Bioinformática: Questões sobre BLAST e Clonagem

Clonagem Molecular e Vetores de Clonagem

• A clonagem molecular é um processo que permite a amplificação seletiva de um determinado gene ou segmento de DNA.
• Técnicas que viabilizaram o processo de clonagem molecular: enzimas de restrição, ligase, polimerase, vetores de clonagem e métodos de transformação de células eucarióticas e procarióticas.
• A transformação bacteriana (1928, Frederick Griffith) mostrou que bactérias da cepa R teriam adquirido um "princípio transformante" de bactérias S mortas por calor, tornando-se virulentas.
• Aplicações da clonagem molecular:
  • Ferramentas para pesquisa básica (estrutura e função de proteínas).
  • Diagnóstico (produção em larga escala de proteínas recombinantes, como kits de ELISA).
  • Fármacos (anticorpos terapêuticos, vacinas, hormônios, fatores de coagulação).
  • Produção de organismos transgênicos (melhores índices de produtividade, imunidade a doenças e pragas, modelos de estudo em pesquisa, animais knockouts).
  • Insulina humana (biofármaco recombinante, marco para pesquisa genética e biotecnológica).

Clonagem e Expressão de Proteínas Recombinantes

• Clonagem e expressão de proteínas recombinantes são processos essenciais em biologia molecular.
• A expressão de proteínas recombinantes é útil por permitir:
  • maior facilidade de purificação
  • evitar contaminação com outras proteínas do tecido original
  • engenharia de proteínas
  • um processo controlado
  • maior especificidade e quantidade de produtos

Etapas para clonagem e expressão de uma proteína

• Selecionar um modelo de estudo (ex. Schistosoma mansoni)
• Selecionar um gene alvo (ex. gene actina de S. mansoni
• Identificar a sequência em banco de dados (NCBI).
• Selecionar um par de primers para a reação em cadeia da polimerase (PCR)

Bases de dados

• NCBI (National Center for Biotechnology Information): um dos maiores repositórios de informações biológicas existentes, parte do NIH (National Institutes of Health) dos EUA.

Sequência em formato FASTA

• Formato mais utilizado para reconhecimento de sequências por programas de bioinformática; a primeira linha possui o sinal > seguido da descrição da sequência e as linhas subsequentes contêm a sequência propriamente dita.

Necessidade de sequência de nucleotídeos para clonagem

• A sequência de nucleotídeos é fundamental para a clonagem.
• A obtenção da sequência nucleotídica de um gene de interesse é necessária para a criação de primers para PCR, permitindo a amplificação do gene.
• Bases de dados de sequências (como o NCBI) são usadas para identificar sequências de nucleotídeos de genes.
  • Ex. WormBase Parasite, EnsemblPlants

Ferramentas online

• Ferramentas online (como iBeetle-Base e Expaasy Translate) podem auxiliar na pesquisa e manipulação de sequências.

O BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

• Ferramenta utilizada para comparar sequências de DNA e proteínas, identificando similaridades com outras sequências conhecidas.
• As ferramentas BLAST em ambientes WEB (por exemplo, básico local de alinhamento (BLAST) ferramenta de busca, ferramenta em ambiente web) são utilizadas para identificar segmentos de DNA ou proteína que apresentem homologia com uma sequência de interesse.

Interpretação dos resultados do BLAST

• A análise dos resultados do BLAST fornece insight sobre a similaridade entre sequências.
• As informações fornecidas incluem:
  • Score de alinhamento (indicativo da qualidade do alinhamento)
  • E-value (probabilidade de encontrar um alinhamento tão alto por acaso)
  • Identidade (índice de posições idênticas na sequência)
  • Cobertura (proporção da sequência da query coberta pelo alinhamento)

Alinhamento de nucleotídeos

• O alinhamento de nucleotídeos, com base em similaridades, pode identificar regiões de identidade ou similaridade entre nucleotídeos de sequências diferentes.

Primers (sequências curtas de DNA simples fita)

• Primers são sequências curtas de ácidos nucleicos utilizadas para iniciar a síntese de DNA via PCR.
• O comprimento influencia a especificidade (quanto maior, maior a especificidade) e as temperaturas de melting e anelamento (quanto maior, maiores as temperaturas).
• Geralmente, os primers devem ter entre 17-28 bases de comprimento.

Como "desenhar" um primer

• Escolha o comprimento entre 17 e 28 bases
• O número de GC está entre 40% e 60%
• A temperatura de melting (Tm) é entre 65ºC e 75ºC
• Evita a formação de hairpin e cross-dimer dos mesmos primers

Temperatura de Melting (Tm) e Temperatura de anelamento (Tanel)

• Tm: Temperatura em que metade das fitas de DNA está na forma de fitas simples.
• Tanel: Temperatura em que os primers pareiam ao DNA molde.

