Bioinformática: Questões sobre BLAST e Clonagem

Podcast

Play an AI-generated podcast conversation about this lesson

Questions and Answers

Qual é a principal função do BLAST na bioinformática?

Armazenar dados de pesquisa biomédica.

Comparar sequências de DNA ou proteínas. (correct)

Identificar estruturas tridimensionais de proteínas.

Realizar clonagem de sequências nucleotídicas.

O que indica o E-value nos resultados do BLAST?

Percentual de identidade entre as sequências.

Probabilidade de um alinhamento ocorrer por acaso. (correct)

Pontuação total do alinhamento.

Cobertura da sequência de pesquisa.

Qual característica é mostrada na primeira linha do formato FASTA?

Um sinal > seguido pela descrição da sequência. (correct)

A porcentagem de identidade da sequência.

O nome da base de dados onde a sequência foi encontrada.

A sequência em formato binário.

Qual é a função do score de alinhamento nos resultados do BLAST?

Avaliar a qualidade do alinhamento. Signup and view all the answers

O que é representado pela 'cobertura' nos resultados do BLAST?

Percentual da sequência de pesquisa coberto pela sequência do hit. Signup and view all the answers

Quantas linhas comuns são apresentadas para cada 'hit' nos resultados do BLAST?

Uma linha por cada sequência que mostra similaridade. Signup and view all the answers

Qual é a importância do NCBI na pesquisa biomédica?

Ser um dos maiores repositórios de informações biológicas. Signup and view all the answers

Em que formato a sequência é apresentada para reconhecimento em programas de bioinformática?

Formato FASTA. Signup and view all the answers

Qual é o objetivo principal da clonagem molecular?

Amplificar seletivamente um gene ou segmento de DNA Signup and view all the answers

Qual descoberta foi fundamental para viabilizar a clonagem molecular?

A utilização de enzimas de restrição e ligase Signup and view all the answers

Qual foi uma das primeiras aplicações da clonagem molecular na medicina?

Produção de insulina humana Signup and view all the answers

Quais são as vantagens da utilização de proteínas recombinantes em comparação com proteínas purificadas do tecido original?

Produção em larga escala com controle total do processo Signup and view all the answers

O que caracteriza a clonagem terapêutica?

Criação de células-tronco para tratamentos médicos Signup and view all the answers

Qual é uma das limitações comuns da clonagem molecular?

Dificuldade em controlar a quantidade de proteína produzida Signup and view all the answers

Qual é a função dos traços horizontais em um alinhamento de sequências?

Representar gaps na sequência Signup and view all the answers

Qual bactéria foi utilizada nos experimentos que levaram à descoberta do efeito transformante?

Streptococcus pneumoniae Signup and view all the answers

Qual é o comprimento mínimo recomendado para um primer?

15 bases Signup and view all the answers

Na clonagem molecular, o que são vetores de clonagem?

Estruturas que transportam fragmentos de DNA para as células hospedeiras Signup and view all the answers

O que ocorre quando a temperatura de anelamento (Tanneal) é muito baixa?

Menor estringência no anelamento Signup and view all the answers

Qual é a consequência de primers que podem parear com eles mesmos ou entre si?

A eficiência do PCR é reduzida. Signup and view all the answers

Qual é a faixa ideal de % GC para a composição de um primer?

40 a 60% Signup and view all the answers

Por que é importante que a sequência dos primers seja única na sequência do DNA molde?

Para evitar a ligação com outras sequências. Signup and view all the answers

A temperatura de melting (Tm) é definida como?

Temperatura onde metade do DNA está em forma de fita simples Signup and view all the answers

O que um sinal positivo (+) no alinhamento indica?

Uma substituição com escore positivo Signup and view all the answers

Qual é o primeiro passo nas etapas da clonagem?

Selecionar o modelo do estudo. Signup and view all the answers

Qual ferramenta pode ser utilizada para traduzir sequências de pares de base em aminoácidos?

Expasy Translate. Signup and view all the answers

Qual é a temperatura de anelamento (Tanneal) recomendada para primers com Tm de 70°C?

66°C Signup and view all the answers

Qual é uma característica desejada ao selecionar enzimas de restrição?

