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BIOLOGIA MOLECOLARE  1. STRUTTURA ACIDI NUCLEICI: DNA E RNA Di erenze: DNA è molecola intera e molto lunga, RNA sono molecole più brevi presenza uracile nell’RNA zucchero diverso DNA è molecola a dop...

BIOLOGIA MOLECOLARE  1. STRUTTURA ACIDI NUCLEICI: DNA E RNA Di erenze: DNA è molecola intera e molto lunga, RNA sono molecole più brevi presenza uracile nell’RNA zucchero diverso DNA è molecola a doppio lamento, RNA è lamento singolo DNA = doppia elica con solco minore (1,2 nm) e maggiore (2,2 nm) Principalmente le interazioni tra DNA e proteine avvengono a livello del solco maggiore e possono essere sia speci che (riconoscimento di sequenza grazie a speci ca alternanza di basi azotate) che aspeci che. La presenza del solco maggiore permette l’esposizione di più gruppi chimici e quindi una maggiore speci cità delle interazioni per la variabilità delle reazioni. Nucleotide = gruppo fosfato + zucchero pentoso + base azotata - legami covalenti tra gruppo fosfato e zucchero e tra zucchero e base - distanza tra una base e l’altra di 0.3 nm - nucleotidi 5’-trifosfati sono precursori nella sintesi degli acidi nucleici Legami H —> tra le basi azotate tengono insieme i lamenti (A-T / C-G) => energia del legame: 3-6 kcal/mol appaiamento A-T avviene attraverso 2 legami H appaiamento C-G avviene attraverso 3 legami H a) 3 legami H perché ci sono 3 donatori e 3 accettori che si trovano a distanza tale da poter formare legame (in questo caso sotto i 3 Å) b) 2 legami H perché c’è un H già legato al C2’ che non può formare legame Filamenti antiparalleli vanno in direzione 3’5’ e le estremità sono dette così perché: 3’ OH libero sul C3’ 5’ legato a fosfato che non è legato a nucleotide singoli residui legati insieme da legami 5’-3’ fosfodiesterici e lamento ha una speci ca polarità (estremità non equivalenti) per cui 3’-OH e 5’-P fosfato del nucleotide adiacente si lega a OH del C3’ con legame covalente fosfodiesterico (di- perché farà legame con nucleotide precedente e successivo) Legame fosfoesterico = OH del C5’ fuori dall’anello furanosico; si elimina molecola acqua e si forma legame con gruppo fosfato Legame ß-glicosidico = legame tra β-OH su C1’ del primo zucchero e OH del C4’ secondo Deossiribosio: zucchero pentoso C1’ e C4’ uniti a formare anello a 5 atomi di C attraverso O dell’ossidrile legato a C4’ C5’ è fuori dall’anello dello zucchero C5’ fa legame fosfoesterico con gruppo fosfato manca O su C2’ ff fi fi fi fi fi fi fi fi fi  Basi azotate: aromatiche eterocicliche planari a) Purine = 2 anelli (adenina e guanina) - N9 fa legame con zucchero b) Pirimidine = singolo anello (citosina, timina e uracile) - N1 fa legame con zucchero Le basi possono esistere forme tautomeriche diverse: a) forma chetonica o enolica per guanina e timina b) forma amminica o imminica per adenina e citosina => queste conformazioni possono portare all’introduzione di appaiamenti non canonici e quindi di errori o mutazioni Esistono enzimi che possono agire solo in una speci ca direzione del DNA, ad esempio DNA polimerasi coinvolta nella sintesi di DNA adenina-deossiribosio-trifosfato è molecola precursore della sintesi (da cui parte polimerasi) => partirà da fosfato in posizione α (il più vicino a C5’) 1) scissione adenina-deossiribosio-trifosfato e liberato pirofosfato 2) pirofosfato scisso in un gruppo fosfato semplice da pirofosfatasi 3) fosfato libero aggiunto a catena da legame 5’-3- fosfodiesterico Doppia elica DNA stabilizzata da diversi fattori: a) legami H fra le basi b) stacking (impilamento) delle basi che deriva da interazioni idrofobiche, di Van der Waals, elettrostatiche natura delle basi (idrofobiche) e loro disposizione permette che la molecola sia estremamente stabile in soluzione => ciascuna coppia di basi stabilizzata da coppia di basi precedente e successiva maggiormente negativa è l’energia di legame e più stabile sarà l’interazione => in organismi che vivono ad alte temperature c’è maggior % di presenza di legami G-C perché è più alta l’energia di legame Perché il DNA è un’elica? Si tratta di una molecola in costante interazione con le proteine perché deve costantemente rispondere a stimoli esterni, interazioni ecc… Avere un’elica implica spesa energetica maggiore perché va prima sciolta e poi separati i lamenti. Senza