareamento no DNA molde onde ocorra a ligação do primer, o que significa que a sequência dos primers é única na sequência do DNA molde. Adicionar tags ou sítios de restrição nas extremidades Verificar se as enzimas escolhidas não clivam a sequência da proteína que vai ser clonada (caso seja adicionado sítio para enzima de restrição) Selecionar enzimas de restrição que não cortem sua sequência  Ferrametas online para desenho de primers https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/oligonucleotides-primers-probes- genes/custom-dna-oligos/oligo-design-tools.html Sempre conferir o quadro de leitura do vetor + inserto! https://web.expasy.org/translate/ Ferramenta para traduzir a sequência de pares de base para aminoácidos - Expasy translate Proteína traduzida em todos os quadros de leitura possíveis  Etapas da clonagem 1) Selecionar o modelo do estudo: Schistosoma mansoni 2) Selecionar um gene alvo: Gene ORAI de S. mansoni, Codifica uma proteína de um canal de cálcio 3) Identificar a sequência em banco de dados 4) Selecionar um par de primers para serem usadas na PCR 5) Amplificar um fragmento de um gene do S. mansoni utilizando como ferramenta a Polymerase Chain Reaction (PCR) Qual será a fonte de DNA molde para amplificação da sequência de interesse por PCR? DNA genômico?? RNA - cDNA Transcrição e tradução: procariotos x eucariotos Extração de RNA Síntese de cDNA cDNA vai ser o molde utilizado na reação de PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) A amplificação é exponencial Detecção do material amplificado: Eletroforese em gel de agarose 6 - Isolamento e purificação do fragmento amplificado  Etapas da clonagem 1) Selecionar o modelo do estudo: Schistosoma mansoni 2) Selecionar um gene alvo: Gene ORAI de S. mansoni, Codifica uma proteína de um canal de cálcio 3) Identificar a sequência em banco de dados 4) Desenhar um par de primers para serem usadas na PCR 5) Amplificar um fragmento de um gene do S. mansoni utilizando como ferramenta a Polymerase Chain Reaction (PCR) 6 - Isolamento e purificação do fragmento amplificado Agora que vocês têm o inserto vamos falar sobre vetores Vetores em biologia molecular  Tipos de vetores Plasmídeos Propagação/ Expressão Cosmídeos Vetores derivados do fago lambda/ M13 Cromossomos artificiais derivados do fago P1 (PACs) Cromossomos artificiais bacterianos (BACs) Cromossomos artificiais de levedura (YACs)  Plasmídeos Pequenos segmentos circulares de DNA que podem se replicar de forma autônoma dentro dos organismos, independentemente do genoma Plasmídeos bacterianos são formados por DNA de cadeia dupla Na natureza, os plasmídeos possibilitam a transferência horizontal de material genético (incluindo resistência a antibióticos) Image: NIH National Human Genome Research Institute Plasmídeos Plasmídeos se replicam dentro das bactérias (Requer uma origem de replicação) Os plasmídeos podem ser purificados separadamente do DNA cromossômico de E. coli usando química simples Resinas de sílica = kits miniprep Introduzir um plasmídeo em uma bactéria é chamado de transformação Image: NIH National Human Genome Research Institute  Tipos de vetores Plasmídeos para biologia molecular Todo plasmídeo deve ter: Origem de replicação (Ori) Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC) Marcador de seleção (resistência a antibiótico (Neo, Kan, etc.)  