Biologia Molecolare Tutto-pagine-1 (PDF)

Inquadramento Storico MACROMOLECOLA = acidi nucleici e proteine sono costituiti da un numero limitato di diverse unità monomeriche, nucleotidi e aminoacidi. I monomeri sono aggiunti uno alla volta. Ogni catena polinucleotida e polipeptida ha specifici punti di inizio e la crescita pr...

Inquadramento Storico MACROMOLECOLA = acidi nucleici e proteine sono costituiti da un numero limitato di diverse unità monomeriche, nucleotidi e aminoacidi. I monomeri sono aggiunti uno alla volta. Ogni catena polinucleotida e polipeptida ha specifici punti di inizio e la crescita procede in un’unica direzione fissa. Il prodotto primario viene spesso modificato dopo la sintesi. DNA — trascrizione — RNA — traduzione — PROTEINE Ci sono poi particolari organismi come retrovirus che da RNA trascrivono DNA al contrario. Per questo potresti trovare la doppia freccia tra RNA e DNA. STORIA ESPERIMENTO DI GRIFFITH = dimostra che componenti genetici di batteri patogeni uccisi dal calore potevano attraversare i la membrana di batteri non virulenti e renderli patogeni. Al microscopio appaiono lisci o rugosi, in base alla presenza della capsula esterna. Uccide i batteri patogeni, facendo si che non possano infettare, li mise in presenza di non patogeni e questi acquisiscono capacità di dare virulenza. Ci doveva essere un principio trasformante Nel frattempo si scoprono proteasi e RNAsi ESPERIMENTO DI AVERY = uccide patogeni e tratta con questi due enzimi, e nonostante ciò le cellule non patogene si trasformano in virulente, dunque poteva essere solo il DNA a essere il principio. Per dimostrarlo, sapendo che gli acidi nucleici non contengono lo zolfo e che le proteine batteriche invece non contengono fosforo: ESPERIMENTO DI HERSHEY&CHASE = dunque usano isotopi radioattivi batteriofagi, e sono posti in presenza di zolfo e : fosforo radioattivi, si son fatti poi sviluppare i batteri, che contenevano fosforo. Dunque l’informazione si trova nel DNA che contiene fosforo e non zolfo. ESPERIMENTO DI CHARGAFF = determina che nel DNa il numero di T è uguale al numero di A e il numero di G è uguale al numero di C. Purifica il DNA di diversi organismi e osserva questi rapporti costanti. Con questo si arriva a capire il relativo appaiamento delle basi. ESPERIMENTO DI TODD = capisce che il legame che unisce i diversi nucleotidi è un legame fosfodiesterico. Si osserva dunque : uno scheletro dato da alternarsi di fosforo e zucchero. Ci sono due esteri. ESPERIMENTO FRANKLIN E NON WILKINS SESSISTA = osservano con una fotografia a raggi X una struttura riconducibile a una catena elicoidale per il DNA < ESPERIMENTO WATSON E CRICK = la configurazione energicamente più favorevole e stereochimica mente compatibile con i dati passati è la doppia elica, capito da Crick fisico. Watson invece capisce che al struttura a doppia elica poteva spiegare la replicazione dei geni ipotizzata dai genetisti. Un filamento può fungere da stampo per la copia del secondo filamento. ACIDI NUCLEICI = polimeri lineari formati da nucleotidi. Questi sono formati da : zucchero (ribosio o 2-deossiribosio) i cui carboni sono numerati con “primo”, una base azotata coi carboni numerati coi numeri normali, fosfato. Basi azotate = due tipi purine e piramidine, ovvero composti con una pirimidina e un imidazolo e anelli eterociclici aromatici con composizione aromatica simile al benzene e con azoti in 1 e 3. Rispettivamente sono A e G per il primo tipo e C e T/U del secondo. Le basi tendono ad appaiarsi e a ripiegare la struttura dove trova delle basi complementari. ESPERIMENTO KORNBERG = dimostra che l’enzima polimerizante che catalizza l’assemblaggio dei nucleotidi è la dna : polimerasi e usa i precursori dNTP ( deossi nucleotidi trifosfati), questo enzima funziona solo in presenza di DNA che funge da stampo. ESPERIMENTO MESELSON&STHAL = dimostrano come avviene la replicazione del DNA. Considerando una molecola di DNA a doppio filamento gli scienziati avevano ipotizzato tre metodologie: semi-conservativa, (ogni filamento fa da stampo per uno nuovo, dunque uno vecchio e uno nuovo ) conservativa (un doppio filamento fa totalmente da stampo a uno tutto nuovo) e dispersiva (ci sono regioni in cui è conservata la parentale e regioni di nuova sintesi, un bello mix). Per distinguere queste ipotesi si usano degli isotopi radioattivi. Prendono cellule batteriche coltivate in presenza di azoto radioattivo pesante e vengono spostati in un terreno di coltura in cui è presente azoto più leggere. Dopo una generazione si effettua una separazione delle molecole grazie alla forza centrifuga in un gradiente di cesio. Le molecole più pesanti vanno sul fondo e quelle con azoto leggero rimangono superficiali. Al centro si alternano molecole con un bello mix. Secondo l’ipotesi conservativa si formerà una molecola totalmente più leggera. Nel caso delle altre due alla prima generazione ci saranno molecole miste che finiranno al centro, non riconoscibili dunque le due ipotesi dalla prima generazione. Con una successiva generazione invece, si osserva che aumenta la barra del leggero formando così due barre, confermando la duplicazione semiconservativa (se fosse stata dispersiva si sarebbe solo allargata la barra centrale) DIVERSITÀ = Se si considera un batterio il suo gene tipico è all’incirca d 1000 bp (base pair), il numero di possibili geni di queste dimensioni è dunque 4^1000 (alla faccia du u cazz). GENE = si intende qualunque intervallo di DNa genomico che è trascritto in un RNA che viene poi tradotto in proteina (mRNA) o in una molecola di RNA funzionale (ncRNA), il primo tradotto in proteina e il secondo no in quanto non codificante. Molte funzioni cellulari sono poi svolte dalle proteine, che sono polimeri di amminoacidi legati grazie al gruppo amminico e gruppo carbossilico.  Frammentazione DNA & Plasmidi COME POSSO FRAMMENTARE IL DNA PER GENERARE IL DNA RICOMBINANTE? Con DNA ricombinante si considerano dei frammenti di DNA che possono essere di organismi diversi e che vengono incorporati. Il DNA è solubile in acqua, può essere tagliato, ricucito, sequenziato, ecc. NUCLEASI = spezza acidi nucleici ESONUCLEASI = toglie i nucleotidi alle due estremità. Come abbiamo visto la DNA polimerasi quando inserisce un nucleotide diverso e da correggere, può avere attività esonucleasica, così come la polimerasi I nei batteri per rimuovere il primer. Dunque esonucleasi vuol dire dalle terminazioni. Così si dice che la polimerasi I dei procarioti ha attività 5’-3’ esonucleasica quando rimuove il primer, non dove si è formato il filamento, ma dalla parte terminale da cui è sintetizzato il primer. Poi c’è l’attività di correzione di bozza 3’-5’. ENDONUCLEASI = sono enzimi che tagliano all’interno del DNA. Possono essere ASPECIFICHE, dunque non riconoscono sequenze particolari ma semplicemente tagliano il DNA dove non è protetto dalle proteine istoniche. Noi vedremo invece quelle specifiche. SISTEMI DI RESTRIZIONE I sistemi di restrizione consentono ai batteri di verificare la provenienza del DNA introdotto al loro interno e di distruggerlo nel caso esso venga riconosciuto come estraneo, e così hanno vari enzimi per spezzare il DNA esogeno. 1968: Meselson & Yuan purificarono la prima endonucleasi di restrizione da Escherichia coli K12. L’enzima tagliava il DNA in frammenti grandi e ciò fece supporre che riconoscesse una determinata sequenza bersaglio, non che spezzasse in maniera casuale, ciò non poteva essere a causa di istoni dato che non ci sono nei batteri. 1970: Scoperta in Haemophilus influenza di un enzima di restrizione (HindII) in grado di tagliare entrambi i filamenti di DNA all’interno di una sequenza specifica. I nomi degli enzimi di restrizione hanno il nome scritto in corsivo, che deriva dalla specie batterica da cui sono stati identificati, più un numero cardinale. Questi enzimi sono detti endonucleasi di restrizione e modificazione, e sono indicati a volte come Sistemi R-M COSA FANNO: - In natura : Riconoscono specifiche sequenze bersaglio nel DNA, dunque formano legami solo se trovano sequenze specifiche. Digeriscono entrambi i filamenti del DNA Modificano i filamenti del DNA mediante metilazione CLASSI: Tipo I: unico enzima che contiene subunità di riconoscimento, taglio e metilazione. Il taglio avviene fino a 1000bp distante dal sito di riconoscimento Tipo II: due enzimi distinti uno per taglio e uno metilazione riconoscono una stessa sequenza palindromica. Tipo III: un enzima con due subunità, dunque a struttura quaternaria, una per il taglio ed una per la metilazione. Il taglio avviene 24-26bp a valle Tipo IIs: due enzimi distinti per taglio e metilazione, riconoscono una sequenza NON palindromica ed il taglio avviene entro 20bp. Quelli di tipo II sono stati considerati importanti in quanto si possono usare singolarmente, evitando di fare due modificazioni in vitro nella stessa provetta e si possono separare gli enzimi. Riconoscono una sequenza specifica e tagliano all’interno di essa. Si può andare a predire dove tagliano. Noi utilizziamo in laboratorio generalmente quello che taglia. DUNQUE PARLIAMO SOLO DI ENZIMI DI TIPO II  COSA NECESSITANO : Non richiedono ATP o S-adenosil-metionina Richiedono ioni Mg2+ Le attività di taglio e metilazione sono su due enzimi diversi. Il DNA viene tagliato all’interno della sequenza riconosciuta. SEQUENZE PALINDROME = si leggono uguali da dx-sx e sx-dx. Per il DNA significa che la sequenza 3’-5’ di un filamento è uguale a quella sul filamento complementare sempre 3’-5’. Dunque sono identiche se lette secondo le regole di lettura di DNA. TIPI DI TAGLIO Si possono formare: Estremità piatte. Il taglio avviene in corrispondenza del sito di simmetria. Estremità coesive protrudenti al 5’. Gli enzimi riconoscono sequenze di 6 nucleotidi. Il taglio avviene tra le prime due basi. Nel momento in cui taglio, i filamenti si staccano, e rimane il 5’ protrudente con 4 nucleotidi. Estremità coesive protrudenti al 3’. Avviene la stessa cosa di prima ma rimane a protrudere il 3’. Sono dette bland ends o sticky ends. Ricostruzione tridimensionale di BamHI, è un dimero che taglia sui due filamenti. REAZIONE DI IDROLISI Si coordina la molecola di acqua, si sposta il dipolo e l’ossigeno può attaccare il fosfato. Così il magnesio interviene, si riesce a rompere il legame fosfodiesterico lasciando il fosfato attaccato al carbonio 5’ e l’ossidrile -OH sul 3’ dello zucchero.  