rotazione si sarebbe creato un buco tra le basi che avrebbe dato possibilità all’acqua di entrare e renderla una molecola estremamente instabile in soluzione. Polimor smi strutturali del DNA: possibili modi cazioni di una struttura di riferimento (DNA B) La doppia elica è dotata di essibilità strutturale per cui ci sono delle modi cazioni: a) Sugar pucker = rotazione attorno al legame fra atomi C2’ e C3’ dello zucchero che porta a spostamento del C2’ o C3’ fuori dal piano di 5 pm avviene intorno a questi speci ci C perché sono unici atomi legati ad altri C e non a O e che nello spazio possono uscire fuori dal piano (anello a 5 C non può essere planare per motivi sterici) piano C1’-O-C4’ è sso —> rotazione può avvenire solo attorno a legami fra atomi 1’-2’/2’-3’/3’-4’ endo-pucker (con gurazione più frequente) quando C2 o C3 si spostano fuori da piano nella stessa direzione del C5’ —> C2’-endo e C3’-endo sono in equilibrio tra loro => conseguenza è variazione della distanza fra fosfati di due nucleotidi adiacenti = quando si ha conformazione C3’-endo la distanza tra fosfati di nucleotidi adiacenti aumenta (da 5,9 Å a 7 Å), concentrando più o meno le cariche lungo la catena nucleotidica eso-pucker descrive spostamento nella direzione opposta fi fi fi fl fi fi fi fi fi  b) Conformazioni syn o anti = rese possibili da rotazione attorno a legame ß-N-glicosidico => legame singolo C-N ha caratteristica chimica tale da permettere queste rotazioni syn- quando anello a 6C dell’adenina si trova nella stessa direzione dello zucchero anti- quando anello a 6C dell’adenina si trova nella direzione opposta rispetto allo zucchero citosina ha solo conformazione anti (e in generale per le pirimidine) c) Polimor smi associati a coppie di basi (pair twist, pair roll, pair slide) = cambiamenti nella posizione delle basi —> coppia di basi (una base di un lamento e l’altra del lamento opposto) considerata come unico oggetto geometrico Basepair twist (T) = rotazione coppia di basi rispetto a quella adiacente lungo asse perpendicolare dell’elica; angolo di twist della rotazione può variare in base alla sequenza (25/28°-45/50°) Basepair roll (R) = rotazione lungo asse longitudinale della coppia di basi rispetto ad asse elica; angolo roll può variare da +20° a -10° Basepair slide (S) = traslazione o scivolamento della coppia di basi rispetto a quella adiacente; slide può variare da +3 Å a -2 Å Propeller-twist (basi di una coppia considerate come oggetti distinti) = rotazione (10°-20°) di una base lungo asse dell’elica —> si possono formare legami H non canonici (basi un po’ sfalsate che possono creare legami tra base di un lamento e quella del lamento opposto e precedente) Variazioni strutturali portano a doppie eliche con conformazioni diverse: DNA A, B e Z - DNA B è struttura canonica descritta da Watson e Crick - DNA A ha cambiamenti nelle dimensioni e nei parametri geometrici rispetto a B; è più possibile trovarlo quindi in condizioni di disidratazione perché DNA meno propenso a compattarsi (basi si rilassano) e deve trovare un nuovo equilibrio per le condizioni in cui si trova Parametri DNA B vs DNA A: helix pitch: 34 Å vs 28 Å; basepair tilt: 6° vs 20°; basepair twist: 36° vs 33°; diametro: 20 Å vs 26 Å - DNA Z è sinistrorso (senso rotazione opposto); sicuramente lo troviamo in soluzione perché strutturalmente la componente idrofobica tende meno a rilassarsi (idealmente più in funzione regolatoria piuttosto che conseguenza dell’ambiente circostante) => cambiamenti possono essere correlati ad aspetti diversi della stessa funzione per poter ampliare spettro di interattori che può avere DNA fi fi fi fi fi  Gilbert, 1986: ipotesi del mondo ad RNA = informazione e catalisi mediata da RNA come primo passaggio nell’evoluzione della vita cellulare perché RNA in grado di immagazzinare informazioni e di catalizzare reazioni come enzimi proteici RNA = singolo lamento più corto rispetto a DNA ha emivita più breve rispetto al DNA —> nisce vita mRNA dopo traduzione mentre DNA conserva informazione rappresenta anche materiale genetico di molti virus rRNA il più rappresentato; mRNA il più lungo Di erenze microscopiche con DNA: a) presenza uracile (pirimidina) al posto della timina; proviene da deaminazione della citosina => manca gruppo metile CH3 sul C5’ b) zucchero ribosio al posto