Biologia Molecolare 27.11.2023 PDF

12.2 Biologia Molecolare 27.11.2023 MicroRNA E DIFFERENZIAMENTO CELLULARE Il passaggio da cellula staminale a una cellula differenziata può essere mediato dall’espressione di una proteina X, oppure dall’inibizione di una proteina Y ad opera di un miRNA. La visione...

12.2 Biologia Molecolare 27.11.2023 MicroRNA E DIFFERENZIAMENTO CELLULARE Il passaggio da cellula staminale a una cellula differenziata può essere mediato dall’espressione di una proteina X, oppure dall’inibizione di una proteina Y ad opera di un miRNA. La visione della regolazione dell’espressione genica è stata completamente stravolta dai miRNA, tanto che, in letteratura scientifica contemporanea, nel trattare ad esempio il passaggio da cellula pluripotente staminale a cellula differenziata, non si parla più di espressione di una proteina X, bensì di inibizione di altre proteine (Oct4, Nanog, Sox2 etc.) e successiva attivazione ad opera di miRNA di processi atti all’eliminazione dei fenomeni inibitori. Di conseguenza anche i miRNA sono implicati nel processo di regolazione della differenziazione cellulare. Questo fatto è alla base del paradosso C e amplia il dogma della biologia molecolare. Questo tipo di visione complica estremamente gli studi di biologia: se ci fosse una corrispondenza ad uno ad uno tra miRNA e il proprio target i ricercatori sarebbero estremamente facilitati; ma il quadro biologico è molto complicato proprio perché più miRNA vanno a targettare la stessa molecola e quindi per spiegare un ipotetico passaggio da stadio A a stadio B di una molecola è necessario identificare tutti i miRNA coinvolti nel target di quest’ultima. I miRNA ad oggi si trovano sui testi definiti come oncogeni oppure come oncosoppressori: - se il miRNA va a inibire l’espressione di un oncogene, la sua funzione è quella di oncosoppressore; - se il miRNA va a inibire l’espressione di una proteina che blocca il ciclo cellulare, è un oncogene, perché la sua assenza determina proliferazione incontrollata. La professoressa ricorda di essere rigorosi nelle definizioni nelle domande a crocette: è necessario ampliare i concetti studiati con questa nuova molecola (miRNA) che ha rivoluzionato gli studi di biologia molecolare. TRATTAMENTO TERAPEUTICO Una volta chiarito il meccanismo di funzionamento dei miRNA e testata la potenza di questo mezzo di produzione di proteine nella cellula, la ricerca è passata direttamente alla fase applicativa. Infatti, questa è l’era delle molecole di RNA usate a fini terapeutici: ci sono già numerose molecole di miRNA in fase di sperimentazione preclinica, quindi oggetto di ricerca di base, o in clinical trial, quindi il momento in cui è possibile correlare direttamente il trattamento terapeutico con un dato miRNA e la cura di un dato stato patologico. Il passaggio dall’investigazione di un meccanismo di base del funzionamento delle cellule eucariote alla formulazione di un farmaco con il quale vengono trattati dei pazienti, avviene mediante due step: Sbobinatore: Cristina Presot Revisionatore: Giovanni Miele 12.2 Biologia Molecolare 27.11.2023 a) Il primo step in cui la ricerca è definita preclinica o ricerca di base e in cui una forte base sperimentale porta alla formulazione di un’ipotesi di un funzionamento in vivo, che valida poi in modo definitivo l’osservazione di partenza. Una volta che la fase di sperimentazione animale conferma la validità della molecola di partenza, e quindi la validità dell’ipotesi, allora si attraversa una fase in cui viene elaborata una formulazione terapeutica somministrabile al paziente. b) Il secondo step è la sperimentazione clinica, descritta a sua volta da varie fasi: 1. in una prima fase viene investigata la formulazione farmacologica della molecola, che da questo momento viene definita farmaco; La formulazione chimica viene testata per quanto riguarda la biodistribuzione, gli effetti avversi o fuori target che può avere. Una volta affinata la chimica del farmaco si passa allo studio di fase due; 2. Lo studio della fase due prevede che volontari o pazienti vengano arruolati per la sperimentazione del farmaco. Si passa quindi da “in vivo” a “in omo” su un gruppo ristretto di pazienti. 3. Si passa alla fase tre quando il farmaco è considerato efficace e sicuro e quindi viene somministrato a un numero superiore di pazienti. 4. I farmaci passano poi a lungo termine alla fase quattro, detta anche sorveglianza post-marketing. A questo punto diventano patrimonio delle grandi compagnie che provvedono alla commercializzazione su larga scala. Vengono anche testati gli effetti sui pazienti a lungo termine, si pensa a distanza di decine di anni dalla somministrazione. miRNA34 Il miRNA 34 si trova già in avanzata fase due (l’immagine a sinistra è datata). Negli Stati Uniti esiste un farmaco da banco che codifica per il miRNA34. Questo miRNA è in grado di legarsi in maniera specifica a molecole che causano trasformazione neoplastica in distretti specifici; quindi, la somministrazione di miRNA34 al paziente garantisce la soppressione e l’eliminazione della molecola che ha causato una data trasformazione neoplastica. Come il miRNA34, sono impiegate in campo terapeutico numerose molecole che, con azione specifica, vanno a bersagliare un certo RNA messaggero. ANTI-miR E MIMIC Altre molecole utilizzate a fini terapeutici sono gli anti-miR e i mimic: - Come anticipato i miRNA possono comportarsi da oncogeni o da oncosoppressori: se una patologia è determinata da un miRNA che si comporta da oncogene, cioè la cui espressione determina trasformazione neoplastica, allora il fine terapeutico è quello di far abbassare i livelli di questo miRNA. In questo caso la formulazione terapeutica prevederà una molecola complementare al miRNA, che ne sopprima l’espressione: questo è un Anti-miR. - Il mimic è la sequenza di miRNA double-strand che determina il trasporto diretto di questo miRNA su RISC, quindi sul proprio target, evitando tutto il passaggio della biogenesi che normalmente viene eseguita dai miRNA. Al paziente viene dato questo duplex, che viene poi Sbobinatore: Cristina Presot Revisionatore: Giovanni Miele 12.2 Biologia Molecolare 27.11.2023 caricato su RISC e portato sul target tramite Argonauta. Questo è il momento della biogenesi dei miRNA a livello della quale interviene l’uomo a fini terapeutici. RIFERIMENTO AGLI STUDI DI FIRE&MELLO Fire & Mello avevano svolto uno studio su tre casi: - introduzione in C. elegans di una molecola corta con esattamente la stessa sequenza del filamento, non sortendo alcun tipo di effetto; - introduzione in C. elegans di una molecola antisenso, e quindi complementare all’RNA messaggero target, non sortendo alcun effetto ugualmente; - introduzione in C. elegans dell’RNA double strand, cioè di una porzione di RNA a doppio filamento; Il terzo è l’unico caso in cui si è sortito l’effetto desiderato. Questo perché soltanto l’RNA a doppio filamento viene riconosciuto e caricato da RISC, per poi essere processato da Argonauta, che lo guida sul proprio target. È proprio RISC, all’interno delle cellule eucariote, a essere la macchina molecolare chiave che porta al silenziamento dei propri target. LA MOLTEPLICITÀ DEI BERSAGLI miRNA Un unico miRNA va a colpire più target. Il grande problema nel trattamento terapeutico di una patologia con un miRNA è proprio la previsione dei suoi target. Si tratta di una previsione bioinformatica successivamente validata sperimentalmente. Per esempio, il miRNA34 colpisce 9 molecole differenti (Key Oncogenic Targets), ma colpirne soltanto una di queste non è possibile perché il miRNA ha una pleiotropia di bersagli all’interno della stessa cellula. Oltre a questi nove bersagli noti, c’è la possibilità che ne esistano ulteriori di ignoti. Il grande problema della formulazione di miRNA34 quindi risiede nella molteplicità dei target, nella maggior parte dei casi imprevedibili. NUOVE TECNOLOGIE PER IL SILENZIAMENTO Qual è quindi la soluzione se si volesse bloccare in maniera specifica l’espressione, per esempio, di NOTCH-1 in caso di leucemia in un paziente la cui causa è specificamente correlata alla sovraespressione di questa molecola? Per far sì che solo e soltanto uno specifico mRNA sia degradato completamente, si “disegnano” diverse sequenze di una ventina di nucleotidi (19-21 nt.), perfettamente complementari alla regione 3’-UTR, in zone diverse dell’RNA messaggero. Queste molecole sono definite siRNA (Short Interfering RNA). A questo punto, quello che viene definito “silencing RNA”, quindi il siRNA può essere introdotto (trasfettato), nelle cellule da bersagliare. Queste molecole, sintetizzate a doppio filamento perfettamente complementari al bersaglio di mRNA, vengono caricate da RISC, riconosciute da Argonauta che le guida sul target (non necessitano infatti dell’intervento di Dicer). Essendo perfettamente complementari alla sequenza studiata, il bersaglio viene immediatamente degradato, Sbobinatore: Cristina Presot Revisionatore: Giovanni Miele 12.2 Biologia Molecolare 27.11.2023 creando quindi in vitro un sistema per andare a sopprimere l’espressione solo e soltanto di una molecola di mRNA all’interno della cellula del paziente. È così che, di fatto, la conoscenza di base viene applicata al trattamento del paziente. Quindi ad oggi l’applicazione terapeutica vede non più l’uso delle molecole di miRNA, bensì di siRNA, sfruttando il processo di RNA interference, un trattamento terapeutico nel quale il ricercatore, in collaborazione con il clinico, “disegna” un siRNA perfettamente complementare a un bersaglio che deve essere abbassato di livello nel paziente. Ricapitolando, i siRNA sono molecole ingegnerizzate e sintetizzate da un operatore in una conformazione ideale perché possano essere riconosciute da RISC. Vengono prodotte come insiemi di molecole che devono essere inserite nella cellula eucariote. siRNA viene progettata appositamente per avere come target uno e un solo mRNA. I miRNA, allo stesso modo regolano l’espressione genica reprimendo o degradando delle molecole bersaglio, ma essendo molecole endogene non possiedono come target un RNA messaggero unico, ma diversi RNA messaggeri di linee cellulari diverse. TRASFERIMENTO DEI siRNA: Questo tipo di molecola ha soltanto un tipo di bersaglio e gode della capacità di essere una molecola piccola, che quindi può essere trasferita nel paziente sfruttando, per esempio, micelle lipidiche, che possono essere ingegnerizzate (come è stato fatto per i vaccini a mRNA contro il covid-19). Una micella lipidica è in grado di fondersi con le membrane biologiche e trasmettere all’interno della cellula bersaglio il proprio contenuto senza specificità; grazie alle tecnologie moderne però, la si può dotare di antigeni proteici sulla superficie in grado di guidarla in maniera specifica solo e soltanto su un tipo cellulare. Sbobinatore: Cristina Presot Revisionatore: Giovanni Miele