Não devem clivar a sequência da proteína clonada. Signup and view all the answers

Qual é o efeito de uma temperatura de anelamento muito alta na especificidade do primer?

Melhora a especificidade no emparelhamento Signup and view all the answers

Qual gene foi selecionado como alvo no modelo de estudo do Schistosoma mansoni?

Gene ORAI. Signup and view all the answers

O que deve ser verificado antes de amplificar uma sequência de interesse por PCR?

O quadro de leitura do vetor + inserto. Signup and view all the answers

Qual é a fonte de DNA molde sugerida para a amplificação da sequência de interesse por PCR?

DNA genômico. Signup and view all the answers

Qual é a função do IPTG no contexto do operon lac?

Induzir a expressão da β-galactosidase Signup and view all the answers

Como as colônias brancas e azuis ajudam na seleção de clones recombinantes?

Colônias azuis indicam a presença de β-galactosidase, enquanto brancas indicam a ausência. Signup and view all the answers

Qual técnica é usada para confirmar que o DNA do inserto está presente no plasmídeo?

PCR de colônia Signup and view all the answers

Qual é o resultado esperado quando uma bactéria contém um plasmídeo sem inserto?

Crescimento de colônias azuis Signup and view all the answers

Qual é um dos métodos de identificação de clones recombinantes?

Análise do padrão de restrição Signup and view all the answers

Para que serve o X-gal no processo de seleção de colônias?

É um substrato que, quando degradado, resulta em colônias coloridas Signup and view all the answers

O que pode ocorrer durante a reação de PCR, além da amplificação do DNA?

Introdução de mutações no DNA amplificado Signup and view all the answers

Qual é a função principal da β-galactosidase?

Degradar polissacarídeos para açúcares simples Signup and view all the answers

Qual é a função dos genes repórter mencionados?

Produzem uma proteína que pode ser quantificada e detectada. Signup and view all the answers

Qual tag é utilizada para purificação em cromatografia de afinidade?

His6 Signup and view all the answers

Qual é um exemplo de como um ratinho transgénico pode ser utilizado na pesquisa?

Para fluorescer quando iluminado com luz UV. Signup and view all the answers

O que deve ser considerado ao escolher um plasmídeo para clonagem?

Número de cópias e resistência ao mesmo antibiótico. Signup and view all the answers

Qual é um dos passos fundamentais no processo de clonagem mencionado?

Preparação do vetor e do inserto. Signup and view all the answers

Como as proteínas com tag são tipicamente purificadas?

Cromatografia de afinidade. Signup and view all the answers

O que se deve garantir ao usar plasmídeos cotransformados?

Que não compartilhem a mesma origem de replicação. Signup and view all the answers

Qual é a função do promotor na clonagem?

Controlar a expressão do gene em um organismo hospedeiro. Signup and view all the answers

Study Notes

Clonagem Molecular e Vetores de Clonagem

A clonagem molecular é um processo que permite a amplificação seletiva de um determinado gene ou segmento de DNA.
Técnicas que viabilizaram o processo de clonagem molecular: enzimas de restrição, ligase, polimerase, vetores de clonagem e métodos de transformação de células eucarióticas e procarióticas.
A transformação bacteriana (1928, Frederick Griffith) mostrou que bactérias da cepa R teriam adquirido um "princípio transformante" de bactérias S mortas por calor, tornando-se virulentas.
Aplicações da clonagem molecular:
- Ferramentas para pesquisa básica (estrutura e função de proteínas).
- Diagnóstico (produção em larga escala de proteínas recombinantes, como kits de ELISA).
- Fármacos (anticorpos terapêuticos, vacinas, hormônios, fatores de coagulação).
- Produção de organismos transgênicos (melhores índices de produtividade, imunidade a doenças e pragas, modelos de estudo em pesquisa, animais knockouts).
- Insulina humana (biofármaco recombinante, marco para pesquisa genética e biotecnológica).