del deossiribosio (a livello del C2’ dello zucchero c’è OH) Deaminazione = processo spontaneo che prevede eliminazione del gruppo amminico (-NH2) mediante idrolisi, ossidazione o riduzione adenina convertita in ipoxantina guanina convertita in xantina citosina convertita in uracile 5-metilcitosina convertita in timina —> uracile non è presente nel DNA perché esiste un sistema di riparazione che lo riconosce come estraneo e lo elimina riparando il danno e ripristinando subito una citosina Struttura secondaria = organizzazione in elementi di una sequenza lineare di un acido nucleico o catena amminoacidica Elementi struttura secondaria: single strand, A-form double helix, symmetric internal loop, 3/4-stem junction, single/three nucleotide bulge… Essendo un singolo lamento, RNA tende a formare speci che e complesse strutture secondarie e terziarie, a seconda che questo abbia una funzione enzimatica o di semplice ripiegamento strutturale. ripiegandosi su se stessa, assume una conformazione a doppia elica analoga a quella del DNA A (per ingombro dell’OH sul C2’) => solco maggiore meno accessibile perché più stretto e profondo (concentrazione carica negativa maggiore), mentre quello minore è più allegato e accessibile (ma meno informativo per interazioni sequenze-speci che; avvengono quelle aspeci che) appaiamenti basi non canonici (non W-C) genereranno tratti a doppio lamento e a singolo (dove non possibili appaiamenti) c’è possibilità di formazione di triplette di basi perché essendo singolo lamento, andrà a formare da solo la conformazione a minor energia libera => tutte interazioni intramolecolari che stabilizzano struttura sono possibili Appaiamenti non canonici: AU Hoogsteen; GU possono accoppiarsi con geometria diversa da W-C favorendo formazione doppie eliche intramolecolari —> legami H in posizione cis o trans rispetto a posizione ribosio ff fi fi fi fi fi fi fi fi  La probabilità che una potenziale doppia elica si formi può essere valutata in base ai valori di energia libera. La stabilità di una data struttura è descritta dal ∆G totale: maggiore sarà la negatività del ∆G, più probabile e stabile sarà la struttura. Ogni appaiamento canonico tra basi da un contributo negativa all’energia totale, mentre ogni regione di non appaiamento da un contributo positivo (non facilita il folding dell’RNA). Esistono alcuni motivi di struttura secondaria particolarmente stabili: a) Tetra-ansa UUCG => oltre ai legami H, la presenza di un’ansa (quindi mancanza di appaiamento) è compensata da energia di stacking tra le basi e la loro disposizione b) Tetra-ansa UUUU => preceduto da tratto a doppia elica molto stabile che compensa mancanza di legami H canonici Struttura terziaria = vari elementi di struttura secondaria di una molecola RNA interagiscono tra loro, ripiegandosi su se stesso per rotazione attorno a legami fosfodiesterici nei tratti non a doppia elica es.: interazioni fra 3 basi, tra basi e impalcatura (tRNA) o con proteine che neutralizzano carica fosfati (ribosomi) Elementi di struttura terziaria: pseudoknot, kissing hairpins, hairpin loop - bulge contact Pseudonodo = appaiamento fra basi complementari localizzate a distanza; 2 regioni a doppio lamento alternate da 2 loop (anse) con ripiegamento (impilamento coassiale) verso l’interno del primo loop andando a formare tratto a tripla elica => stabilizzata da presenza di cationi Mg2+ perché ci sarebbe repulsione tra scheletri zucchero- fosfato Motivo A-minore = una delle interazioni più abbondanti nelle grandi molecole RNA; adenosine a singolo lamento stabiliscono connessioni con i solchi minore di doppie eliche di DNA mediante legami H e di Van der Waals —> identi cato nel ribozima a testa di martello e negli rRNA Ribozimi = molecole RNA con particolari strutture tridimensionali in grado di interagire con speci ci substrati e di avere attività catalitiche simili a quelle di alcuni enzimi proteici => capacità enzimatica dovuta presenza OH su C2’ zucchero che è estremamente reattivo e può e ettuare un attacco nucleo lo (che può ad esempio scindere legami covalenti RNAsi P: coinvolta nella formazione dei tRNA che legano precursori e un RNA con attività catalitica hammerhead presente nei viroidi (si propagano per auto-idrolisi di un precursore più lungo); ha attività enzimatica perché in grado di scindere legame