Estrutura Interna dos Primers

• Primers devem ser evitados caso haja possibilidade de pareamento entre eles.
• Comprimento entre 17 e 28 bases é adequado.
• Quantidade de GC entre 40 e 60%.
• Tm entre 65°C e 75°C
• Evita-se a formação de hairpin e cross-dimer.

Enzimas de restrição

• Enzimas, de origem bacteriana, são usadas para digerir o DNA em locais específicos - sítios de restrição - gerando extremidades coesivas compatíveis.
• Essas enzimas são importantes na clonagem de genes.

Enzimas de restrição que podem ser usadas:

• Exemplos: Eco RI, Hind III

Construção do DNA recombinante

• Clonagem não dirigida: use uma única enzima de restrição no vetor e no gene que será inserido, sem preocupar com o alinhamento do quadro de leitura.
• Clonagem dirigida: use duas enzimas de restrição no vetor e no gene que será inserido, para garantir alinhamento exato no quadro de leitura.

Montagem Gibson

• Técnica de clonagem que permite a associação de fragmentos de DNA com pontas complementares usando uma mistura de enzimas.
• A técnica é isotérmica, o que facilita o procedimento.
• Permite montagens grandes e complexas de DNA

Tags

• Adicionar tags pode auxiliar na purificação das proteínas recombinantes e na sua identificação.
• Vetores geneticamente modificados para fornecer tags podem ser usados.

Vetores de fusão gênica pGEX-4T

• Usados para purificar proteínas recombinantes.
• A proteína de fusão inclui a etiqueta e a proteína de interesse, que permite a purificação usando cromatografia de afinidade.

Origem de replicação (ori)

• Origem de replicação (ori) promove a ligação da maquinaria de replicação de DNA.
• As origens de replicação bacteriana controlam a número de cópias de plasmídeos.
• Plasmídeo pcDNA3.1 possui origem de replicação (ori) pUC.

Marcadores de seleção

• Marcadores selecionáveis garantem que apenas as células que receberam o plasmídeo recombinante sobrevivam.

Promotores

• Promotores são sequências de DNA que controlam a expressão gênica, garantindo que um gene de interesse seja expresso no organismo, dentro do vetor. (Por exemplo: Promotor Amp, CMV, sv40, t7, lac)

Sítios de clonagem múltipla (MCS)

• MCS são regiões dos plasmídeos contendo múltiplos sítios de restrição.
• Podem ser usados para clonar genes de interesse.
• Localiza-se entre o promotor e o terminador do gene alvo.

PCR (reação em cadeia da polimerase)

• A PCR é uma técnica para amplificar uma sequência específica de DNA in vitro.
• Técnica usada para a amplificação de genes que serão clonado.
• Há três passos principais: desnaturação, anelamento e extensão.

Eletroforese em gel de agarose

• Técnica usada para separar e visualizar fragmentos de DNA de diferentes tamanhos.
• Importantes para verificar se houve amplificação do DNA esperado durante o processo de clonagem.

Isolamento e purificação do fragmento amplificado

• O isolamento e purificação do fragmento amplificado é crucial para uma clonagem eficaz.
• Utilização de kits (PureLink™ Gel Extraction) que permitem isolar e purificar fragmentos de DNA a partir de géis de agarose.

Métodos de introdução de DNA no hospedeiro

• Transformação, transfecção, eletroporação, microinjeção, bombardeamento, infecção viral.

Transformação em células competentes

• Transformação é o processo de introduzir DNA estranho em uma célula.
• Células competentes são mais propensas a absorver DNA externo.
• Existem métodos para tornar as células competentes (calor ou eletroporação)
• Células competentes ca²⁺ ou eletrocompetentes

Seleção de colônias

• Métodos de seleção permitem identificar células que expressam o plasmídeo recombinante.
• A seleção é feita usando meio de cultura com antibiótico resistente, identificando as colônias que sobreviveram.
• Uso de meio de cultura contendo um análogo da lactose e um indutor, permitindo a identificação de colônias recombinantes pela cor das colônias. (A colônia que conter o gene recombinante mostrará cor diferente da outra colônia)

Métodos de identificação de clones recombinantes

• Análise de padrões de restrição
• PCR
• Sequenciamento de DNA

Multiplicação e extração do DNA recombinante

• Multiplicação do DNA recombinante em um hospedeiro adequado (ex. E. coli).
• Extração do DNA plasmídico de clonas bacterianas. (Ex. kit miniprep)

Confirmação do clone positivo por sequenciamento

• Sequenciamento do inserto para verificar se ele está no vetor como esperado.
• Comparação com sequências de bancos de dados (GenBank) para validar o clone.

Expressão de proteína recombinante em E. coli

• Preparo do Inserto
• Vetor linearizado
• Transformação de E. coli competente
• Reação de ligação
• Plaqueamento e seleção de clones recombinantes
• Extração de DNA
• Sequenciamento

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