Clonagem e Expressão de Proteínas Recombinantes

Clonagem e expressão de proteínas recombinantes são processos essenciais em biologia molecular.
A expressão de proteínas recombinantes é útil por permitir:
- maior facilidade de purificação
- evitar contaminação com outras proteínas do tecido original
- engenharia de proteínas
- um processo controlado
- maior especificidade e quantidade de produtos

Etapas para clonagem e expressão de uma proteína

Selecionar um modelo de estudo (ex. Schistosoma mansoni)
Selecionar um gene alvo (ex. gene actina de S. mansoni
Identificar a sequência em banco de dados (NCBI).
Selecionar um par de primers para a reação em cadeia da polimerase (PCR)

Bases de dados

NCBI (National Center for Biotechnology Information): um dos maiores repositórios de informações biológicas existentes, parte do NIH (National Institutes of Health) dos EUA.

Sequência em formato FASTA

Formato mais utilizado para reconhecimento de sequências por programas de bioinformática; a primeira linha possui o sinal > seguido da descrição da sequência e as linhas subsequentes contêm a sequência propriamente dita.

Necessidade de sequência de nucleotídeos para clonagem

A sequência de nucleotídeos é fundamental para a clonagem.
A obtenção da sequência nucleotídica de um gene de interesse é necessária para a criação de primers para PCR, permitindo a amplificação do gene.
Bases de dados de sequências (como o NCBI) são usadas para identificar sequências de nucleotídeos de genes.
- Ex. WormBase Parasite, EnsemblPlants

Ferramentas online

Ferramentas online (como iBeetle-Base e Expaasy Translate) podem auxiliar na pesquisa e manipulação de sequências.

O BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

Ferramenta utilizada para comparar sequências de DNA e proteínas, identificando similaridades com outras sequências conhecidas.
As ferramentas BLAST em ambientes WEB (por exemplo, básico local de alinhamento (BLAST) ferramenta de busca, ferramenta em ambiente web) são utilizadas para identificar segmentos de DNA ou proteína que apresentem homologia com uma sequência de interesse.

Interpretação dos resultados do BLAST

A análise dos resultados do BLAST fornece insight sobre a similaridade entre sequências.
As informações fornecidas incluem:
- Score de alinhamento (indicativo da qualidade do alinhamento)
- E-value (probabilidade de encontrar um alinhamento tão alto por acaso)
- Identidade (índice de posições idênticas na sequência)
- Cobertura (proporção da sequência da query coberta pelo alinhamento)

Alinhamento de nucleotídeos

O alinhamento de nucleotídeos, com base em similaridades, pode identificar regiões de identidade ou similaridade entre nucleotídeos de sequências diferentes.

Primers (sequências curtas de DNA simples fita)

Primers são sequências curtas de ácidos nucleicos utilizadas para iniciar a síntese de DNA via PCR.
O comprimento influencia a especificidade (quanto maior, maior a especificidade) e as temperaturas de melting e anelamento (quanto maior, maiores as temperaturas).
Geralmente, os primers devem ter entre 17-28 bases de comprimento.

Como "desenhar" um primer

Escolha o comprimento entre 17 e 28 bases
O número de GC está entre 40% e 60%
A temperatura de melting (Tm) é entre 65ºC e 75ºC
Evita a formação de hairpin e cross-dimer dos mesmos primers

Temperatura de Melting (Tm) e Temperatura de anelamento (Tanel)

Tm: Temperatura em que metade das fitas de DNA está na forma de fitas simples.
Tanel: Temperatura em que os primers pareiam ao DNA molde.

Estrutura Interna dos Primers

Primers devem ser evitados caso haja possibilidade de pareamento entre eles.
Comprimento entre 17 e 28 bases é adequado.
Quantidade de GC entre 40 e 60%.
Tm entre 65°C e 75°C
Evita-se a formação de hairpin e cross-dimer.

Enzimas de restrição

Enzimas, de origem bacteriana, são usadas para digerir o DNA em locais específicos - sítios de restrição - gerando extremidades coesivas compatíveis.
Essas enzimas são importantes na clonagem de genes.

Enzimas de restrição que podem ser usadas:

Exemplos: Eco RI, Hind III

Construção do DNA recombinante

Clonagem não dirigida: use uma única enzima de restrição no vetor e no gene que será inserido, sem preocupar com o alinhamento do quadro de leitura.
Clonagem dirigida: use duas enzimas de restrição no vetor e no gene que será inserido, para garantir alinhamento exato no quadro de leitura.