fosfodiesterico 3’-5’ (legame nucleotidi) virus epatite delta ha 2 strutture e 2 funzioni diverse: conformazione HDV permette formazione elica A; conformazione ligasi rende molecola reattiva e OH fa attacco nucleo lo su scheletro zucchero-fosfato fi fi fi fi fi fi ff  RNA transfer: struttura a trifoglio che alterna steli (doppio lamento) e anse ( lamento singolo) sito aa al 3’ (opposto all’anticodone) dovrà attaccarsi al messaggero attraverso legame peptidico struttura anticodone andrà a riconoscere tripletta del codone struttura tridimensionale Y-like dell’rRNA 5S => tutti tRNA assumono stessa struttura secondaria Proprietà chimico- siche degli acidi nucleici: - denaturazione = fornendo calore, formaldeide, ioni OH o bassa concentrazione di cationi riusciamo a scindere (denaturare) legami H tra lamenti; processo reversibile => solo con DNA; non si può usare ioni idrossido in soluzione con RNA per presenza di OH su C2’ per cui si andrebbe a rompere legame dello scheletro zucchero-fosfato (si andrebbe a “digerire” il lamento stesso) - rinaturazione = processo inverso denaturazione - ibridazione = formazione di molecole ibride per appaiamento di lamenti appartenenti a molecole originarie di erenti - assorbimento radiazioni UV (DNA ha picco a 260 nm, proteine a 280 nm) —> per la componente aromatica delle basi azotate => per legge Lambert-Beer, valore di assorbanza (A) a 260 nm (= 1) ci permette di determinare laconcentrazione di una soluzione di acidi nucleici (50 μg/ml per DNAds; 36 μg/ml per DNAss; 40 μg/ml per RNA) T melting = temperatura a cui 50% DNA si trova nello stato di singolo lamento speci ca del DNA in soluzione perché dipende dalla composizione di basi maggiore è % legami G-C all’interno del genoma e maggiore sarà T melting E etto ipercromico = aumento del coe ciente di estinzione di un acido nucleico in soluzione a seguito di degradazione o idrolisi ff fi fi ff fi fi ffi fi fi fi fi  2. TOPOLOGIA DNA TOPOLOGIA = branca della geometria che studia proprietà geometriche delle gure che non variano quando le gure stesse sono sottoposte a deformazioni continue (senza rotture o sovrapposizione di punti) e che non dipendono dalla nozione di misura Superavvolgimento = avvolgimento a elica di un’elica della molecola DNA => avviene perché regioni terminali sono bloccate (cromosomi cellule eucariotiche sono molecole lineari ma vincolati a impalcature proteiche) DNA batterico ha domini avvolti in modo indipendente. DNA organizzato in domini topologici indipendenti; molecole in vivo hanno struttura chiusa. 1963, Vinograd: DNA circolare del virus polioma esisteva in 2 forme (rilassata o superavvolta) che potevano essere separate in esprimenti di ultracentrifugazione —> forme superavvolte sedimentano più velocemente mentre rilassate sono più lente Proprietà topologiche DNA: L=T+W L = linking number; identi ca quante volte lamento si avvolge sull’altro T = twisting number; identi ca numeri di giri dell’elica W = writing number; identi ca numero di superavvolgimenti In un stato rilassato, L0 = N / 10.5 (N = n° bp) Per cambiare L bisogna rompere e aprire il lamento: L < L0 quando DNA superavvolto negativamente (W è numero negativo es. –2) aumenta n° bp/giro d’elica diminuisce angolo twist L > L0 quando DNA superavvolto positivamente (nello stesso verso di avvolgimento dell’elica) diminuisce n° bp/giro d’elica aumenta angolo twist => se diminuisco T, la molecola non sarà stabile e si andranno a introdurre dei superavvolgimenti negativi per compensare a livello energetico la mancanza di giri d’elica (stessa cosa se aumento T ma i superavvolgimenti saranno positivi) Se viene introdotto superavvolgimento senza cambiare L: cambieranno T e W andando a compensare se W = –1 (superavvolgimento negativo) —> T = 21 se W = +1 (superavvolgimento positivo) —> T = 19 Rilassamento superavvolgimenti negativi —> ci saranno regioni parzialmente denaturate che saranno utili per “conservare” energia da riutilizzare per iniziare processi su DNA (che necessitano di DNA rilassato) => denaturazione termodinamicamente favorita in DNA superavvolti negativamente soprattutto in regioni ricche di A-T (legami più facili da rompere) DNA ALL’INTERNO DELLE CELLULE È SUPERAVVOLTO NEGATIVAMENTE struttura DNA rilassato è quella che corrisponde a ∆G più negativo (1 giro negativo ogni 200 bp) introduzione