Cloner un gène Spécialisé PDF

Cloner un gène spécifique Comment identifier les clones spécifiques à notre gène d’intérêt? Il faut cribler la banque d’ADN génomique ou d’ADNc à l’aide de sonde spécifique à notre gène d’intérêt....

Cloner un gène spécifique Comment identifier les clones spécifiques à notre gène d’intérêt? Il faut cribler la banque d’ADN génomique ou d’ADNc à l’aide de sonde spécifique à notre gène d’intérêt. Il existe des sondes qui reconnaissent l’ADN et d’autres qui reconnaissent les protéines. 183 Les méthodes de détection 184 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 1  La dénaturation et la renaturation de molécules double-brin d’ADN - Transformation des cellules - Principe de stringence 185 Identification à l’aide de sondes d’ADN 186 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 2  Cloner un gène spécifique D’où proviennent les sondes d’ADN? Oligonucléotides homologues à la séquence du gène recherché: Sonde: 3’- AAGCCTATTTATGGGCAAT - 5’ 5’ - …. AGCTAGGGATCTTCGGATAAATACCCGTTACGTACTATTGGAAGGA… - 3’ Fragment d’ADN cloné du gène chez la même espèce à l’étude ou chez un autre espèce. Fragment d’ADNc cloné qui sert de gabarit pour une sonde d’ARN 187 Cloner un gène spécifique Comment s’effectue le marquage de la sonde? Marquage radioactif à l’aide du 32P-dCTP ou à l’aide d’un nucléotide DIG-11-dUTP (luminescence/fluorescence/colorimétrique): Oligo: marquage en 3’ à l’aide de la terminale transférase Fragment d’ADN (cloné du gène chez la même espèce à l’étude ou chez un autre espèce): marquage aléatoire Ref: lifescience.roche.com 188 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 3  Cloner un gène spécifique « Random primed labeling » Marquage par PCR Nick translation Ref: lifescience.roche.com 189 Cloner un gène spécifique Marquage en 3’ avec ajout d’environ 50 nucléotides Marquage en 3’ unique Sondes d’ARN Ref: lifescience.roche.com 190 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 4  Cloner un gène spécifique Méthodes de détection à la suite de l’hybridation de la sonde marquée avec la DIG: Cheluminescence ou réaction colorimétrique Fluorescence Ref: lifescience.roche.com 191 Ref: lifescience.roche.com 192 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 5  Cloner un gène spécifique Il est possible de fabriquer des oligonucléotides à partir de la séquence d’une protéine ou peptide isolé: 193 Cloner un gène spécifique Les sondes qui reconnaissent les protéines (anticorps): 194 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 6  Cloner un gène spécifique Le clonage positionnel: marche sur le chromosome 195 Cloner un gène spécifique Le clonage d’un gène par étiquetage (tag): Muter un gène par l’insertion d’un ADN transformant ou d’un transposon permet d’étiqueter le gène avant de l’isoler. 196 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 7  Utilisation de l’ADN cloné 1. L’ADN est utilisé comme sonde. 2. Le criblage destiné à trouver un acide nucléique spécifique dans un mélange. L’ADN digéré de 5 clones séparé sur gel d’agarose: 197 Les transferts de type Southern et Northern * Notez que le principe des analyses de type Western est identique mais la sonde est un anticorps 198 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 8  199 200 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 9  201 202 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 10  203 204 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 11  Utilisation de l’ADN cloné Exemple d’un transfert de type Southern ADN mitochondrial de neurospora de souches géographique distinctes 205 Utilisation de l’ADN cloné Analyses de types Southern, Northern et Western du gène X 206 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 12  207 Exemple de méthodes de détection 208 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 13  Analyses de type Western et immunofluores cence 209 Utilisation de l’ADN cloné Séquençage de l’ADN: Déterminer la séquence d’un gène cloné à l’aide de didéoxynucléotides (ddNTPs; ils ne contiennent pas d’extrémité 3’-OH) => Méthode de Fred Sanger 3’ 210 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 14  Utilisation de l’ADN cloné Séquençage de l’ADN par la méthode de Sanger (sonde marquée au 32P) 211 Utilisation de l’ADN cloné Séquençage de l’ADN par la méthode de Sanger (sonde marquée avec la fluorescence) => séquenceurs automatiques pouvant lire jusqu’à 1 kb 212 