L’enzima degli Escherichia Coli lascia un’estremità protrudente in 5’. Essendo sequenze palindrome, le estremità protrudenti possono appaiarsi in quanto complementari. Attraverso la ligasi si richiudono i legami fosfodiesterici tra i filamenti.  ATTIVITÀ STAR Le attività STAR di EcoRI (G^AATTC) sono sui siti N^AATTN e R^RAYY. E’ causata da condizioni ioniche troppo basse, non adatte, eccesso di glicerolo, eccesso di enzima. Invece che essere sulla sola sequenza dunque, riesce ad agire anche su sequenze simili, non si ha un taglio preciso ma più casuale. Le attività STAR di BamHI (G^GATCC) sono sui siti G^GATCN e G^RATCC. Dunque in condizioni sbagliate, eccessive, posso avere una perdita di specificità. ENZIMI DISPONIBILI Identificati più di 3000 enzimi che riconoscono un numero inferiore di sequenze, 200 tipi di sequenze. Questo perchè esistono: ISOSCHIZOMERI: enzimi di origine diversa che condividono con altri la medesima specificità di riconoscimento e di taglio. - Sph I: CGTAC/G e taglia tra penultima e ultima, lasciando 3’ protrudente - Bbu I: CGTAC/G scoperto in una specie diversa ma taglia uguale NEOSCHIZOMERI: enzimi di origine diversa che condividono con altri la medesima specificità di riconoscimento ma tagliano diversamente. - SmaI: CCC/GGG e fa un taglio piatto - XmaI: CCC/GGG e taglia tra il primo e il secondo nucleotide lasciando 5’ protrudente METILAZIONE La Metilazione in una base della sequenza di riconoscimento può interferire con l’azione delle endonucleasi. Il DNA batterico è sempre metilato, appena finisce la metilazione non viene subito replicato il DNA ma aspetta di dividersi in più cellule figlie. Post Replicazione - Se si vuole DNA non metilato lo si può ottenere con la PCR in vitro. Le metilasi possono esercitare un effetto inibitore quando la loro sequenza di riconoscimento è sovrapposta completamente o in parte a quella dell’enzima in questione. È importante il contesto in cui si trova la sequenza di riconoscimento dell’enzima di restrizione: per esempio StuI viene bloccato se il suo sito di riconoscimento AGGCCT è seguito da GG (AGGCCTGG viene metilato da Dcm), dunque non riuscirò a tagliarlo, ma se seguito da AA (AGGCCTAA non viene riconosciuto da metilasi), allora andrà bene perchè non sarà metilato. Un enzima può quindi essere sensibile alla metilazione. Il DNA isolato da E. coli Dam+ è refrattario al taglio da parte di MboI ma non Sau3AI sebbene entrambi riconoscano la sequenza GATC, ma uno è sensibile e uno no. Sebbene nella maggior parte degli esperimenti di biologia molecolare si usino E.coli Dam+ e Dcm+, nel caso si vogliano utilizzare enzimi sensibili alla metilazione sono disponibili ceppi mutanti Dam- e Dcm-, che possono essere prodotti non metilati in vitro ad esempio con PCR. La metilazione del DNA plasmidico può in rare circostanze ridurre l’efficienza di trasformazione. ES: un plasmide modificato da Dam ha bassa efficienza di trasformazione in un ceppo E.coli Dam-. ES: un plasmide modificato da Dam o Dcm può avere difficoltà ad essere trasferito in organismi di specie diverse. E’ pertanto consigliato in questi casi partire da plasmidi preparati in E.coli Dam- ed Dcm-. ENZIMI per biologia molecolare devono essere altamente puri e non contaminati (anche in tracce) da esonucleasi, fosfatasi Controllo: DNA viene digerito con un eccesso di enzima, ed i frammenti vengono ricuciti con DNA ligasi e poi ridigeriti con lo stesso enzima. Si controllano così i frammenti ottenuti. Gli enzimi vengono venduti con concentrazioni riportate come Unità/ml. Per unità si intende la quantità di enzima necessaria per per digerire 1 µg di DNA in 1 ora. Gli enzimi vengono venduti in glicerolo che può interferire con la reazione se in eccesso pertanto si devono diluire almeno 10 volte. Vengono prodotti in glicerolo perchè abbassa la temperatura di congelamento in modo che non ghiacci in freezer, così sono sempre pronti all’utilizzo. NUMERO E DIMENSIONE DEI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE Se la percentuale di G+C fosse 50% la frequenza di siti per un particolare enzima di restrizione si stima: Sito di 4 basi si ripeterà ogni 4^4 (256) basi Sito di 6 basi si ripeterà ogni 4^6 (4096) basi Sito di 8 basi si ripeterà ogni 4^8 (65536) basi Queste sono probabilità, non è detto che si trovino precisamente a queste distanze di paia di basi. Dunque in base a se voglio frammenti piccoli o grandi sceglierò un enzima che riconosca più o meno ogni tot di basi. Esempio Digestione con EcoRI: 190bp, 310bp, 700bp, 1300bp Digestione con BamHI: 400bp, 600bp, 1500bp ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO Bisogna analizzare le dimensioni dei frammenti di DNA ottenuti. Si può dunque fare un’elettroforesi in gel di agarosio. Il DNA porta carica negativa, quindi in elettroforesi il DNA migrerà verso il polo positivo. Per distinguere frammenti grandi o piccoli, li si mette poi in una matrice di agarosio, che solidifica e forma una gelatina con delle maglie. Formo quindi una gelatina fatta a parallelepipedo. Si formano poi dei piccoli pozzetti in cui si possa inserire il DNA. Si genera i campo elettrico e così il DNA migra verso l’anodo. Per poter osservarlo, in quanto normalmente trasparente, si aggiunge BROMURO DI ETIDIO, che è fluorescente se colpito da luce UV, e che si attacca alle basi. Dunque dove vi è DNA si osserva la fluorescenza rosa. Ho una risoluzione di circa 20ng di DNA. " parità ← Se c’è una maglia le molecole più piccole passano prima, quelle più grandi ci mettono più tempo. Dopo averli lasciati a riposare osservo sotto luce ultravioletta e noto le stratificazioni in base alla grandezza dei frammenti.  Si può scegliere a che percentuali di agarosio lavorare, in base alla dimensione che avrò bisogno di analizzare. Per capire che numero di paia di basi avrò, si usa un marcatore con DNA a peso molecolare noto con una scaletta. Le aziende vendono queste scalette in base alla quantità utilizzata. La maggior parte non si posa dal DNA a peso molecolare noto. Si va dunque a calcolare la distanza del pozzetto fin dove è arrivato. La migrazione dei frammenti di DNA é inversamente proporzionale al logaritmo dei loro pesi molecolari (Aaij & Borst 1972). Dunque uso una scala logaritmica con distanza di migrazione sulle ascisse e peso molecolare sulle ordinate. A questo punto osservo di quanto è migrato il DNA, lo si interpola, e si definisce il peso molecolare. VETTORI DI CLONAGGIO Si usano per ottenere grandi quantità di DNA. Possono essere inseriti all’interno dei batteri e utilizzarli come reattori per il clonaggio. Frammenti di DNA che trasportano il DNA da analizzare dentro un organismo ospite Assumono la forma di molecole di DNA a doppia elica circolare. Sono in grado di aumentare il numero di copie mediante regioni che controllano la replicazione: repliconi. Non richiedono l’integrazione nel genoma dell’ospite ma si propagano come elementi extracromosomici, in questo modo si può facilmente inserire e facilmente purificare. Ci sono condizioni fisico-chimiche che ne facilitano la purificazione. Facilmente analizzabili. I plasmidi/episomi sono diffusi in natura per conferire fenotipi come resistenza ad antibiotici, produzione di tossine. I plasmidi coniugativi = contengono il gene tra necessario per promuovere coniugazione tra batteri I plasmidi non coniugativi = non contengono il gene tra e sono a peso molecolare più basso. I plasmidi rilassati = si mantengono all’interno della cellula ospite in numero di copie elevato, riuscendo a replicarsi dunque molto I plasmidi stringenti = si mantengono all’interno della cellula ospite in numero di copie basso, riuscendo a replicarsi poco. Sono piccoli, circolari, vengono arrotolati da girasi e srotolati dalle topoisomerasi. L’aggiunta di un agente intercalante (Etidio Bromuro) a DNA superavvolto porta alla progressiva perdita del superavvolgimento naturale fino ad arrivare ad avere un superavvolgimento di segno opposto qualora l’intercalante sia presente in largo eccesso.  