superavvolgimenti richiede energia (1 giro di superelica ∆G = –9 kcal/mol) superavvolgimenti considerati come “deposito di energia” necessaria per e ettuare transizioni strutturali fi fi fi fi fi fi ff fi Tipi di superavvolgimento: a) Plectonemico = doppia elica che si avvolge su se stessa (schema principale nel DNA batterico) b) Toroidale = DNA si avvolge intorno a complesso proteico (schema principale nel DNA eucariotico) => entrambi avvengono grazie a presenza di proteine che favoriscono superavvolgimento Topoisomerasi = particolare classe di enzimi responsabile dell’introduzione dei superavvolgimenti nel DNA catalizzano taglio e formazione legami fosfodiesterici cambiano numero linking L nel DNA meccanismo: formazione legame covalente fra estremità DNA e residuo Tyr (nel sito catalitico) dell’enzima => OH nella catena latterà le responsabile dell’azione catalitica dell’enzima (Tyr farà attacco nucleo lo su scheletro zucchero-P e andrà a formare legame covalente con estremità a) Topoisomerasi tipo I: induce rottura un solo lamento (∆L = ±1); rimozione superavvolgimenti negativi => si dividono in A e B: Tyr forma legame covalente con 5’P (A) o 3’P (B) b) Topoisomerasi tipo II: induce rottura 2 lamenti (∆L = ±2); inserimento superavvolgimenti negativi fi fi fi  Meccanismi delle topoisomerasi tipo I: 1) Strand passage (topo IA) si parte da conformazione chiusa Tyr sito attivo attacca legame fosfodiesterico di uno dei lamenti DNA, lo taglia e crea legame covalente 5’-fosfotirosil-DNA rottura fa passare enzima a conformazione aperta (estremità 3’ “fermata” da enzima per evitare perdita di tutti i superavvolgimenti visto che estermità libera potrebbe essere punto di rotazione del lamento) lamento integro passa attraverso rottura dell’altro lamento enzima si trova di nuovo in conformazione chiusa 3’-OH attacca legame 5’-fosfotirosil-proteina-DNA e si salda così il lamento interrotto con => viene preservata energia legame 2) Reazione controllata (topo IA) = rottura con attacco nucleo lo della Tyr, DNA ruota attorno a punto di rotazione del lamento sano (grazie all’azione del nose cone) e si ha nuova formazione del legame fosfodiesterico con scioglimento del superavvolgimento Girasi (topo tipo II) = enzima tetramerico con 2 subunità GyrA (termine CTD) e 2 subunità GyrB (NTD) 2 Tyr catalitiche nel dominio WHD 2 siti catalitici ATP nel GyrB ADPNP analogo non idrolizzato dell’ATP usato per studiare conformazione enzima (si legano nel sito catalitico e bloccano la speci ca conformazione dell’enzima) cancello N, cancello per DNA, cancello C = porzioni proteine con speci co ruolo durante ciclo catalitico Modello “del doppio cancello”: - segmento G (gate) è quello che verrà scisso - segmento T (transfer) passerà attraverso seg G 1) legame 2 molecole ATP causa chiusura del cancello N dovuta a dimerizzazione GyrB con contemporanea “cattura” segmento T 2) idrolisi prima molecola ATP causa: enzima taglia segmento G, si aprono cancello C e quello per DNA, segmento T passa attraverso G 3) idrolizzata seconda molecola ATP: enzima lega segmento G, cancello DNA si richiude, segmento T lascia complesso attraverso cancello C (innescati cambiamenti conformazionali che riportano enzima a stato iniziale) => risultato del ciclo catalitico: 2 molecole ATP idrolizzate e introdotti 2 superavvolgimenti negativi (W = –2) Processi in cui è necessario intervento topoisomerasi: replicazione, trascrizione, associazione con istoni, terminazione replicazione di cromosomi circolari => stato topologico del DNA deve essere nemente regolato durante replicazione, separazione di 2 lamenti genera superavvolgimenti positivi (che causerebbero blocco avanzamento forca di replicazione) durante trascrizione, RNA Pol genera superavvolgimenti negativi a monte della bolla e positivi a valle della bolla trascrizione a partire da alcuni speci ci promotori richiede livello minimo di superavvolgimento negativo Topoisomerasi IV = decatena cromosomi circolari duplicati incatenati fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi  3. CROMATINA E NUCLEOSOMI L’intero genoma dell’organismo contiene tutte info necessarie per decodi care e speci care funzioni cellulari e dell’intero organismo. L’organizzazione in cromosomi è raggiunta attraverso processo di “impacchettamento” del DNA è di fondamentale