Diferenças entre vetores de propagação e de expressão Vetores de propagação e de expressão são ferramentas essenciais na biologia molecular, mas possuem funções distintas. Vetores de propagação servem para clonar e amplificar DNA, enquanto vetores de expressão são projetados para expressar genes. Característica Vetores de Propagação Vetores de Expressão Objetivo Clonar e Amplificar DNA Expressar Genes Origem de Replicação, Sítios Origem de Replicação, Sítios de Restrição, Promotor, Sítio Componentes de Restrição, Genes de Ligação de Ribossomo, Marcadores Gene de Seleção Expressão Gênica Não Necessária Essencial  Preparação Vetor de clonagem (ou propagação) do vetor (pGEM-T) Sistemas T-A Vetores de expressão Os vetores de expressão contêm um gene de interesse (GOI) que codifica seu proteína de interesse (POI) O vetor também contém elementos regulatórios (por exemplo, promotores) que garantem que seu GOI seja expresso dentro do organismo de expressão Os vetores geralmente têm marcadores selecionáveis (por exemplo, resistência a antibióticos) para que você possa selecionar para expressão organismos que contenham o vetor 6 2  Origem de replicação (ori) Promove a ligação da maquinaria de replicação de DNA para copiar o plasmídeo (replicon) As origens de replicação bacteriana controlam o número de cópias dos plasmídeos Quantas moléculas de plasmídeo por bactéria, de 300! O vetor pcDNA3.1 possui a origem de replicação pUC, que tem um número alto de cópias  Origem de replicação (ori) É possível co-transformar múltiplos plasmídeos diferentes em uma única célula de E. coli. No entanto, as origens de replicação bacteriana podem competir pelos mesmos fatores regulatórios, o que pode levar à instabilidade dos plasmídeos. É necessário escolher plasmídeos de diferentes grupos de compatibilidade. Table: Addgene (https://blog.addgene.org/plasmid-101-origin-of-replication)  Marcadores de seleção Permitir que células com ou sem o plasmídeo sejam distinguidas. Para bactérias, geralmente são usados genes que codificam resistência a antibióticos. O antibiótico matará todas as bactérias que não possuem o plasmídeo (seleção letal). O plasmídeo pcDNA3.1 possui o gene β- lactamase (bla) para resistência à ampicilina. Outros antibióticos de seleção comuns são cloranfenicol e canamicina.  Promotores Promotores são as regiões que controlam a expressão dos genes a jusante (3’) (downstream). Representam o local de ligação para fatores de transcrição e o complexo de RNA polimerase. Esses promotores diferem entre organismos. pcDNA3.1 tem 5 promotores diferentes! Images: Addgene (https://www.addgene.org/mol-bio-reference/promoters/)  Promotores Promotor AmpR (bacteriano): Expressão constitutiva de baixo nível de b- lactamase (resistência à ampicilina) Promotor de CMV (mamífero): Promotor imediato do citomegalovírus humano, alto nível de expressão Promotor SV40 (mamífero): Expressão constitutiva Promotor T7 (bacteriano): Expressão constitutiva na presença de polimerase T7 Promotor lac (bacteriano): Expressão constitutiva na ausência do repressor lac (não usado em pcDNA3.1) 21/03/2023 67  Sitíos de clonagem múltipla (MCS) Esta é a região do plasmídeo onde o seu gene de interesse (GOI) está inserido Terá muitos locais de restrição presentes apenas uma vez no vetor Entre o local de início da transcrição (promotor) e o local final (terminador ou sinal poli(A)) 21/03/2023 68  Clonando seu GOI no vetor de expressão MCS Para expressão proteica geralmente clonamos o DNA complementar (cDNA), sem íntrons, no vetor Precisa ter: Um local de ligação ao ribossomo e um local de início da tradução Um códon de parada Todos os elementos proteicos in frame com seu GOI Imagem: Stephen Graham (CC BY 4.0) 21/03/2023 69  Locais de ligação ao ribossomo e metionina iniciadora A tradução da proteína é (geralmente) iniciada no códon da metionina (AUG) A frequência de iniciação depende do contexto do AUG Para uma tradução eficiente, é necessário um local de ligação ao ribossomo Expressão em mamíferos: sequência de consenso de Kozak: ACCAUGG Expressão bacteriana: sequência Shine/Dalgarno (SD): AGGAGGN(5-9)AUG Imagem: Wikimedia, Richard Wheeler (Zephyris) 2005 (CC SA 3.0) 21/03/2023 70  Coexpressão de múltiplas proteínas a partir de um vetor Para expressão bacteriana, você pode codificar múltiplas proteínas tendo múltiplas sequências Shine/Dalgarno e AUGs dentro de um transcrito (mensagem