DNA CCC (Circolari Chiusi Covalentemente) = entrambi i filamenti sono intatti DNA OC (circolari aperti) = un filamento presenta interruzioni nello scheletro fosfodiesterico DNA linearizzato = entrambi i filamenti sono interrotti. Visualizzazione del DNA mediante Etidio Bromuro. Il DNA circolare si presenta in diverse conformazioni. Quando superavvolto si dice supercoiled. Quando è circolare non è possibile analizzare quanto è pesante, posso definirlo solo quando è tagliato. > ESPERIMENTO DI INGRAM = si capisce che i geni controllano le proteine. Concettualmente il difetto genetico si correla con la sostituzione di un amminoacido nei pazienti affetti d anemia falciforme che si può osservare attraverso la forma di queste due diverse globine in un malato e un sano. Dunque i geni portano la sequenza aminoacidica delle proteine. DAL DNA ALLE PROTEINE = esperimenti dimostrarono che la sintesi proteica avveniva anche in assenza di DNA, esclusero che venissero trascritte direttamente. Esistono vari tipi di RNA nella cellula: dunque quale RNA trasporta l’informazione a citoplasma. L’85% si trova nei ribosomi, che aumentano di numero in cellule con intensa sintesi proteica. La composizione della basi, ricca in G e C, dell’rRNA è molto costante in tutti i batteri, ma il DNA è ricco di A e T, dunque non poteva essere questo. È fatti l’RNA messaggero che trasporta l’informazione dal DNA genomico ai ribosomi dove avviene la sintesi proteina. Nel 1960 dopo l’iniezione con fago T4 la sintesi proteica si ferma e vengono prodotte solo el proteine fagiche, principalmente si osserva che quello modificato era il messaggero, che può essere assai variabile. CODICE GENETICO : si hanno solo 4 nucleotidi corrispondenti alle 4 basi ma 20 tipi di aminoacidi. Questo perchè i nucleotidi possono specificare per un amminoacido solo se a gruppi. Dunque se ci fossero gruppi di 2 ne avrei solo 16, mentre con gruppi di 3 ne avrei almeno 64. Più di una tripletta codifica però per più aminoacidi: codice degenere. ESPERIMENTO NIREMBERG, LEDER, MATTHAEI = fanno esperimenti di biochimica con aggiunta di polinucleotidi i sintetici ad esempio di sole U ad un estratto cellulare contenente ribosomi, che formavano una catena polipeptidica contenente esclusivamente l’amminoacido Fenilalanina, dunque la tripletta UUU doveva codificare per fenilanalina. Il completamento del codice in questo modo dimostra che 61 triplette codificano per aminoacidi mentre le altre tre sono i cosiddetti codoni di stop. Da qui dunque leggendo la sequenza di un gene posso leggere la sequenza aminoacidica di un gene. ESPERIMENTO CRICK = capisce che dovesse esserci un adattatore per appaiare correttamente l’amminoacido alla propria tripletta. La molecola che meglio identifica una molecola di acido nucleico è un’altra molecole di acido nucleico: tRNA. Per codone indichiamo la tripletta che identifica per l’aminoacido e tRNA con l’ansa per l’appaiamento nell’’anticodon.  Dagli Appunti di Genetica ESPERIMENTO DI GRIFFITH 1928 Utilizza il batterio che provoca la polmonite, caratterizzato da una struttura esterna di diverso tipo, se liscio o rugoso può essere letale o meno. Somministrando il batterio a dei topi si osserva se sviluppano o meno la polmonite. Studia dunque due ceppi batterici S (smooth) e R (rough), in base alla struttura polisaccaridica. Quelli di tipo S sono di tipo virulento, il ceppo R non è virulento. Inattiva il ceppo S con il calore, in questo modo non è più in grado di essere virulento. Se questi ceppi S inattivati sono mischiati al ceppo R si ottiene comunque una soluzione virulenta. Quindi era presente un principio trasformante, che provoca il cambiamento da R a S, acquisendo un nuovo fenotipo virulento. Il principio trasformante è scoperto successivamente da: AVERY, MACLEOD E MCCARTY 1944 e scoprono che il principio è la molecola di DNA, che se viene inserita nel ceppo R lo fa diventare S. Quindi la molecola di DNA contiene le informazioni per rendere il batterio virulento. Ora si può isolare il DNA, ma dato che un tempo in questi esperimenti potevano essere altri gli elementi trasformanti. Bisogna trattare enzimi che eliminino eventuali proteine, RNA o DNA, selettivamente in più esperimenti e vedere dunque in quale caso rimane il principio trasformante o meno. BATTERIOFAGI Sono dei virus in grado in infettare i batteri. I più importanti sono i fagi ti-pari, ovvero T2, T3,...Sono in grado di attaccarsi alla membrana batterica e iniettare il proprio DNA, permettendo la duplicazione del loro DNA e degradazione del DNA batterico, producendo altri batteriofagi, scindendo poi la cellula batterica. Questo è detto ciclo litico. Per comprendere quale molecola permettesse la replicazione: ESPERIMENTO DI HERSHEY E CHASE 1952 marcando una molecola con fosforo radioattivo, e permettiamo la replicazione sempre con fosforo radioattivo, ugualmente con lo zolfo le proteine prodotte conterranno zolfo radioattivo. Le proteine sono sulla capsula, il DNA all’interno. In questo modo si può osservare quali sono le componenti che vengono iniettate nella cellula batterica. Escherichiacoli e T2 sono mischiati in una beuta, vengono fatti crescere in un terreno liquido, per ottenere i batteriofagi radioattivi viene aggiunto P32 o Z35. Questi formati sono usati per infettare altre cellule di escherichiacoli in un terreno non radioattivo, per riuscire a tracciare la molecola precedentemente marcata nel tempo. Attraverso centrifugazioni si recuperano due componenti: sfurmatante : (scarto) e pellet (con la progenie). Si guarda ora dove è presente la componente radioattiva. Nel caso dello zolfo nello scarto, nel caso del fosforo nel pellet, quindi nella progenie fagica radioattiva. Quindi il DNA costituisce il materiale genetico trasmesso alla progenie, e non le proteine. ESPERIMENTO DI FRANKEL-CONRAT E SINGER 1957 utilizzato il virus del mosaico del tabacco, in cui la componente genetica è RNA, circondato da proteine. Anche in questo caso si vuole vedere se la componente genetica fosse contenuta in queste proteine o nell’RNA. Sono utilizzati un virus di tipo A e un virus di tipo B, che infettavano diversamente. Formando un virus ibrido, con un RNA di un tipo e proteine dell’altro, e infettando le foglie del tabacco, verranno prodotti nuovi virus, equivalenti al tipo di virus presenti nell’RNA del virus ibrido.  ostacolo ESPERIMENTO DI FRANKLIN E WILKINS 1947 comprendono come è strutturata la molecola di DNA grazie alla diffrazione a raggi X. Viene utilizzata una radiazione a raggi X, che isola un fascio che colpisce il cristallo di una molecola, questo diffrange il raggio impressionando la lastra fotografica con un profilo di diffrazione caratteristico. Col DNA come cristallo si ottengono quindi informazioni sulla molecola, su zuccheri e fosfato all’esterno della molecola. ESPERIMENTO DI WATSON E CRICK 1953: attraverso dei modelli comprendono come è strutturato il DNA. Dato che si osserva la presenza di una struttura molto regolare, con due filamenti sempre alla stessa distanza, questo grazie ai legami a idrogeno tra le basi. Loro comprendono quindi il sistema di accoppiamento tra le basi, T e A (2 legami) e C e G (3 legami, + stabile). Si comprende quindi definitivamente la presenza di una doppia elica con filamenti antiparalleli, accoppiati grazie alle basi azotate e i legami a idrogeni che si formano. Questa struttura non si osserva nell’RNA perchè è costituito da un singolo filamento. Si osservano un solco minore e un solco maggiore, che si ripetono regolarmente, un passo dell’elica che si ripete regolarmente, ovvero 34 Armstrong, in cui sono presenti 10 basi che si accoppiano. Quindi la distanza tra una base e l’altra è di 3,4 Armstrong. Questa è la così detta forma B del DNA. nte più stabile.  Struttura e Modificazioni delle Proteine PROTEINE = polimeri i cui monomeri sono alpha-aminoacidi. AMINOACIDO = gruppo amminico, gruppo carbossilico legati al carbonio chirale detto carbonio alpha, e un gruppo R. R = residuo, catena laterale che caratterizza i diversi aminoacidi. Gli aminoacidi sono detti N-Aminoacidi, ovvero i 20 che corrispondono ai codoni del codice genetico. Possono essere polari, non polari, acidi, basici, neutri. I legami covalenti sono ad alta energia, nel range delle kcal/mol. Dunque per la formazione, polimerizzazione degli aminoacidi, poichè si formano legami covalenti, c’è la necessità di un enzima che catalizzi la reazione. / LEGAME PEPTIDICO = legame che si forma fra due aminoacidi, durante la sintesi proteica. Un aminoacido mette in gioco un gruppo amminico e l’altro il gruppo carbossilico. Si forma il legame covalente con una reazione di condensazione e la perdita di una molecola d’acqua. È un legame planare in trans. I carboni alpha chirali potranno poi ruotare. OLIGOPEPTIDE O PEPTIDE = catena di aminoacidi che si forma crescendo in una sola direzione attaccando al gruppo : carbossilico i nuovi aminoacidi. Si scrive la molecola da sinistra a destra, dall’amino terminale al carbossi terminale. LEGAME A IDROGENO = si forma tra dipoli, sono legami molto deboli tipici delle molecole di acqua o di dipoli in macromolecole. Possono essere fondamentali per determinare la struttura delle macromolecole. LIVELLI STRUTTURALI DELLE PROTEINE Sono 4 livelli. ˜STRUTTURA PRIMARIA = sequenza degli aminoacidi ˜STRUTTURA SECONDARIA = viene assunta uscendo dal ribosoma, possono essere alpha-elica o beta-foglietto. Ci sono aminoacidi che favoriscono una o l’altra. - alpha-elica = si forma un’elica destrorsa con un passo fisso. Viene stabilizzata da vari legami a idrogeno tra l’ossigeno del gruppo carbossilico e l’idrogeno legato all’azoto. Spesso rappresentata con un cilindro. - beta-foglietto = struttura più rigida e planare che espone i residui verso l’alto o il basso. Quando si ripiega può avere sequenza antiparallela e anche in questo caso formano legami a idrogeno. Spesso rappresentata come una freccia. ˜STRUTTURA