importanza per protezione da possibili danni, trasmissione a cellule glie, corretta ricombinazione MA ridotta accessibilità perché estremamente condensato. TMV: virus del mosaico del tabacco guscio della testa si condensa intorno a RNA del TMV nei virus a ssRNA, capside si assembla intorno al genoma a partire da forcina e procede bidirezionalmente unità del capside: un disco a due strati ciascuno formato da 17 subunità proteiche identiche Fago lamba: virus icosaedrico a partire da precursore nella testa del fago, subisce cambiamenti conformazionali che portano a cambiamento forma del capside una volta che precursore nella testa assume forma icosaedrica, viene inserito DNA impacchettato meccanismo di produzione DNA fatico è detto rolling circle taglio del DNA da parte di una nucleasi fagica, poi viene attaccata coda E.coli: DNA batterico è nucleoide compatto (80% DNA 20% proteine+RNA) dsDNA lungo 1,5 mm con 4200 kb proteine histone-like formano impalcatura per far agganciare DNA (HUα, HUß, H-NS, FIS) cromosoma batterico: ~100 anse da 40 kb Superavvolgimenti stanno alla base della capacità del DNA di condensarsi. Durante la metafase, il DNA è nella condizioni in cui si trova più impacchettato perché sarà il momento in cui deve dividersi nelle cellule glie. Cromosoma metafasico = formato da condensazione bre cromatina collana di perle ( bra da 10 nm) —> bre cromatina meno condensate bra da 30 nm —> bre cromatina più condensate Digestione parziale con nucleasi micrococcica: Lavorando in vitro, si ha DNA estratto dalle cellule con enzima di cui si può scegliere quantità da aggiungere, a quale temperatura far avvenire reazione e durata con la digestione parziale si ha attività limitata dell’enzima taglio non avviene su tutti siti disponibili e per questo si formano frammenti da 200 bp e multipli di 200 => nella prolungata invece enzima svolge attività ottimale e avviene il taglio su tutti i siti presenti fi fi fi fi fi fi fi fi fi Risultati della digestione con nucleasi micrococcica: la cromatina è organizzata in nucleosomi NUCLEOSOMA = tetramero con 4 proteine a coppie (8 totali) e forma di cilindro appiattito; contiene 2 giri DNA Istoni del nucleosoma: H1 è nella regione internucleosomica; le altre formano core del nucleosoma composizione interna di aa (20-24% Lys+Arg) molto basica perché cariche positivamente e hanno ruolo di interagire con backbone del DNA carico negativamente (tendono ad attrarsi e riconoscersi) interazione proteine avviene principalmente a livello del solco minore (molto più negativo del minore) interazioni (principalmente elettrostatiche) aspeci che perché devono essere in grado di legare tutto DNA (non può essere sequenza-speci ca) organizzazione di struttura secondaria e terziaria conservata dominio centrale formato da regione histone-fold (2 core + α-elica centrale); coda NTD senza elementi di struttura secondaria (tranne H3) e coda CTD code istoni sporgono dal core e se trattate con proteasi è sempre possibile ottenere assemblaggio DNA attorno a istoni (code NTD hanno ruolo nella stabilizzazione e passaggio da bra 10nm a bra 30nm) Assemblaggio nucleosomi: istoni isolati e puri cati sono in grado di interagire tra loro attraverso α-eliche H2A e H2B formano dimero (successivamente altro dimero e si associano fra loro), H3 e H4 formano tetramero (si forma subito per primo) 1) primo assemblaggio tetramero H3-H4 attorno a cui si avvolge DNA (con parte mediana+ estremità) 2) successivamente si associa prima di serio di H2A-H2B 3) si formano due coppie di dimeri che andranno ad associarsi con tetramero nella parte bassa dove non interagisce con DNA 4) verrà prodotta struttura nale dell’istone da 8 proteine fi fi fi fi fi fi  Interazioni tra proteine (istoni) e solco minore DNA: ~140 contatti/nucleosoma = legami H fra residui basici (Lys+Arg) delle proteine e atomo O del legame fosfodiesterico —> istone H1 (20800 Da; 32% Lys+Arg) interagisce con DNA linker e regione mediana del DNA associata a core istonico legame stabilizza struttura ordine superiore —> bra da 30 nm si passa da bra 10nm a bra 30nm attraverso avvolgimento ad elica della bra 10nm, formando un solenoide (superelica con 6 nucleosomi per giro; avvolgimento bra 10nm) in assenza delle code NTD non si possono formare bre 30nm perché stabilizzano interazioni solenoide andando a