Biologie Moléculaire - Examen 3C (24/09/24)

Biologie moléculaire 3c EXTRACTION ET ANALYSE DES...

Biologie moléculaire 3c EXTRACTION ET ANALYSE DES RT ACIDES NUCLEIQUES 3 Semaine et jour : 24/09/24 RT : Vanessa AYASSAMY Professeur : M.BONIOTTO RB : Sofia OLIVE-PONTES Plan du cours I. MESURES D’ACIDES NUCLEIQUES.................................................................................. 2 A. Enzymes de restriction pour analyser l’ADN........................................................................... 2 II. CLONAGE............................................................................................................................ 3 A. Clonage « classique »................................................................................................................ 3 B. Clonage d’un fragment dans un vecteur : endonucléases de restriction et ligase............... 4 C. Clonage par coupure franche.................................................................................................... 5 D. Clonage directionel.................................................................................................................... 5 III. ANALYSE DE L’ADN........................................................................................................... 6 A. Le southern Blot......................................................................................................................... 6 B. Northern blot.............................................................................................................................. 8 C. Sondes nucléotidiques.............................................................................................................. 9 IV. HYBRIDATION MOLECULAIRE........................................................................................ 10 A. Sondes a ARN ou ADN............................................................................................................ 10 B. Le Tm........................................................................................................................................ 11 C. Le tringence.............................................................................................................................. 12 D. Sondes nucléotidiques – application...................................................................................... 12 V. QCM D’ENTRAINEMENT.................................................................................................. 13 ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 1 sur 13  I. MESURES D’ACIDES NUCLEIQUES A. ENZYMES DE RESTRICTION POUR ANALYSER L’ADN 1. Cartographie de l’ADN par les enzymes de restriction Les analyses cliniques et médico- légales nécessitent la caractérisation de gènes ou de régions génomiques spécifiques au niveau moléculaire. En raison de leur activité spécifique à la séquence, les endonucléases de restriction constituent un outil pratique pour la caractérisation moléculaire de l’ADN. L'emplacement des sites de restriction diffère selon les molécules d'ADN ayant des séquences différentes. Pour faire une carte de restriction, l'ADN est exposé à plusieurs enzymes de restriction séparément et ensuite dans différentes combinaisons. 2. Polymorphismes de longueur de fragments de restriction Les molécules d'ADN correspondantes dans deux individus, telles que les différentes versions d'un même gène provenant des individus différents, ont normalement des séquences identiques. Les différences occasionnelles dans la séquence de base peuvent entraîner des différences correspondantes dans les sites de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnaît une séquence spécifique et si une seule base de cette séquence de reconnaissance est modifiée, l'enzyme ne pourra plus couper l’ADN. Par conséquent, les sites de restriction présents dans une version d'une séquence peuvent être absents dans des autres. Si deux molécules d'ADN analogues mais différentes sont coupées par la même enzyme de restriction, on obtient des segments de longueur différente. Une différence entre deux séquences d'ADN qui affecte un site de restriction est appelée polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP). Ces RFLP étaient autrefois largement utilisées dans les analyses médico-légales, mais elles ont été largement remplacées par des méthodes basées sur la PCR. ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 2 sur 13 L’intérêt de cette méthode est de détecter des variations à l’intérieur de l’ADN. Il est nécessaire de rechercher le polymorphisme de séquence (SNP). Cette technique est utilisée par exemple dans le cas de la drépanocytose. S’il existe un polymorphisme associé à un site de restriction, il faut faire une analyse des fragments de restriction. Ici, on voit qu’on a amplifié les fragments qui contiennent cette variation, c’est le principe de la PCR. Pour cette analyse on effectue ces différentes étapes. II. CLONAGE A. CLONAGE « CLASSIQUE » 1. Clonage classique : endonucléases de restriction et ligase Le clonage classique, permet de lier l’ADN double brin ensemble grâce à la combinaison des endonucléases de restriction et de la ligase. ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 3 sur 13  2. La ligase, enzyme qui va relier l’ADN L'ADN ligase lie de manière covalente les fragments du brin retardé pendant la réplication de l’ADN. Si l'ADN ligase trouve deux fragments d'ADN se touchant bout à bout, elle les ligature ensemble. En pratique, les segments d'ADN dont les extrémités collantes correspondent auront tendance à rester attachés la plupart du temps et, par conséquent, l'ADN ligase les réunira efficacement. Comme la ligase bactérienne ne peut pas du tout joindre les extrémités franches, la ligase T4 est normalement utilisée en biologie moléculaire car elle peut joindre les extrémités émoussées si nécessaire. B. CLONAGE D’UN FRAGMENT DANS UN VECTEUR : ENDONUCLEASES DE RESTRICTION ET LIGASE Cette méthode utilise les plasmides pour insérer de l’ADN exogène dans une cellule. Usuellement on utilise les enzymes de restriction pour couper les plasmides afin de faire rentrer l’ADN d’intérêt dans le plasmide. Les plasmides contiennent des éléments pour faire transcrire l’ADN exogène. Ici l’idée est de couper le plasmide avec des enzymes particulières pour ensuite les relier ensemble avec de la ligase. ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 4 sur 13  C. CLONAGE PAR COUPURE FRANCHE Cette méthode génère 3 fragments A B C et des extrémités franches (non dépassantes) qui ne peuvent pas s’hybrider entre elles : extrémités non cohésives. Ces extrémités peuvent-être associées entre elles par une DNA ligase (liaison phospho-ester). Deux possibilités pour la ligation :  Réassociation des 3 fragments et reconstitution du fragment de départ avec les sites Pvu II ou Sma I.  Réassociation différente donnant un nouveau fragment d’ADN recombiné (B inversé) sans reformation des sites de restriction. D. CLONAGE DIRECTIONEL 1. Extrémités adhésives Il y a 50% des plasmides qui n’ont pas notre séquence d’intérêt. Pour améliorer cela, on utilise le clonage directionnel, n’utilisant que les extrémités adhésives. ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 5 sur 13  2. Extrémités adhésives et deux endonucléases de digestion On peut effectuer la même action, avec deux endonucléases de digestion. Après avoir obtenu notre fragment comme le montre le schéma ci-contre. A l’aide des plasmides, on va avoir une complémentarité entre les extrémités adhésives. Ainsi on va finir par obtenir un plasmide recombinant. Ceci est un clonage directionnel, on utilise deux plasmides différents. III. ANALYSE DE L’ADN A. LE SOUTHERN BLOT 1. Généralités Le Southern blot doit son nom à Edwin Southern, qui a été le premier à présenter cette procédure. Dans le Southern l'ADN génomique est isolé et coupé avec des enzymes de restriction. Les fragments sont séparés par électrophorèse sur gel, dénaturés, et ensuite transférés sur un support solide support solide tel que la nitrocellulose. Dans les dernières étapes de la procédure, les fragments d'ADN sont exposés à une sonde marquée (ADN ou ARN complémentaire) qui est complémentaire à la région d'intérêt. Le signal de la sonde est détecté pour indiquer la présence ou l'absence (manque de signal) de la séquence en question et pour déterminer la taille de la région. Le Southern blots sont toujours utilisés pour la caractérisation de grandes régions (10 kb à plus de 100 kb) et dans la génétique médicale dans les maladies associées aux répétitions de trinucléotides (X-Fragile, Huntington Disease, Kennedy disease etc). ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 6 sur 13  2. Premières étapes La première étape de la procédure du Southern blot est la digestion de l'ADN testé avec des enzymes de restriction. Le choix d'enzymes utilisés dépendra du locus génétique et de l'application. Les fragments résultant des digestions de restriction sont résolus par électrophorèse sur gel d’agarose. L'ADN génomique coupé avec des enzymes de restriction devrait produire un frottis représentant des milliards de fragments de toutes tailles libérées par la digestion enzymatique. A cette étape-là, les fragments de restriction contenant la séquence cible à analyser ne sont évidemment pas distinguables dans la collection d'autres fragments qui n'ont pas la séquence cible. Les fragments cibles peuvent être détectés par hybridation avec une séquence complémentaire d'ADN ou d'ARN monocaténaire marqué avec un signal détectable. 