TERZIARIA = in ambienti acquosi si ripiegano ulteriormente, mix di alpha elica e beta foglietto. Intervengono i residui aminoacidici. Possiamo così avere interazioni elettrostatiche, idrofobiche, ecc. Ci sono poi particolari legami della cisteina tra zolfo e zolfo. Sono tutte interazioni a bassa energia, tranne quest’ultimo legame covalente detto ponte disolfuro. Questo porta a ripiegamenti stabili tra aminoacidi più o meno vicini. I ponti disolfuro stabilizzano specifiche conformazioni nelle proteine secrete o id membrana. PDI = proteina disolfuro isomerasi nel Reticolo Endoplasmatico Rugoso. L’enzima ha due cisteine legate da questo ponte, nel suo sito catalitico accetta due idrogeni, si riduce, e forma il ponte. L’isomerizzazione del legame peptidico planare, che coinvolgono la Prolina, grazie alla peptidil prolil isomerasi, favoriscono i ripiegamenti della struttura, da trans a cis nel carbonio alpha. Dunque questi due enzimi possono generare delle modificazioni. ˜STRUTTURA QUATERNARIA = più proteine si uniscono per formare un complesso proteico con una caratteristica abilità funzionale. Si genera in proteine che interagiscono con altre proteine. Spesso i fattori di trascrizione interagiscono coi dimeri, a formare strutture quaternarie dimerizzando. Ci possono essere omodimeri o etero dimeri, in base a se ci sono interazioni tra proteine uguali o diverse. Una classica struttura quaternaria è quella dell’emoglobina, formate da quattro catene e un gruppo EME. SEQUENZE SEGNALE = sequenze di aminoacidi che servono alle proteine per essere indirizzate nei diversi compartimenti della cellula. Nel momento in cui è prodotta una nuova proteina, questa deve essere trasportata dove è richiesta, viene dunque riconosciuta la sequenza segnale caratteristica che permette così lo spostamento. DOMINIO PROTEICO = è una grande porzione di proteina. Una volta che si forma la struttura secondaria, varie parti della proteina possono ripiegarsi ulteriormente andando a formare il così detto dominio proteico. Questo è dunque una porzione di proteina con strutture specifiche con una certa attività funzionale. Ricordati che sequenza e dominio sono diversi se no rischi la morte. ATTIVITÀ ENZIMATICA SUBSTRATO = entra nel sito attivo catalitico dell’ enzima ENZIMA = molecola con una regione detta sito attivo/ catalitico che permette la modifica del substrato. Non sempre sono proteine. SITO ATTIVO = vi entrano uno o due substrati per venire modificati. In questo devono essere presenti residui aminoacidi per permettere una posizione favorevole dei substrati. Possono così avere differenti CAMBIAMENTI CONFORMAZIONALI per permettere all’enzima di catalizzare la reazioni. Da qui in poi si parla di proteine eucariotiche. MODIFICAZIONI POST-TRASLAZIONALI DELLE PROTEINE: la proteina è prodotta poi può subire queste modifiche. A livello di: - Conformazione - Interazioni intra/inter-molecolari - Interazioni proteine-membrana - Localizzazione su cellulare/secrezione - Stabilità e degradazione - Aggregazione FOSFORILAZIONE = durante eventi cellulari. È regolata da chinasi che usano ATP utilizzando il fosfato in posizione gamma come donatore. Attaccano particolari aminoacidi con un gruppo ossidrile. Le fosfatasi invece rimuovono il fosfato. Coinvolgono Tirosina, Serina, Treonina. Mettono una carica acida. ACETILAZIONE = Coivolge Lisina. L’85% delle nostre proteine ha all’amminoterminale una modificazione con acetile per stabilizzare. È effettuata dall’N-terminalacetilasi. Viene eliminata la carica basica positiva, questo ha una forte influenza tra una proteina basica e il DNA acido, è infatti ciò che può succedere negli istoni. METILAZIONE = avviene grazie alla metiltransferasi. Può avvenire su proteine o istoni. Vengono modificate Lisine, Arginine. Il gruppo metilico è idrofobico e non porta cariche. Ha effetti molto diversi da acetilazione, ma possono coesistere sullo stesso residuo. GLICOSILAZIONE = è una modificazione che avviene nel reticolo endoplasmatico rugoso. Si può avere O-glicosilazione o N- glicosilazione. Coinvolgono Serina, Treonina, Asparagina. MODIFICAZIONE CON LIPIDI = quando a un residuo è legato un lipide, questo tende ad ancorarsi alla membrana cellulare. UBIQUITINAZIONE => DEGRADAZIONE MEDIANTE PROTEOSOMA Una proteina è eliminata e l’altra invece agisce, tutto è regolato da un controllo. Fino al 30% delle proteine neo sintetizzate possono essere rapidamente degradate in quanto difettose. C’è un controllo a valle che va a etichettare la proteina come difettosa in modo che venga degradata dal proteosoma. La proteina viene modificata grazie all’ubiquitina. Quest’ultima è a sua volta una proteina che si lega al gruppo carbossiterminale grazie alla Lisina della catena di ubiquitina, si forma così una catena che serve ad etichettare la proteina difettosa. Esistono dunque enzimi per il trasporto dell’ubiquitina al substrato. Struttura del DNA DNA = polimero, macromolecola, i cui monomeri sono nucleotidi. Le informazioni raccolte da vari studi hanno permesso di definire a Watson e Crick che la sua struttura è una doppia elica, con un appaiamento tale che il numero di A sia uguale al numero di T e il numero di C sia uguale al numero di G. È un’elica destrogira simmetrica in cui il passo è di 34Å, un giro è 10,2nm. I gruppi fosfato compongono lo scheletro dell’acido nucleico. Vi sono solco maggiore (2.2nm) e solco minore (1,2nm), in base all’ appaiamento delle basi. Proteine con struttura ad alpha-elica interagiscono con il DNA nel solco maggiore mentre alti fattori di trascrizione possono interagire col solco minore, come la tata binding protein. La catena peptidica è dunque un alternarsi di zuccheri e fosfati carichi negativamente che conferiscono caratteristiche acide. È idrosolubile. Il carbonio in posizione 5’ presenta un fosfato libero mentre in 3’ rimane un ossidrile libero. I tagli della catena effettuati da enzimi specifici ripristinano sempre il fosfato e l’ossidrile in queste posizioni. NUCLEOTIDE = lo zucchero è nominato da 1’ a partite dal carbonio legato all’ossigeno, fino a 5’ che non fa parte dell’anello. Le basi azotate si legano in 1’ mentre il fosfato in 5’. Lo zucchero può essere ribosio o desossiribosio in base RNA o DNA, questo è importante ad esempio per lo splicing, che può avvenire sempre solo quando vi è un ossidrile libero in 2’, dunque solo nel’RNA. NUCLEOSIDE = zucchero più base azotata ( la quale non si numera coi ‘ ) attraverso legame glicolisidico. L’azoto della base azotata che si lega è: quello in posizione 9 nelle purine; quello in posizione 1 nelle pirimidine; Si lega poi il fosfato con legame fosfoesterico. Sono numerati con lettere greche, in base alla vicinanza allo zucchero : alpha, beta, gamma. Il nucleotide che viene mutilato dalle DNA polimerasi è un nucleotide trifosfato, mentre ciò che rimane nella catena del DNA è un nucleotide monofosfato. BASI AZOTATE = anelli eterociclici che contengono carboni e azoti e sono planari. Uracile al posto della Timina in RNA, varia solo un grupo metile. Son perpendicolari allo scheletro LEGAME FOSFODIESTERICO = tra i vari nucleotidi. Si formano legami esterici tra il fosfato in 5’ di uno e l’ossidrile in 3’ dell’altro. Si legge sempre da 5’ a 3’. LEGAMI COVALENTI = i legami che si formano sono ad alta energia, per formarli e scinderli ci sono particolari enzimi. LEGAME A IDROGENO = + debole ma usato spesso da varie macromoleocole. Porta comunque a stabilità. Non c’è bisogno di particolari enzimi per scinderlo. Si formano tra gruppo chetonico della timina in posizione 4 e il gruppo amminico in posizione 6 dell’adenina. Dunque il donatore del 4 16 legame a idrogeno è l’ammina mentre l’accettore è 2 3 2 l’ossigeno. Si possono formare poi tra il gruppo amminico in 3 della timina e l’azoto in poizione 1 della adenina. 4 16 Tra citosina e guanosina c’è ne sono tre: tra 3 gruppo amminico in 3 di C e l’ossigeno in 6 di G, tra 1 e 4, tra 3 e 3 La somma di tutti questi legami a idrogeno dà la stabilità al DNA. L’RNA essendo a singolo filamento è invece molto più instabile. BASE Z = in natura oltre alle basi comuni possono esserci basi particolari come questa, che è stata trovata nei virus. Assomiglia all’adenina ma è in grado di formare tre legami a idrogeno grazie a un azoto in posizione 2. FILAMENTI ANTIPARALLELI = i filamenti sono antiparalleli e complementari. Il fatto che si impilano in modo così ordinato permette la formazione di legami covalenti tra basi adiacenti, portando così a danni al DNA.  