compattare in maniera speci ca la struttura bra 30nm forma anse con 40-100 kb DNA bloccate a base da sca old nucleare (topoisomerasi tipo II + proteine SMC) Struttura cromosomi: a) centromero = struttura formata da diversi complessi proteici (cinetocore è centro del centromero) b) telomeri = estremità che tendono ad essere più soggette ad azione enzimi che degradano DNA Struttura della cromatina è dinamica! Cambiamento rapido dello stato di impacchettamento del DNA reso possibile da modi cazioni di alcuni aa della coda NTD degli istoni —> queste modi cazioni fanno sì che DNA si rilassi aggiunta gruppi P, quindi carica negativa e repulsione elettrostatica acetilazione delle catene laterali positive (maschera positività dei residui rendendo proteine meno positive) => avvengono principalmente su residui di Lys o fosforilazione su Tyr, Thr, Ser fi fi fi fi fi fi fi fi ff fi fi  4. STRUTTURA PROTEINE La struttura delle proteine è gerarchica. Le proteine funzionanti sono nella loro conformazione nativa. STRUTTURA PRIMARIA = sequenza lineare degli amminoacidi che compongono la proteina collegati fra loro in maniera covalente con legame peptidico STRUTTURA SECONDARIA = sequenza primaria si organizza in elementi di struttura secondaria (α-elica e foglietti-ß) α-elica —> elemento self consistent con atomi del backbone che stabilizzano core della struttura ß-foglietto = lamenti che in maniera planare stabiliscono rete di legami H che va a stabilizzare intero foglietto STRUTTURA TERZIARIA = organizzazione nello spazio degli elementi di struttura secondaria STRUTTURA QUATERNARIA = organizzazione nello spazio di più strutture terziarie Le proteine sono formate da 20 amminoacidi legati da legami peptidici tra gruppo carbossilico e gruppo amminico scheletro composto da N-C-C-N-C-C catena laterale non fa parte del backbone ed è variabile a seconda dell’aa => fornisce caratteristiche siche e chimiche agli aa aa esistono in forma zwitterionica = ione dipolare che può avere sia carica negativa che positiva 21° amminoacido Seleniocisteina; 22° amminoacido Pirrolisina Amminoacidi Idro lici —> stabiliscono interazioni con acqua - carichi negativamente con gruppo carbossilico (Acido Aspartico, Acido Glutammico) - carichi positivamente (basici) con gruppo amminico (Arginina, Lisina, Istidina) => stato di protonazione (dipende da pH) del pirrolo dell’anello dell’istidina fa sì che possa cambiare carica (nello stato deprotonato non ha carica) - neutri (Asparagina, Glutammina, Serina, Treonina, Tirosina) Amminoacidi Idrofobici —> non polari Alanina, Glicina, Valina, Leucina, Isoleucina, Prolina, Fenilalanina, Metionina, Triptofano, Cisteina fi fi fi LEGAME PEPTIDICO = legame rigido e planare; lega gruppo amminico di un residuo con gruppo carbossilico di quello successivo avviene per eliminazione di una molecola d’acqua geometria planare del legame fa sì che ci sia geometria perfetta per legame H fra C=O e N-H rigido = attorno ad atomi implicati nel legame non possono avvenire rotazioni (perché mima un doppio legame per la sua lunghezza) non vi è libera rotazione intorno a legame C-N; vi è libera rotazione intorno a legami ψ e ϕ => ω, ψ e ϕ sono angoli del backbone; χ sono angoli della catena laterale a causa della distribuzione degli elettroni, il legame ha speci che proprietà elettriche: è dipolare (da O del carbonile verso il protone dell’azoto); carica negativa va a perdersi a diventare positiva su N Ponti disolfuro = legame covalente che si origina per ossidazione di 2 gruppi tiolo SH appartenenti a 2 Cys es.: Epidermal Growth Factor (EGF) = 3 ponti disolfuro in 53 aa (6 sono Cys) Elementi di struttura secondaria: 1) α-elica: self consistent = unica catena polipeptidica si riesce a foldare in una struttura secondaria lunghezza di un giro d’elica è 5,4 Å; ci sono 3.6 aa per giro catene laterali si trovano sempre all’esterno (composizione ci permette di capire cosa fa elemento all’interno dell’intera proteina) legami H ogni 4 legami peptidici —> se non si può fare (manca H) viene provocata rottura presenza Prolina è punto di snodo attorno a cui si aumenta mobilità intera elica perché non c’è possibile di formare legame H 2) ß-foglietto: formato da più catene lineari; ogni lamento composto da almeno 2 strand antiparalleli (più stabile e comune; andamento di ogni lamento opposto