3. Fixation de l’ADN sur la nitrocellulose Pour cela, on utilise une sonde qui est complémentaire (elle va lier le fragment spécifique qui va permettre de l’identifier). On commence par le Blotting : transfert du contenu du gel sur un support solide Voici les différentes étapes de traitement du gel : 1. TRAITEMENT DE L'ADN DANS LE GEL D'AGAROSE  Dépurination : HCl -> va aider la dénaturation pour des molécules d’ADN de taille importante  Dénaturation : NaOH  Neutralisation : Tris-HCl IM pH 7.8 (+NaCl) 2. TRANSFERT DE L'ADN SUR MEMBRANE DE NYLON (Southern blot) ATTENTION : Pour l’ARN (simple brin) pas de traitement du gel ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 7 sur 13  4. Hybridation et révélation Après avoir fait le transfert de l’ADN sur la membrane de nylon, il est nécessaire de fixer l’ADN sur le nylon à l’ultraviolet et à 80°C. Il faut ensuite révéler une séquence spécifique par hybridation à une sonde nucléique. 3.FIXATION DE L'ADN SUR LE NYLON  Ultra-violet, +80°C 4.REVELATION D'UNE SEQUENCE SPECIFIQUE Hybridation à une sonde nucléique Voici les étapes de l’hybridation :  Préhybridation  Hybridation  Lavage  Révélation Applications et types du blotting:  Identification de fragments d’ADN par hybridation (Southern blot ou Dot blot)  Identification d’ARNm par hybridation (Northern blot)  Identification de colonies bactériennes par hybridation de leur ADN  Autres types de blotting: Western, Eastern, Far Eastern. B. NORTHERN BLOT 1. Généralités La technique du northern blot, une modification de la technique du Southern blot, a été conçue pour étudier la structure et la quantité d'ARN. Le northern blot a été également utilisé pour étudier les anomalies structurelles de l’ARN résultant d'aberrations dans la synthèse ou le traitement, telles que l'épissage alternatif. Pour réaliser un northern blot, on utilise des méthodes d'isolement des acides nucléiques pour l’ARN. Les échantillons d'ARN sont déposés directement sur des gels d'agarose pour l'électrophorèse qui est effectuée dans des conditions dénaturantes pour une évaluation précise de la taille des transcrits. Comme la dénaturation est maintenue pendant l'électrophorèse, une étape de dénaturation séparée n'est pas nécessaire pour les northern blots. Bien qu'il soit encore utilisé dans certaines applications de recherche, le northern blot a été en grande partie remplacé par des technologies plus efficaces et moins exigeantes en termes d'échantillons. ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 8 sur 13  2. Southern/Northern Blots – Overview C. SONDES NUCLEOTIDIQUES 1. Les marqueurs Les marqueurs peuvent être :  Radioactifs : nucléotides radioactifs (32P, 35S, 3H) en α ou g  Froids : ligand couplé sur la base d’un nucléotide (biotine, digoxygénine, fluorochrome. La révélation peut être directe ou indirecte :  Révélation Directe Sondes radioactives : autoradiographie Sondes Fluorescentes : fluorimétrie (première image).  Révélation Indirecte : Sondes marquées à la digoxygénine ou biotine (deux dernières images). ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 9 sur 13  2. Les techniques de marquage Les techniques de marquage des sondes ADN :  Aux extrémités 5’ Transfert d’un phosphate R* à un nucléotide (γ-NTP) par la T4 kinase  Aux extrémités 3’ de la sonde Incorporation, par la T.Transférase (DNA poL), d’un nucléotide marqué ex : dNTP marqué sur le PO4 en α ou avec base couplée à un ligand  Uniforme (multiamorçage aléatoire) Incorporation, par une DNA polymérase, de nucléotides marqués Les techniques de marquage des sondes ARN :  Uniforme : transcription in vitro d’un ARN à partir d’un fragment d’ADN Synthèse d’un ARN par une RNA Pol avec incorporation de ribonucléotides marqués. IV. HYBRIDATION MOLECULAIRE A. SONDES A ARN OU ADN Hybridation moléculaire : Association de deux chaines d’acides nucléiques (ARN ouADN) par appariements de leurs bases complémentaires. L’hybridation moléculaire repose sur :  La complémentarité de bases  La réversibilité du processus de séparation des deux brins (dénaturation/ renaturation) Dénaturation obtenue en :  Augmentant la température  En changeant le milieu : o Diminuant la concentration en sels o Ajoutant des agents dénaturants : urée, formamide, formaldéhyde. ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 10 sur 13  B. LE TM 1. Généralités Hybridation : association de deux brins (ADN ou ARN) par des liaisons hydrogènes entre leurs bases complémentaires. Température de fusion de l'hybride (Tm) : Température à laquelle 50% des molécules passent de l’état double brin à l’état simple brin. Cette température correspond au point d’inflexion de la courbe D.O. à 260 nm de l’ADN en solution en fonction de la température. La température de fusion dépend :  De la taille de la séquence (n)  Du % de bases complémentaires (% homologie)  De la composition en nucléotides (% G+C)  De la concentration en sel (ex. Na+)  De la présence d'agents dénaturants (ex. formamide). NB : Il faut savoir qu’il est plus simple de dénaturer des liaisons A-T que les C-G. 2. Calcul de la Tm Pour deux séquences ADN de taille supérieure à 50 nucléotides et 100% homologues le Tm peut être calculé par la formule : Tm = 81.5°C + 16.6 (log Na+ ) + 0.41 (% de G+C)- 0.63 (%Formamide)-600/n. Dans le cas de séquences partiellement homologues, il faut enlever 1°C par % de divergence. Si la taille est inférieure à 14 nucléotides, la taille et la composition en bases sont les facteurs déterminants, on utilise alors la formule simplifiée : Tm = 4°C (C+G) + 2°C (A+T). Cette formule donne aussi une bonne approximation du Tm jusqu’à 25 nucléotides. Entre 25 et 50 nucléotides d’autres formules sont utilisées. NB : La première formule n’est pas à connaitre alors que la deuxième est importante. ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 11 sur 13  C. LE TRINGENCE Stringence : degré d'empêchement des hybridations non spécifiques. Elle est définie par l’ensemble des conditions utilisées pour l’hybridation (température, concentration en sels, concentration en agents dénaturants). A forte stringence (température proche du Tm) seules les séquences homologues sont appariées (hybridation spécifique). A faible stringence (température inférieure au Tm) il y a appariement de séquences qui sont seulement partiellement homologues (hybridation peu spécifique). Exemples :  Préhybridation Etape de saturation de sites de fixations non spécifiques par addition d’ADN de sperme de saumon dans le milieu de préhybridation Température 15-20°C < Tm -> faible stringence  Hybridation Ajout de la sonde préalablement dénaturée (linéaire et simple brin) soit par chauffage soit par la soude (si ADN). Mêmes conditions de stringence que la préhybridation -> faible stringence  Lavages Eliminer les fixations non spécifiques de la sonde : augmenter la stringence Deux paramètres : on augmente la température et/ou on diminue la concentration en sel -> >>>>> stringence  Révélation des hybrides Dépendante du système de marquage et de l’objet hybridé. D. SONDES NUCLEOTIDIQUES – APPLICATION Southern blot : carte de restriction, RFLP, identification de bandes. Northern blot : appréciation de la distribution d’un ARN dans un tissu, son abondance, sa taille, les intermédiaires d’épissage et de maturation. Dot blot : dépôt en dot d’ARN ou d’ADN, qualitatif. Criblage de banque : isolement d’un clone contenant la séquence recherchée. FISH : hybridation in situ en fluorescence, localisation d’un gène sur les chromosomes. HIS : hybridation in situ, localisation du site de synthèse de la protéine dans un tissu. Microarrays : analyse quantitative de l’expression d’un grand nombre de gènes. La sonde (séquence connue) est immobilisée sur un support et c’est la cible qui est marquée. NB rt : reprise à l’identique du rt de l’an dernier pour les parties III. A) 3 et 4 et III. C) ainsi que II. D) 1 et 2. ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 12 sur 13  V. QCM D’ENTRAINEMENT QCM1 : Parmi ces propositions quelles sont la ou les propositions exactes ? A) Le clonage classique lie l’ADN double brin avec la combinaison des endonucléases de restriction et de la ligase B) L'ADN ligase lie de manière non covalente les fragments du brin retardé pendant la réplication de l’ADN. C) La ligase T4 est peu utilisée en biologie moléculaire. D) On utilise les enzymes de restriction pour couper les plasmides afin de faire rentrer l’ADN d’intérêt dans le plasmide. E) Le clonage par coupure franche génère 3 fragments A, B et C. QCM2 : Parmi ces propositions quelles sont la ou les propositions exactes ? A) Le clonage directionnel utilise uniquement les extrémités adhésives. B) Dans le Southern l'ADN génomique est isolé. C) La première étape de la procédure du Southern blot est la dénaturation de l'ADN. D) Le Blotting est le transfert du contenu du gel sur un support solide. E) Après le transfert de l’ADN sur la membrane de nylon, l’ADN est fixé à 90°C. QCM3 : Parmi ces propositions quelles sont la ou les propositions exactes ? A) Le northern blot a été conçu pour étudier la structure et la quantité d'ADN. B) La dénaturation séparée est obligatoire pour les northern blots. C) Les marqueurs des sondes nucléotidiques peuvent être radioactifs et froids. D) L’hybridation moléculaire est l’association de deux chaines d’acides nucléiques par appariements de leurs bases complémentaires. E) A faible stringence seules les séquences homologues sont appariées. QCM1 QCM2 QCM3 A) VRAI A) VRAI A) FAUX B) FAUX B) VRAI B) FAUX C) FAUX C) FAUX C) VRAI D) VRAI D) VRAI D) VRAI E) VRAI E) FAUX E) FAUX ©Tutorat Paris XII 2024/2025 – La cellule : N°3c – Ce document n’est pas le support officiel Page 13 sur 13