policistrônica). Para expressão em mamíferos, você pode usar locais de entrada do ribossomo interno viral (IRES) ou locais de stop-go de tradução (por exemplo, 2A do teschovírus suíno) para codificar múltiplas proteínas a partir de um transcrito. Image: Song Tan lab (https://sites.psu.edu/tanlab/polycistronic-expression/) Clonando seu GOI no vetor Muitas maneiras de clonar seu GOI no plasmídeo de sua escolha: Clonagem de restrição Clonagem de gateway Montagem Gibson A escolha será orientada por: Disponibilidade de sites de restrição Complexidade da clonagem (simples recortar e colar ou montagem complexa) Material inicial disponível Image: Stephen Graham (CC BY 4.0)  Endonucleases de restrição Enzimas bacterianas que defendem contra DNA estrangeiro (por exemplo, bacteriófagos) degradando-o. Ligam-se a sequências específicas de DNA (locais de restrição ou sequências de reconhecimento). Geralmente cortam ambas as fitas de DNA. Muitas vezes, são diméricas, cortando sequências palindrômicas (Tipo IIP). Frequentemente deixam saliências de fita simples (extremidades coesivas). Image: https://bioclimate.commons.gc.cuny.edu/analyzing-dna/restriction-enzymes/  Clonagem por enzimas de restrição 1. Usa endonucleases de restrição para digerir o inserto (contendo o GOI) e o plasmídeo, deixando extremidades coesivas compatíveis. 2. O inserto e o plasmídeo digeridos são isolados (Gels or PCR clean-up) 3. O inserto e o plasmídeo são misturados, ligados usando uma ligase de DNA (por exemplo, ligase de DNA do bacteriófago T4) e usados para transformar bactérias. Image: Addgene (https://blog.addgene.org/plasmids-101-restriction-cloning)  Construção do DNA recombinante EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI Clonagem não dirigida Clonagem dirigida EcoRI XhoII (Duas enzimas) XhoII EcoRI Montagem Gibson  Montagem Gibson Mistura de três enzimas: exonuclease 5' para gerar longos overhangs de fita simples Polimerase para preencher as ‘lacunas’ de fita simples quando as fitas de DNA se anelam Ligase para reparar quebras na estrutura do DNA As reações são isotérmicas (temperatura única) Pode ser usado para montagens grandes e complexas de DNA Image: New England Biolabs  Tags Adicionar tags ajuda a purificar e detectar sua POI Muitos vetores codificam tags Necessidade de clonar GOI no quadro de leitura com tag Vetores de fusão gênica pGEX-4T A proteína de fusão é constituída pela componente N-terminal de GST (tag) e pela componente C-terminal da proteína pretendida. Pode ser purificada numa coluna de purificação de afinidade de glutationa (ex. sefarose 4B glutationa) e clivada com trombina.  Funções do tag O tag é uma sequência curta de aminoácidos. Pode ser adicionado à extremidade N ou C do produto do gene clonado. Permite a detecção e purificação de proteínas. Peptideos de fusão específicos conferem vantagens à proteína alvo durante a expressão: aumentam a solubilidade, protegem da proteólise, melhoram a conformação, aumentam a produção. São vários os tags utilizados nos vectores de clonagem: His6 Glutationa-S-transferase (GST) Proteína de ligação a maltose (MBP) Proteína verde fluorescente (GFP) Epítopos  Purificação de proteínas com tag As proteínas com tag são purificadas em colunas de cromatografia de afinidade.  Gene repórter Gene repórter é um gene que produz uma proteína que pode ser detectada e quantificada utilizando um teste simples. Exemplos de genes repórter: GFP (Green fluorescent protein) lacZ (β-galactosidase) luc (luciferase) Utilização de genes repórter na localização de proteínas recombinantes A) Proteína com tag GFP B) Ratinho transgénico com GFP em fusão com uma proteína epitelial A) O gene recombinante codifica uma proteína de fusão que contém GFP C-terminal. B)O ratinho contém um transgene marcado com GFP expresso no corpo; o ratinho fluoresce quando iluminado com luz UV. Figure 19. 