TAUTOMERIA = le basi possono dare tautomeria cheto-enolitica che provoca distorsioni dell’elica dovuta all’appaiamento di basi scorrette. Ad esempio, la timina può essere presente in forma: Chetonica, si appaia normalmente con la adenina; Enolica, non si appaia più alla adenina perché ci sono due donatori di idrogeno→si appaia la guanina; BASE FLIPPING = solitamente le basi sono al centro, in questo caso la base ruota in modo da essere esposta e permetterne la metilazione, rimozione, verifica di complementarietà In natura il DNA si trova in certe CONFORMAZIONI SPECIFICHE date dal fatto che si trova in un ambiente acquoso: la cellula. È un ambiente idrofilico; a cui fanno eccezione solo alcune strutture prima tra tutte la membrana che è composta da lipidi, Il DNA, nella cellula eucariota, è conservato all’interno del molecole idrofobiche. o del mitocondrio, entrambi sono ambienti idrofilici. Qui assume una conformazione con un solco maggiore ed un solco minore, questa forma ha delle conseguenze sui legami ad idrogeno. Il solco maggiore è più largo e quindi se la proteina che interagisce con esso è ha una struttura ad alfa-elica, molto probabilmente interagisce con esso. Il solco minore invece è più piccolo e quindi predilige le iterazioni con proteine di struttura diversa tipo il beta- foglietto. Come fa la proteina ad interagire in modo specifico? Essa è in grado di formare nuovi legami che difficilmente portano alla rottura di legami ad idrogeno già presenti nell’elica; piuttosto si ha la creazione di nuove interazioni che seguono un codice. Il codice permette di leggere le basi perché a seconda della base, che è presente nella catena, e si prende in considerazione il solco maggiore o quello minore, si possono formare differenti legami e in diverse posizioni. Nel solco maggiore se c’è una citosina o una guanina sulla destra, la proteina può formare nuovi legami con l’azoto che è accettore oppure l’ossigeno che è anch’esso accettore. È presente anche un idrogeno legato all’azoto, gruppo donatore. Il gruppo metilico è più idrofobico. A seconda di dove può formare legami ad idrogeno la proteina legge il DNA—> il solco maggiore e il solco minore permettono interazioni diverse. Con guanina alla sinistra il codice è AADH, ovvero: accettore, accettore, donatore, idrogeno (idrogeno in sé, non legato ad altri atomi elettronegativi o comunque diversi dal carbonio, non è un donatore). Se la citosina fosse a sinistra, quindi la guanina a destra, la sequenza sarebbe opposta. Nel solco minore presenta meno specificità per questo codice: la variazione di basi non causa una differenza così importante nel codice. Mi raccomando più che altro ricorda che le proteine che si legano al DNA non rompono legami a idrogeno ma formano nuove interazioni perchè le basi azotate hanno nuovi gruppi accettori e donatori di legami a idrogeno e. In base a questo le proteine potranno interagire o meno. VARIE STRUTTURE DNA Il DNA normalmente è in una struttura B, soprattutto in ambiente acquoso, ogni giro di elica è composto da 10 nucleotidi. In situazioni di bassa umidità la conformazione cambia e porta ad avere 11 nucleotidi per giro. Il DNA-Z è caratterizzato ha una struttura più allungata. Durante le ricombinazione del DNA si formano le strutture TRIPLEX di DNA, tre filamenti, che possono formarsi durante la ricombinazione durante i processi di riparo;  DENATURAZIONE = le due eliche del DNA possono essere separate in maniera reversibile, ad esempio ad alte temperature, oppure in ambiente alcalino. Si può poi rinaturare il DNA facendo scendere la temperatura lentamente, cosicché il DNA si riappai seguendo complementarietà. IBRIDAZIONE = Si possono formare ibridi tra acidi nucleici a singolo filamento. Posso avere omoduplex se entrambi i filamenti sono della stessa specie, eteroduplex se sono si speci differenti con alcune basi non appaiate. EFFETTO IPERCROMICO = Usando la luce ultravioletta si eccitano gli anelli aromatici, dunque se ho DNA a doppio filamento ho un’eccitazione bassa poiché le basi sono nascoste, ma una volta che si aumenta la temperatura si osserva che la curva di assorbimento con lo spettrofotometro aumenta notevolmente, perchè il filamento si apre e le basi sono esposte. Se siamo in presenza di promotori, dunque in zone ricche di G e C, quindi molti legami a idrogeno, saranno necessarie temperature maggiori per denaturare. CROMOSOMI Batteri = sono per la maggior parte circolari a doppio filamento. Umano = 22 cromosomi + 1 sexxx , sono molecole lineari Virus = esistono virus a DNA come ad esempio adenovirus (singolo filamento) o adenoassociati (doppio filamento). Cellula eucariotica = il 99% del dNA è nel nucleo, il restante è nel mitocondrio (piccolo, circolare, apolide, contiene 37 geni essenziali per il mitocondrio, 13 enzimi per ATP, 22 transfer per proteine, 3 geni per rRNA e formare ribosomi). Procarioti = è DNA circolare ma altamente ripiegato, può formare un toroide in quello detto coiling. È altamente ripiegato o non ci starebbe all’interno della cellula. Ci sono vari enzimi importanti per ripiegare questo DNA. Si usano piccole molecole circolari per modificare il DNA e fare ingegneria genetica. Ci sono girasi per facilitare l’impacchettamento. Ci sono poi le TOPOISOMERASI che rilassano il DNA e permettono di tornare n varie conformazioni. Il DNA può poi essere spezzato da enzimi per rompere uno o più filamenti. Nel primo caso posso avere rotazione maggiore, e questo tipo di rottura del legame fosfodiesterico di un singolo filamento è detta nick. Ci sono due classi di topoisomerasi, di tipo I e di tipo II, nel primo caso forma i nick facendo rilassare una singola parte, nel secondo caso viene spezzato il doppio filamento. Topoisomerasi I = Questo enzima nel sito catalitico ha un tirosina, si forma un intermedio con l’enzima tramite un legame tra l’idrogeno della tirosina e il fosfato in 5’ (il DNA si rompe sempre lasciando il fosfato in 5’ e il gruppo OH in 3’). La tirosina viene lasciata e la molecola si chiude. Il dominio 3 (verde) è dove c’è la tirosina ed è quello che rompe il filamento. Gli altri domini tengono fermo l’altro capo del DNA tagliato. L’enzima ha diversi domini proteici uno è il sito catalitico che spezza il legame fosfodiesterico e gli altri servono per tenere il capo spezzato vicino all’altra catena, pronto per la ricongiunzione. Topoisomerasi II = usa ATP e lega un filamento di DNA dove c’è il sito catalitico del legame e di taglio, rompe entrambi i filamenti, poi vi è un dominio che lega per l’appunto ATP dalla cui scissione ottiene l’energia necessaria per la modifica del DNA. L’ossigeno della tirosina attacca il legame fosfodiesterico, questo grazie al fatto che ci sono degli ioni che spostano le cariche rendendo il fosfato attaccabile dall’ossigeno, ad esempio grazie gli ioni magnesio. Alla fine della replicazione del DNA, le due molecole rimangono concatenate come anelli di una catena, ma devono segregare nelle cellule figlie, per questo è necessaria l’azione della topoisomerasi, in cui viene preso uno di questi DNA, viene legato e va ad utilizzare il dominio per legare l’ATP, che fa cambiare la conformazione alla proteina e far attraversare l’altra molecola, risolvendo il concatenamero.  Struttura della Cromatina CROMOSOMA NEI PROCARIOTI Per la maggior parte è una molecola circolare, con alcune eccezioni come la Borella nella quale è lineare, o come in Brucella in cui vi è più di una molecola. Uno dei più studiati è l’Escherichia coli il quale ha una molecola circolare. La dimensione del genoma è espresso come numero di basi. Per i procarioti sono nell’ordine di 4,6Mb. Nel 1982 Dickerson sulla rivista Scienze pubblica le dimensioni medie di un paio di basi, bp: - 1bp = 0,33nm - 10pm = 0,33µm - 1Mp = 0,33mm - 1Gb = 0,33 m Dunque se il genoma dell’Escherichia coli è costituito da 4,6milioni di paia di basi, allora la lunghezza è di 1mm secondo il calcolo di Dickerson. I batteri sono però mille volte più piccoli rispetto a questa dimensione del genoma, dunque come fa ad accomodarsi una molecola di queste dimensioni all’interno di una cellula di 1µm? Si parla di una regione detta NUCLEOIDE, il DNA è tutto ripiegato in questa regione, permettendo di far rientrare tutto questo materiale in una porzione così piccola. Questi ripiegamenti sono possibili grazie a particolari proteine. CROMOSOMA DI E. COLI - Il DNA è associato è a poliammine cationiche, spermina e spermidina, che ne neutralizzano le cariche negative evitando la repulsione. - È associato a proteine come H-NS, che legano regioni ricche in A e T, permettendo dunque i ripiegamenti. Vi sono 20000 molecole per batterio. Sono formati da dimeri, se ne trova uno ogni circa 400bp. Permettono un super avvolgimento negativo del DNA. Agisce in regioni più vicine, in quanto si forma un’ansa. - È associato a proteine di mantenimento della struttura del cromosoma, SMC, che formano una sorta di anello all’interno del quale passano due fili che vengono avvicinati. Possono avvicinare regioni più lontane. CROMOSOMI NEGLI EUCARIOTI Le cellule eucariotiche sono generalmente 10 volte più grandi di quelle dei procarioti, dunque nell’ordine dei 10µm. È distinguibile e dunque analizzabile il nucleo. Vi sono varie fasi della cellula in cui il DNA si trova in fasi diverse. - Interfase = il DNA è disordinato dunque per essere visto ci sono di particolari sonde Solo nella fase di mitosi possono essere distinguibili tutti i cromosomi umani e sono osservabili al microscopio ottico, mentre sono allineati in piastra metafasica. Possono essere distinti in base a colorazioni. Dimensioni, posizioni dei centromeri, ecc. SHRINK AND STRETCH Durante il ciclo cellulare i cromosomi dunque si impacchettano e si rilassano. Usa le terminologie corrette mi raccomando, un filamento di DNA, due filamenti, cromatidi uniti nel centromero, ecc. NUMERO DI CROMOSOMI E COMPLESSITA’ Sono direttamente correlate? Si pensò che fosse così, ma in realtà manca questa correlazione, vi sono altri modi per sviluppare complessità negli organismi. Su 20000 geni nel cromosoma umano vi sono 3*10^9 nucleotidi. La complessità dipende più dal genoma in sè che dal numero di cromosomi. CROMOSOMI ECARIOTICI Sono costituiti da DNA molto avvolto a proteine istoniche, a proteine non istoniche, e ad RNA. Sono numerati dal più grande al più piccolo, più i cromosomi sessuali. Vengono differenziati in base a dimensione, posizione del centromero, per le colorazioni, attraverso sonde per ricercare sequenze specifiche. Il DNA è associato a proteine e forma un complesso altamente compatto: la CROMATINA. Queste proteine fanno si che non vi siano troppe repulsioni tra cariche negative, e permettere dunque l’impacchettaento. I ricercatori hanno osservato che si possono trovare sia fibre da 10nm sia fibre da 30nm. Questi sono due livelli successivi e differenti di impacchettamento. 