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 15  213 214 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 16  Pyroséquençage (next generation sequencing, deep sequencing) Étape 1 Un amplicon PCR simple brin qui sert de matrice et incubé avec les enzymes, ADN polymérase, l'ATP sulfurylase, luciférase, apyrase ainsi que les substrats, adénosine 5' phosphosulfate (APS), luciférine et hybridation avec une amorce de séquençage. Ref: Qiagen.com 215 Pyroséquençage (next generation sequencing, deep sequencing) Étape 2 Le premier déoxribonucleotide triphosphate (dNTP) est ajouté à la réaction. L’ADN polymérase catalyse l'incorporation de la triphosphate désoxyribo- nucléotides dans le brin d'ADN, si elle est complémentaire à la base dans le brin de modèle. Chaque événement d’incorporation est accompagné de libération de pyrophosphate (IPP) dans une quantité équimolaire à la quantité de nucléotides incorporés. Ref: Qiagen.com 216 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 17  Pyroséquençage (next generation sequencing, deep sequencing) Étape 3 L'ATP sulfurylase convertit le PPi ATP en présence d'adénosine 5' phosphosulfate (APS). Cette ATP entraîne la conversion médiée par la luciférase de luciférine oxyluciferin qui génère la lumière visible dans les montants qui sont proportionnels au niveau d'ATP. La lumière produite dans la réaction catalysée par la luciférase est détectée par une caméra couplé (CCD) et considérée comme un pic dans la sortie de données brutes (Pyrogram). La hauteur de chaque pic (signal lumineux) est proportionnelle au nombre de nucléotides incorporés. Ref: Qiagen.com 217 Pyroséquençage (next generation sequencing, deep sequencing) Étape 4 L’Apyrase, une enzyme dégradant les nucléotides, dégrade continuellement des nucléotides et l'ATP. Lorsque la dégradation est terminée, un autre nucléotide est ajouté. Ref: Qiagen.com 218 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 18  Pyroséquençage (next generation sequencing, deep sequencing) Étape 5 L'addition de dNTPs est exécutée séquentiellement. Il devrait être noté que la désoxyadénosine alfa-thio triphosphate (dATP·S) est utilisé comme substitut de la naturelle adénosine triphosphate (dATP) car elle est utilisée efficacement par l'ADN polymérase, mais pas reconnue par la luciférase. Comme le processus se poursuit, le brin d'ADN complémentaire est construit et la séquence nucléotidique est déterminée par les pics de signal dans la trace du Pyrogram. Source: Qiagen http://www.pyrosequencing.com/DynPage.aspx?id=7454 219 Pyroséquençage (next generation sequencing, deep sequencing) 1977: Maxam and Gilbert (chemical degradation sequencing) 1.5 Kb/année 1998: ABI 3700 (capillary array sequencers) 20 Mb/année 2008: ABI SOLiD Image array sequencers 150 Gb/année 2010: 2000 Gb/année Projet Génome Humain: Débuté en 1990 (estimé 15 ans, 5-10 milliard de $) Fin: 2003-coût 3 milliard de $ En 2018 fin du 100K genome project au UK a couté la 1/2 du prix. Aujourd’hui: 1 milliard de base par jour et plus =3 jours pour séquencer un génome humain: 600$ http://www.youtube.com/watch?v=bFNjxKHP8Jc 220 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 19  Pyroséquençage (next generation sequencing, deep sequencing) 221 Pyroséquençage (next generation sequencing, deep sequencing) 222 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 20  Utilisation de l’ADN cloné Les séquences sont analysées avec les ordinateurs pour trouver (selon les 6 cadres de lecture ouverts (ORF) possible) un codon d’initiation ATG et un codon de terminaison TAA/TAG/TGA. 223 Détecter et amplifier des séquences grâce à la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) Utilisation de la Taq DNA polymérase (origine de la bactérie Thermus aquaticus) 224 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 21  PCR: La nouvelle technologie Real-Time PCR: SYBR Green A) C) B) 225 PCR: La nouvelle technologie TaqMan principe RT-PCR 226 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 22  PCR: La nouvelle technologie Real-Time PCR 227 Utilisation de l’ADN cloné Déterminer la position des gènes sur des cartes de restriction 228 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 23  Utilisation de l’ADN cloné H B H+B Exercice 10Kb 8Kb 6Kb 2Kb 229 Utilisation de l’ADN cloné 230 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 24  L’alcaptonurie 231 BLM1007 (Biologie Moléculaire Médicale), Automne 2024, Eric Asselin, Ph.D 25