Montagem Gibson

Técnica de clonagem que permite a associação de fragmentos de DNA com pontas complementares usando uma mistura de enzimas.
A técnica é isotérmica, o que facilita o procedimento.
Permite montagens grandes e complexas de DNA

Vetores de fusão gênica pGEX-4T

Usados para purificar proteínas recombinantes.
A proteína de fusão inclui a etiqueta e a proteína de interesse, que permite a purificação usando cromatografia de afinidade.

Origem de replicação (ori)

Origem de replicação (ori) promove a ligação da maquinaria de replicação de DNA.
As origens de replicação bacteriana controlam a número de cópias de plasmídeos.
Plasmídeo pcDNA3.1 possui origem de replicação (ori) pUC.

Marcadores de seleção

Marcadores selecionáveis garantem que apenas as células que receberam o plasmídeo recombinante sobrevivam.

Promotores

Promotores são sequências de DNA que controlam a expressão gênica, garantindo que um gene de interesse seja expresso no organismo, dentro do vetor. (Por exemplo: Promotor Amp, CMV, sv40, t7, lac)

Sítios de clonagem múltipla (MCS)

MCS são regiões dos plasmídeos contendo múltiplos sítios de restrição.
Podem ser usados para clonar genes de interesse.
Localiza-se entre o promotor e o terminador do gene alvo.

PCR (reação em cadeia da polimerase)

A PCR é uma técnica para amplificar uma sequência específica de DNA in vitro.
Técnica usada para a amplificação de genes que serão clonado.
Há três passos principais: desnaturação, anelamento e extensão.

Eletroforese em gel de agarose

Técnica usada para separar e visualizar fragmentos de DNA de diferentes tamanhos.
Importantes para verificar se houve amplificação do DNA esperado durante o processo de clonagem.

Isolamento e purificação do fragmento amplificado

O isolamento e purificação do fragmento amplificado é crucial para uma clonagem eficaz.
Utilização de kits (PureLink™ Gel Extraction) que permitem isolar e purificar fragmentos de DNA a partir de géis de agarose.

Métodos de introdução de DNA no hospedeiro

Transformação, transfecção, eletroporação, microinjeção, bombardeamento, infecção viral.

Transformação em células competentes

Transformação é o processo de introduzir DNA estranho em uma célula.
Células competentes são mais propensas a absorver DNA externo.
Existem métodos para tornar as células competentes (calor ou eletroporação)
Células competentes ca²⁺ ou eletrocompetentes

Seleção de colônias

Métodos de seleção permitem identificar células que expressam o plasmídeo recombinante.
A seleção é feita usando meio de cultura com antibiótico resistente, identificando as colônias que sobreviveram.
Uso de meio de cultura contendo um análogo da lactose e um indutor, permitindo a identificação de colônias recombinantes pela cor das colônias. (A colônia que conter o gene recombinante mostrará cor diferente da outra colônia)

Métodos de identificação de clones recombinantes

Análise de padrões de restrição
PCR
Sequenciamento de DNA

Multiplicação e extração do DNA recombinante

Multiplicação do DNA recombinante em um hospedeiro adequado (ex. E. coli).
Extração do DNA plasmídico de clonas bacterianas. (Ex. kit miniprep)

Confirmação do clone positivo por sequenciamento

Sequenciamento do inserto para verificar se ele está no vetor como esperado.
Comparação com sequências de bancos de dados (GenBank) para validar o clone.

Expressão de proteína recombinante em E. coli

Preparo do Inserto
Vetor linearizado
Transformação de E. coli competente
Reação de ligação
Plaqueamento e seleção de clones recombinantes
Extração de DNA
Sequenciamento

Studying That Suits You

Use AI to generate personalized quizzes and flashcards to suit your learning preferences.

Description

Teste seus conhecimentos sobre bioinformática com este quiz que abrange questões sobre o BLAST, a clonagem molecular, e suas aplicações. Explore tópicos fundamentais, como E-value, formatos de sequência, e a importância do NCBI. Prepare-se para revisar conceitos essenciais e descobrir mais sobre a pesquisa biomédica.