1. NUCLEOSOMA = 10nm È la tipica struttura a collana di perle, ovvero il DNA attorno a proteine istoniche. Tra un nucleosoma e l’altro si trova il DNA linker, che dà indicazioni sulla fibra da 30nm, costituito da 20 a 60bp. È caratterizzato da digestioni con nucleasi micrococcica. Questa nucleasi non può attaccare dove sono presenti le proteine, dunque può spezzettare il DNA linker, lasciando intatti i nucleosomi, che possono essere definite come la regione di cromatina dopo digestione con endonucleasi micrococcica. È composto da 147bp e 4 tipi di proteine, che sono detti istoni. Sono gli istoni H2A, H2B, H3, H4. Basta un alta quantità di sale per separare le cariche e favorire il distacco tra istoni e DNA. ISTONI = sono piccole proteine ricche di aminoacidi basici, in particolare modo lisina e arginina, il DNA acido può per elettrostaticità legarsi a queste proteine basiche. Sono molto piccole, da 15000 a 21000 Dalton. Ci sono anche istoni che non fanno parte del nucleosoma ma che sono importanti per ulteriore complessamente, come H1. Per conservato si intende che la proteina ha una sequenza di aminoacidi, in organismi diversi, molto simile  Gli istoni sono rappresentati con dei cilindri, quindi capiamo che sono proteine con almeno 3 alphaeliche. Tutti hanno le estremità aminoterminale e carbossiterminale liberi. Dunque nella prima parte delle proteine istoniche vi sono strutture poco strutturate, che vengono chiamate code istoniche (anche se sono all’inizio della proteina), le quali sono regioni molto regolatorie, che saranno molto importanti per la regolazione genica. Vi sono delle alpha-eliche più grandi nel mezzo che intervengono nella dimerizazione delle proteine. Le altre alpha eliche si ripiegano con interazioni con quella centrale. In particolare i dimeri si formano tra : H2A e H2B. Si forma forma un tetramero tra: 2 istoni H3 e 2 istoni H4. Quest’ultimo è il punto iniziale in cui il tetramoero inizia ad avvolgersi. Poi verranno richiamati i due dimeri H2A e H2B. All’intero della cellula le proteine per l’assemblaggio devono essere trasportate. Ci sono particolari proteine Chaperon che hanno punti di legame che permettono di trapsportare: - CAF- 1 il dimeri H3H4 - NAP-1 il dimeri H2AH2B Le code istoniche che fuoriescono dal nucleosoma, sono ricche di lisina e dunque intervengono nelle interazioni tra cromosomi per impacchettare ulteriormente la cromatina. Queste lisine possono essere acetilate, diminuendo le interazioni con il DNA adiacente e permettendo il distacco, oppure possono essere metilate. Ci sono poi altri aminoacidi come le serine, che possono venire fosforilate. Dunque queste cariche possono essere schermate per modificare le interazioni. 2. SOLENOIDE e ZIG ZAG fibra da 30nm, il DNA si può compattare fino a 40 volte. È il secondo livello di avvolgimento. Entra in gioco l’istone H1. Vengono avvicinati i tratti entranti e uscenti del nucleosoma, portando ad ulteriori ripiegamenti. Questa struttura è detta solenoide. Ci sono però delle regioni in cui la fibra da 30 non presenta questo foro centrale tipico del solenoide. Si può così avere una fibra a zig zag, quando si ha particolare DNA linker lungo, in modo che quest’ultimo copra il buco centrale, e non si osservi la forma a solenoide. Le code istoniche intervengono e stabilizzano le cariche repulsive tra il DNA. Quando necessario per permettere la trascrizione queste si possono rilassare, ad esempio attraverso acetilazione. L’acido nucleico così inizia a respingersi e si apre. 3. ANSE ulteriore ripiegamento che viene denominato scheletro. Le proteine che costituiscono lo scheletro, a cui si agganciano i cromosomi, sono lamine e topoisomerasi II. Dunque anche in interfase, non è disordinato, semplicemente ci sono tutte queste interazioni. La fibra da 30nm viene ripiegata e si aggancia alle lamine. La toposimerasi taglia e richiude. Sono enzimi molto attivi per il ripiegamento della cromatina. I punti in cui l’alpha elica è ripiegata è ricca in A e T in quanto essendoci solo due legami a idrogeno, sono più facili da ripiegare. Sono dette zone: - SAR scaffold attachment regions - MAR Martix attachment regions 4. ANELLI Il DNA cromosomico viene ulteriormente avvolto grazie a proteine che formano degli anelli, come: - Condensine che si legano in fase. Per compattare la fibra di cromatina durante la fase M. - Coesine che attaccano la cromatina durante la replicazione in fase S, imbarcano i cromatidi fratelli. Queste proteine sono fondamentali per la regolazione dell’espressione genica. 5. CROMOSOMI Durante la fase M posso riconoscere i cromosomi in piastra metafisica e osservare centromeri e telomeri. A livello del CENTROMERO l’istone H3 viene sostituito dall’istone CENP-A. Questo può far si che si leghino i componenti del cinetocore in modo specifico. CENP-A è importante anche per la replicazione. Eliminandola infatti si sono notati riarrangiamenti e traslocazioni nella forca di replicazione. Pare possa svolgere dunque più di una funzione. Altri istoni particolari sono gli: ISTONI H2A.X che a volte viene sostituito all’istone H2A. Questo ha una sequenza di tirosina che può essere fosforilato. È coinvolto nei sistemi di riparo del DNA.  Replicazione del DNA La replicazione è SEMICONSERVATIVA, scoperto nel 1958 grazie a Meleson e Stahl grazie ad esperimenti con azoto pesante e leggero. Si parte da un filamento parentale stampo (giallo) che viene copiato in un filamento di nuova sintesi (rosso), e così via per le diverse replicazioni. Il mattoncino per la replicazione è il deossinucleotide trifosfato. La nuova catena nascente sarà antiparallela rispetto a quella utilizzata come stampo. Sono necessari enzimi per far si che si riesca a formare il legame tra nucleotidi (legame fosfodiesterico). Vi sono meccanismi perchè venga assicurata una replicazione fedele. La replicazione ha una forte processività dunque ci mette poche ore. Sono necessarie varie molecole accessorie per assistere l’enzima nella replicazione. DNA POLIMERASI = è l’enzima che per l’appunto polimerizza la catena di DNA. Per essere copiato il DNA deve prima essere denaturato, così che ogni filamento possa fornire da stampo, dunque ci sono almeno due polimerasi attive durante la replicazione. Vedremo poi che in realtà ce ne sono addirittura 3. La DNA polimerasi richiede un PRIMER , o innesco, poichè non può sintetizzare nuovo DNA se non è presente un ossidrile in 3’ libero che possa fare da innesco ai nuovi nucleotidi. Questo è una piccola sequenza di nucleotidi in grado di appaiarsi al filamento stampo. Deve appaiarsi perfettamente alla DNA polimerasi per riuscire a polimerizzare ed appaiarsi nucleotidi liberi. La polimerasi usa come substrato il DEOSSIRIBONUCLEOTIDE TRIFOSFATO, in quanto sfrutta la rottura del fosfato per trarre l’energia necessaria alla AG = 3,5 polimerizzazione. }7k¥ Si forma un legame tra l’ossidrile in 3’ e il fosforo in alpha. Viene rilasciato un ? pirofosfato con rilascio di energia che , permette la formazione del legame assieme alla rottura del legame fosfodiesterico. Keq -105 La direzione di polimerizzazione è 5’-3’, ovvero aggiungo sul 3’ nuovi nucleotidi. AG =3, 5 3,5 è l’energia per la formazione del legame. 3,5 per la rottura del fosforo beta e gamma. In tutto quindi 7kcal/mol con una costante di 10^5. ANALOGHI DI NUCLEOTIDI Alcuni farmaci si basano proprio sulla generazione di molecole che possono essere usate dalla DNA polimerasi che non riesce a discriminarle pensando siano nucleotidi naturali. Ad esempio nel caso della bromodeossiuridina BrdU, che si riesce a legare come se fosse un timina. Ha un bromo al posto del metile. Questa può essere incorporata nel DNA nascente, ma il metile non interagisce con legami a H e può essere sostituito con un Br. Per quanto riguarda invece farmaci chemioterapici vengono usati analoghi dei nucleotidi che bloccano la produzione di DNA, per far si che non si possa produrre altro DNA tumorale, ma hanno effetti collaterali anche sui tessuti normali. Uno di questi farmaci é la citosina arabisonide AraC, che al posto del desossiribosio ha un arabinosio, questo viene visto dalla DNA polimerasi come un nucleotide, ma poi il 3’ è posizionato in modo sbagliato e non riesce a formare nuovi legami. Una volta inserito si blocca. L’aciclovir è una molecola che si trova nei farmaci che bloccano l’attività della DNA polimerasi: sono i farmaci antivirali che costituiscono una terapia più specifica senza effetti collaterali. Aciclovir può essere utilizzata contro Herpex Simplex ed Herpex Zooster, il trattamento può essere via orale o cutanea, tramite una pomata. L’aciclovir è una molecola che presenta una guanina ma è sprovvista di zucchero. Se la cellula è infetta dal virus esso esprime degli enzimi virali tra cui HVS-1 timina chinasi, che fosforila l’ossidrile; ci sono altri enzimi che terminano la fosforilazione generando una molecola con una guanina e 3 fosfati. La polimerasi utilizza la molecola prodotta per sintetizzare il nuovo filamento. Gli