18 Genetics: From genes to Genomes, 2/e. (© McGraw-Hill Companies, 2004) Puncta formation by STIM and ORAI upon tapsigargin perfusion (TG) – TIRF microscopy EGFP human STIM mCherry-human ORAI 84  Qual plasmídeo devo usar? Número de cópias Alto se estiver fazendo propagação de DNA em E. coli para expressão downstream em outro vetor Menor se os produtos genéticos forem expressos em E. coli ou puderem ser tóxicos Marcadores de seleção Únicos (plasmídeos cotransformados ou genoma do hospedeiro não conferem resistência ao mesmo antibiótico) Origem de replicação Certifique-se de que seja compatível se estiver cotransformando plasmídeos Host de expressão Promotor e terminador corretos para seu organismo hospedeiro de expressão Tags Voltando aos nossos passos de clonagem com enzimas de restrição 1. Preparação do vetor 2. Preparação do inserto 3. Ligação do inserto no vetor 4. Seleção do sistema vetor/hospedeiro 5. Introdução de DNA recombinante no hospedeiro 6. Seleção de clones recombinantes 7. Identificação de clones recombinantes 6 - Isolamento e purificação do fragmento amplificado 7 - Preparo do inserto amplificado: digestão com enzimas de restrição As enzimas de restrição já foram escolhidas quando o primer foi sintetizado e o vetor escolhido (MCS)  8 - Preparo do vetor: enzimas de restrição Sempre digerir inserto e vetor com as mesmas enzimas  9 - Ligação do inserto no vetor Fragmento de DNA a Vetor de ser clonado clonagem DNA recombinante Clivagem com Ligação endonuclease pela DNA de restrição ligase  Transformação Métodos de introdução de DNA no hospedeiro Transformação Transfecção Eletroporação Microinjecção Bombardeamento Infecção viral  Transformação 10- Transformação em células competentes DNA recombinante Bactéria Células competentes Células bacterianas quimicamente modificadas para receberem o DNA recombinante ++++++++ ++++++++ ++++++++ ++++++++ Ca2+ competentes Eletrocompetentes  Etapa de transformação 420C por 30-40 segundos Nesta etapa o plasmídeo + inserto (DNA recombinante) são colocados dentro da célula hospedeira (ex. Bactéria)  Seleção 11 - Seleção de colônias Resistência a antibiótico Ampicilina X  Seleção de recombinantes Inativação insercional Seleção Lac Um meio de identificar bactérias recombinantes contendo vetores que carregam o gene lacZ'. As bactérias são plaqueadas num meio que contém um análogo da lactose (X-gal; hidrolisado pela enzima b-galactosidase) que dá uma cor azul na presença de atividade de β-galactosidase. Regulação do operon da lactose (operon lac)  Seleção Alguns vetores produzem colônias brancas ou azuis para auxiliarem na seleção Fragmento de DNA é inserido no meio do gene lacZ β-gal: degrada polissacarídeos X-gal: substrato cromogênico- forma Amp + X-‐gal + precipitado azul quando há atividade de β- IPTG gal IPTG: indutor da expressão de β-gal Expressão de β-galactosidase  Resultados possíveis da clonagem Bactérias com plasmídeos Bactérias sem plasmídeo Sem inserto = colônia Com inserto = colônia Não há crescimento de azul branca colônias  Identificação Métodos de identificação de clones recombinantes Análise do padrão de restrição PCR Sequenciamento de DNA Técnicas de screening PCR (de colônia) para confirmar que o DNA do inserto se encontra dentro do plasmídeo Fonte de DNA é a colônia bacteriana branca (contendo o DNA recombinante) 12 - Multiplicação e extração do DNA recombinante Miniprep Meio de cultura com antibiótico 13 - Confirmação do clone positivo por sequenciamento (reação de PCR pode introduzir mutações) Sequenciamento do inserto e comparação com as sequências depositadas no GenBank, com cálculo da porcentagem de similaridade  Expressão de proteína recombinante em E. coli Resumo Transformação de E. coli Preparo do inserto Vetor linearizado competente Plaqueamento e seleção dos clones recombinantes Reação de ligação Extração do DNAp e Plasmídeo recombinante Sequenciamento