enzimi virali fosforilano una molecola che può esser inserita nel DNA ma mancando l’anello e dell’ossidrile in 3’ la sintesi viene bloccata e muoiono le cellule infettate dal virus e non le altre cellule. (Cfr topi transegenici);  STRUTTURA paragonata a una mano destra, in cui si distinguono: dita, palmo, pollice. Il PALMO è dove avviene la reazione di polimerizzazione. Possono entrare indipendentemente tutti i nucleotidi poi ci sarà un sito catalitico diverso per ogni nucleotide. Contiene dunque il sito catalitico, ed è quindi associato al neo-DNA, mentre lo stampo a singolo filamento viene piegato in modo da non passare fra pollice e dita. È caratterizzato da betafoglietti. Quando entra dunque avviene un controllo di fedeltá. Deve avvenire una reazione tra fosfato alpha e ossidrile in 3’ del primer. Per formare il nuovo legame infatti il nuovo nucleotide deve trovarsi in posizione e distanza corrette. Uno dei fattori determinanti é quindi la formazione di legami a idrogeno tra le basi, che determina la giusta angolazione, e serve dunque a testare il giusto appaiamento. La concentrazione di ribonucleotidi nel nucleo è 10 volte maggiore di quella dei d-ribonucleotidi del DNA. Sebbene 10 volte più concentrati dei dNTP, i rNTP vengono incorporati a velocità 1000 volte minore. Motivo: il sito attivo della DNA Pol è troppo piccolo per accogliere il 2’-OH. Due amminoacidi discriminatori interagiscono con lo zucchero: se uno dei due muta in uno amminoacido più piccolo, DNA Pol riduce fortemente la sua capacità discriminatoria nei confronti dei rNTP. Esiste dunque una regione con aminoacidi discrimatori, ovvero sequenze aminoacidi che che formano delle interazioni di Van Der Walls con la regione ciclica dello zucchero. Questi permettono di porre i nucleotidi alla distanza necessaria per la formazione del legame. La presenza dell’OH nel caso del ribosio per esempio impedisce di polimerizzare. Non si formano così legami a idrogeno e il nucleotide esce subito. Il processo avviene a velocità elevate. La DNA polimerasi deve posizionare in modo preciso l’ossidrile in modo da formare correttamente il legame fosfodiesterico. La struttura nel sito catalitico forma una curva grazie a interazioni con lo scheletro del DNA. Se potesse appaiarsi in modo casuale potremmo avere l’inserzione di un nucleotide saltandone uno. Il ripiegamento invece fa si che il nucleotide arrivi parallelo permettendo di entrare, il successivo è invece posizionato in modo che non possa appaiarsi, riducendo notevolmente la possibilità di errore. Questa struttura ripiegata è dunque necessaria per il corretto appaiamento del nucleotide in modo che ci sia sempre solo un nucleotide disponibile entrante, per appaiamento di base dopo base. Il palmo é caratterizzato da beta foglietti che interagiscono con lo scheletro. Ogni DNA può essere replicato, non va alla ricerca di sequenze specifiche, può replicare qualunque DNA basta ci sia l’innesco. È necessario nel sito catalitico degli ioni bivalenti metallici (Mg2+ e Zn2+). Servono fer facilitare l’interazione. Servono a spostare le cariche di idrogeno e ossigeno in modo che il fosfato in alpha possa essere attaccato dall’ossigeno carico negativamente. Se non sono presenti questi ioni la DNA polimerasi non funziona. Nello specifico : - Il primo ione è importante per spostare la carica dell’idrogeno e generare un ossigeno negativo; - Il secondo ione sposta le cariche di un altro ossigeno così che il fosfato in α possa essere disponibile per l’attacco nucleofilo; Gli ioni magnesio sono essenziali anche per fare le pcr.  Le DITA servono a fare entrare i nucleotidi. Entrano in contatto con lo stampo, piegando di 90° il legame fosfodiesterico posto subito prima del sito catalitico, in modo da esporre solo la prima base dello stampo nel sito attivo. Il POLLICE non è coinvolto nella catalisi ma interagisce con il neo-DNA mantenendo l’innesco in posizione. PROCESSIVITÀ La catalisi è un evento rapido: 1000 basi /s nei batteri. Dipende dall’alta processività dell’enzima che corrisponde al numero di basi aggiunte al secondo. Il valore di questo parametro varia da poche basi a > 50000, a seconda della DNA polimerasi. Non dipende dalla velocità di sintesi, che è sempre la stessa (1 base/ms), ma dalla diversa probabilità di distacco della DNA Pol dallo stampo, in quanto la velocità di (ri) complessazione è il passaggio più lento (1 / s). La elevata processività dipende dalla facilità di scorrimento della DNA polimerasi sul DNA, che avviene in modo sequenza- indipendente, grazie alle interazioni elettrostatiche fosfati- pollice e solco minore- palmo. L’incorporazione di una base provoca un parziale rilascio dell’enzima (rottura dei legami a H nel solco minore), che permette un rapido avanzamento di una bp. La processività è fortemente aumentata dall’interazione fra la DNA Pol e una proteina a forma di anello, che circonda il DNA durante la sintesi. Il legame alla giunzione innesco viene mediato dallo stampo grazie a interazioni elettrostatiche. CORREZIONE DI BOZZE Ci possono essere tautomeri per le basi azotate che portano la DNA polimerasi a commettere un errore di 10^10, sebbene la probabilità sia 10^5. Questo perchè man mano che polimerizzazione avviene la correzione di bozza, ovvero quando vi sono nucleotidi sbagliati, allora la DNA polimerasi stacca questo nucleotide e mette quello giusto. Ha dunque attività esonucleasica 3’-5’. Questa attività è detta PROOFREADING. Se l’appaiamento è scorretto l’ossidrile non è più posizionato nella giusta posizione a livello del pollice, la giunzione stampo è destabilizzata. L’OH rimane con un orientamento che non favorisce il legame successivo, la DNA polimerasi elimina l’ultimo nucleotide e riparte. Questa attività non si trova nel sito catalitico, ma si trova proprio in un dominio diverso. Viene portato il filamento con la base sbagliata nel sito endonucleasico. Non riesce a collegare quello successivo. Nella stessa proteina va in un dominio diverso con strutture specifiche detto dominio esonucleasico. Dunque non è una piccola sequenza ma una regione importante. Avviene un cambio conformazionale con distacco del nucleotide singolo errato. FORMAZIONE PRIMER Nella cellula ci sono almeno due polimerasi. Nei procarioti vi sono la primasi e la DNA POL III. Viene prodotto un primer di RNA. Viene formata una piccola sequenza in modo che ci sia un -OH libero da parte della primasi, che essendo una RNA polimerasi può lavorare ex novo. Questa piccola sequenza prodotta può legarsi al DNA perfettamente e offrire un 3’ libero. Negli eucarioti vi sono la DNA pol alpha e la DNA pol gamme e epsilon. Serve un enzima che faccia prima un pezzo di RNA poi il DNA. Non si chiama primasi, la la polimerasi alpha ha comunque una subunità con attivitá primasi a è una polimerasi a che riescono a finire l’innesco con DNA, perché non possono usare RNA come primer. FORCELLA REPLICATIVA La replicazione del DNA procede contemporaneamente e in modo diverso sui due filamenti. Nella cellula i 2 neo-filamenti vengono replicati contemporaneamente, perché i filamenti parentali vengono separati in modo che ognuno funga da stampo. La zona di separazione, dove avviene la sintesi dei 2 nuovi filamenti, è detta forcella replicativa (RF). La RF si sposta continuamente verso il DNA non ancora srotolato, assieme ai filamenti separati che fungeranno da stampo. L’antiparallelismo della doppia elica complica la replicazione simultanea dei due filamenti, poiché la DNA Pol può sintetizzare solo in direzione 5’-3’: solo uno dei 2 filamenti stampo può essere copiato in modo continuo, in direzione di apertura della forcella, ed è detto filamento guida o continuo (leading strand). Anche l’altro filamento deve essere sintetizzato dalla DNA Pol in direzione 5’-3’, cioè in direzione opposta a quella di apertura della forcella, quindi in modo discontinuo. E’ detto filamento lento o ritardato (lagging strand), perché la DNA Pol deve disporre di una certa quantità di stampo prima di iniziarne la sintesi. Qui i filamenti sono molto corti e sono detti frammenti di Okazaki. La sintesi di un frammento discontinuo dura fino al terminale 5’ del frammento precedente. Questi frammenti, detti frammenti di Okazaki, variano come lunghezza fra 1000 e 2000 basi nei batteri e fra 100 e 400 basi negli eucarioti. Subito dopo la loro sintesi vengono uniti in un filamento continuo, quindi sono degli intermedi di replicazione. La necessità di creare un innesco per la DNA Pol è fornita da un enzima speciale, detta primasi, in grado di sintetizzare de novo, cioè senza innesco, corti frammenti (5-10 basi) di RNA primer (innesco), poi utilizzati dalla DNA Pol. La frequenza di utilizzo della primasi sui due filamenti è ovviamente diversa: sul filamento guida viene utilizzata una sola volta, sull’altro tutte le volte che viene iniziato un frammento di Okazaki. Dato che ad ogni forca replicativa vengono sintetizzate milioni di basi, la sintesi del filamento lento può richiedere centinaia di migliaia di frammenti di Okazaki, ciascuno col suo primer. La primasi, a differenza delle RNA Pol, che sintetizzano gli altri RNA cellulari, non richiede sequenze specifiche per iniziare la sintesi del primer, ma si attiva solo in associazione con proteine specifiche della replicazione RIMOZIONE FRAMMENTI DI OKAZAKI - Nei procarioti c’è un sistema diverso che permette di eliminare gli innesti, i frammenti di Okazaki. La DNA polimerasi I interviene nella rimozione dei frammenti di Okazaki e poi la DNA polimerasi III polimerizza e allunga il DNA a partire dai frammenti. È la DNA polimerasi I ad avere un’attività -3’ esonucleasica che le permette di rimuovere i frammenti lasciando un 5’ libero che fa da innesto per poi chiudere i frammenti di DNA, sistema di chiusura con riparo del DNA. DNA polimerasi I: riempie gli spazi vuoti lasciati dai primer dopo averli rimossi; è DNA riparatore e rimuove i primer→attività esonucleasica 5’-3’ e 3’-5’; attività nucleasica; DNA polimerasi II: ripara il DNA→attività esonucleasica 3’-5’ DNA polimerasi III : si occupa della replicazione, correttore di bozze→attività esonucleasica 3’-5’; Uno dei primi enzimi che si rese disponibile da utilizzare nei laboratori non corrisponde esattamente a quello che c’è in natura: ha solo un frammento Klenow→è una parte della DNA polimerasi I utilizzata dai batteri. Può essere utilizzata anche in vitro. - Negli eucarioti il primer viene rimosso dal una RNAasi H che elimina le sequenze di primer a RNA consentendo di avere un ossidrile in 3’ che fa da innesco all’azione della DNA polimerasi. Questa RNAasi rimuove in modo specifico l’RNA appaiato con catene di DNA→rimuove tutto il primer eccetto il ribonucleotide covalente attaccato al nucleotide di inizio del DNA. La rimozione del primer lascia un piccolo gap a cui si lega la DNA polimerasi riempiendolo fino a che non si ricostituisce il doppio filamento integro. Rimane però un’interruzione di un legame fosfodiesterico, NICK, tra l’estremità 3’ OH e l’estremità 5’ fosfato del filamento riparato. LIGASI = dopo la che la RNA polimerasi ha agito, bisogna chiudere il filamento. Intervie l’enzima DNA ligasi che utilizza ATP o NAD per formare un intermedio di AMP-enz Tutte le DNA polimerasi conosciute possono solo allungare un DNA o RNA preesistente (primer) e sono incapaci di iniziare una catena. I due filamenti del DNA duplex sono di polarità opposta ma tutte le DNA polimerasi catalizzano l’aggiunta di nucleotidi alla terminazione 3’-ossidrile di una catena nascente, pertanto i filamenti possono crescere solo in direzione 5’-3’. Le DNA polimerasi sono incapaci di aprire il DNA duplex al fine di separare i due filamenti che devono essere copiati. Dunque la denaturazione avviene ad opera di un enzima specifico: ELICASI. Questo può separare in entrambe le direzioni e non è polarizzata dunque. Necessita di ATP per rompere i legami a idrogeno. La struttura è simile a una ciambella per rompere i legami a idrogeno. È formata da 6 subunità identiche dal punto di vista proteico ma diverse per interazioni con ATP, ADP o nessuno dei due (2ATP, 2ADP e 2 senza). Queste si dispongono come una ciambella con un poro al centro di dimensioni di 13Å, dunque può avvolgere solo un filamento di DNA alla volta, perchè il doppio sarebbe troppo grande (20Å). Vi sono dei loop proteici senza strutture secondarie ben identificabili, nè alpha elica nè beta foglietto. Un anello per poter avvolgere deve prima aprirsi e poi chiudersi. Serve dunque un caricatore, loader, che serve per aprire e avvolgere il filamento singolo, dunque deve essere DNA già denaturato. La prima denaturazione verrà dunque fatta da altri enzimi. Una volta formata la bolla il caricatore può avvolgere le elicasi. Attaccata all’elicasi si trova la PRIMASI. È portata per sintetizzare il primer di pochi nucleotidi di DNA. Viene idrolizzato ATP permettendo di girare, in modo da svolgere il DNA. Man mano che viene utilizzato ATP questo viene poi ricaricato. Si formano così i loop proteici che tirano il DNA. Man mano che viene denaturato per far si che non si riavvolga dall’altra parte, agiscono le TOPOISOMERASI, per srotolare il filamento e permettere di procedere evitando superavvolgimenti. La II taglia i filamenti di DNA utilizzando ATP e facendo passare l’altro in mezzo.  Il DNA in ambiente fisiologico tenderebbe poi a rinaturarsi, dunque man mano che passa l’elicasi, si posizionano delle proteine al singolo filamento : SINGLE STRAND BINDING PROTEINS, che impediscono appunto che il DNA rinaturi. Agiscono per interazioni elettrostatiche con la carica negativa del DNA. Agiscono fino a che non passa poi l’elicasi. L’enzima deve sintetizzare lunghe catene di DNA, sarebbe in un certo equilibrio dinamico, quindi si lega e stacca ripetutamente, e andrebbe così a colpire sulla processività dell’enzima negativamente. Quindi sia in eucarioti che procarioti, la DNA polimerasi viene tenuta legata al suo stampo dalla così detta SLIDING CLAMP. Anch’essa è un anello che accomoda al suo interno DNA a doppio filamento. Lega la DNA polimerasi, mantenendola in posizione e permettendole di posizionarsi esattamente all’ossidrile in 3’ disponibile del primer, trovando il punto preciso graze al suo caricatore. È composta da: - 3 subunità nei fagi - 2 subunità per eucarioti e procarioti Sono regioni ripetute a 6 con diametro di 30Å, per questo riesce ad accomodarsi il doppio filamento (20Å). Negli eucarioti può essere nominata a volte PCNA (proliferating cell nuclear antigen), nome dato notando che fosse molto presente durante la proliferazione del DNA. Anche in questo caso c’è un loader, che usa ATP, apre momentaneamente l’anello e lo riavvolge attorno al doppio filamento di DNA Il loader ha un dominio proteico che interagisce nel punto in cui finsce il doppio filamento e inizia quello singolo, dunque riconosce dove si è fermata la primasi. Apre l’anello, riconosce il DNA a doppio filamento, la DNA polimerasi identifica il leader e la sliding camp dunque lo avvolge dietro, così la polimerasi ha lo spazio per mettersi in modo diverso staccando il loader. Così si ha lo spazio per far cadere l’ossidrile in 3’ nel sito catalitico. La sliding clamp è una proteina che si lega a molte altre proteine, alcune necessarie per la replicazione, come gli CHAPERON per il reclutamento degli istoni e i sistemi di riparo in modo da costituire il nucleosoma su cui si avvolge il DNA. OLOENZIMA = è il complesso che viene richiamato per il primer. I due filamenti vengono sintetizzati contemporaneamente per ridurre il tempo di permanenza del DNA come singolo filamento più fragile: una sua rottura fortuita spezzerebbe di fatto il cromosoma (riparo molto difficile). I due filamenti sono detti continuo e discontinuo. Quest’ultimo è generato dai frammenti di Okazaki. L’oloenzima viene reclutato a livello del primer, che deve quindi essere già sintetizzato. Le DNA polimerasi sono 3 e vicino al caricatore, legate dalle proteine TAU, che sono inflessibili e le legano. Il REPLISOMA è il complesso di RNA e proteine durante la sintesi del DNA. Man mano che la elicasi apre la doppia elica, scorrendo sul filamento lagging, il filamento leading viene copiato rapidamente, mentre l’altro viene mantenuto a singolo filamento. A intervalli più o meno regolari viene sintetizzato su questo filamento un innesco, quindi un frammento di Okazaki da parte della Pol III, rilasciata dal frammento precedente, ma non dall’oloenzima. Il modello è detto a trombone perché il laccio a singolo filamento, che si forma sul filamento lento, aumenta e cala di dimensioni durante la sintesi, mimando il movimento di un trombone. In associazione con l’elicasi, la primasi aumenta la propria affinità per il DNA di circa 1000 volte, sintetizzando così un primer. È la debole interazione primasi-elicasi, che permette di regolare la lunghezza dei frammenti di Okazaki.  Negli eucarioti ci sono dunque 3 diverse DNA Polimerasi che agiscono alla forcella replicativa: DNA pol alpha/primasi, pol delta pol epsilon Ognuna di queste ultime due su un diverso filamento (non ancora chiaro quale), ma le proteine che ne coordinano l’azione sono ancora poco conosciute Perchè devono essere 3 le polimerasi legate al Loader? Vediamo che l'elicasi con la primasi ha formato il primer, poi il loader è pronto appena il primer è terminato ad inserire la nuova polimerasi Nel frattempo l'altro frammento di okazaki si sta sintetizzando, non può utilizzare quindi una sola polimerasi per queste 2, gliene servono altre. Ricapitolando: Il filamento discontinuo forma un'ansa, è ripiegato, per il discontinuo ha 2 DNA pol alternate, quindi così riesce a mantenere la stessa velocità del continuo. Eucarioti Il filamento continuo viene sintetizzato dall' pol epsilon, il discontinuo delta, poi abbiamo la sliding clamp detta CNA e RF-C. Nell’ultimo anno sono andati a marcare con fluorescenza la alpha, la epsilon. È la delta e sono andati a vedere per quanto tempo rimangono agganciate ai siti per il DNA. La alpha solo un minuto, la epsilon cinque. I tempi di legame sono quindi molto diversi in base alle diverse polimerasi.  INIZIO REPLICAZIONE Bisogna considerare che la forca replicativa normalmente viaggia in entrambe le direzioni, quindi ve ne sono due di origini di replicazione. In particolare ce ne sono diverse lungo il DNA. BATTERI Vengono aperte le bolle replicative nel DNA. Le due forche di replicazione sono dette origini di replicazione. Viene detta REPLICATORE la sequenza nucleotidi a agente in cis sufficiente per dirigere l’inizio della replicazione, sono riconosciute dall’INIZIATORE, ovvero una proteina che dà inizio al processo e favorisce la denaturazione, per agganciare le elicasi riconoscendo sequenze specifiche. Ci sono tre origini di replicazione di cui parleremo, ovvero: - Escherichia Coli (oriC). - SV40 (un virus) origine di replicazione legata da il piantige - S. Cervisiae (cellula eu