all’altro); paralleli (orientazione parallela con regioni di collegamento molto più lunghi) twist sinistrorso di circa 25° (non è struttura completamente planare); (ψ,ϕ) = (-135°, 135°) acquaporina struttura composta totalmente da ß-foglietti = ß barrel fi fi fi  Uno dei ruoli principali delle proteine nell’organismo è la funzione enzimatica portare più vicini geometricamente gli atomi che devono reagire abbassare energia di attivazione (∆G) e vanno a stabilizzare gli stadi di transizione aiutano catene laterali altri aa a svolgere determinate azioni Proteasi = catalizzano l’idrolisi del legame peptidico a) Serina proteasi —> stato protonazione istidina fondamentale per far sì che reazione di idrolisi del legame peptidico avvenga b) Aspartil proteasi (HIV proteasi, renina) c) Cistein proteasi d) Metallo proteasi Coenzimi = molecole organiche che aiutano funzione di alcuni enzimi (Vit. B1, B6, B12, biotina, gruppo eme) Tutte le informazione sulla struttura tridimensionale delle proteine sono contenute all’interno della sequenza primaria. Il processo di ripiegamento delle proteine è guidato da interazioni elettrostatiche, legami H ed e etto idrofobico (Van der Waals). Le proteine si possono ripiegare spontaneamente nelle loro conformazione native in condizioni siologiche. La struttura tridimensionale delle proteine può essere composta solo da α-elica, solo da ß-foglietti o da strutture miste. FOLDING = processo cooperativo e gerarchico che permette ad una catena polipeptidica di ripiegassi nello spazio e assumere la sua struttura nativa da struttura ad alta energia si passa a struttura a minore energia più compatta e ordinata bassa stabilità conformazionale proteine le rende facilmente suscettibili alla denaturazione mediante alterazione dell’equilibrio fra le interazioni deboli (riscaldamento o variazione pH) DENATURAZIONE = processo inverso: perdita della struttura terziaria, passaggio da stato ordinato stabile a stato a bassa stabilità conformazionale senza interazioni tra aa e quelle di non-legame è uno stato che avviene in modo spontaneo perciò è reversibile (basta eliminare l’agente denaturante) stato nativo è unico stato ad energia libera più bassa (più stabile) a cui la proteina tornerà sempre => esperimento An nsen su RNasi = dopo essere stata denaturata e ridotta (rottura 4 ponti disolfuro), rimossi urea e agente riducente ed esposta a O che hanno permesso ritorno a forma nativa Paradosso di Levinthal: Come fa una proteina a ripiegarsi nella sua forma nativa? Dovrebbe esplorare tutte le conformazioni possibili ma non è possibile perché: 1. per ogni residuo ci sono 2 angoli di torsione = una proteina di n residui avrà 2n angoli di torsione 2. ciascun angolo di torsione ha 3 conformazioni stabili => 32n (10n) conformazioni possibili per la proteina 3. una proteina può esplorare una conformazione ogni 1013 s 4. tempo necessario perché proteina esplori tutte conformazioni disponibili t = 10n/1013 s 5. una proteina di 100 residui (molto piccola) t = 1087 s (>> età Universo) Molte proteine si impiegano nella loro conformazione nativa in meno di pochi s (percorso di ripiegamento abbastanza preciso e diretto) stabilità della struttura proteica aumenta rapidamente (energia libera diminuisce) rendendo processo sostanzialmente irreversibile alcuni elementi di struttura si formano per primi; elementi che via via si formano guidano il resto della catena polipeptidica nell’assumere forma nativa ff fi fi  Processo di folding —> proteine si ripiegano seguendo vie dirette 1. fase veloce (ms): formazione segmenti locali di struttura secondaria 2. collasso idrofobico 3. formazione globulo/i fuso/i: prevalenza struttura secondaria, poca terziaria nale nativa 4. stabilizzazione strutture secondarie e proto-domini (5 mms): strutture ancora uttuanti 5. stabilizzazione struttura terziaria nale con espulsione de nitiva di molecole acqua interne e formazione legami H Pro lo di energia libera durante il folding = “imbuto di ripiegamento” da stato ad alta energia (ed entropia) si arriva a stato a bassa energia (ed entropia) con procedere del processo aumenta numero interazioni e diminuisce numero conformazioni ammesse => proteine si sono evolute in modo da possedere vie di ripiegamento e cienti e forme native stabili PDI = disolfuro isomerasi delle proteine; si lega alle proteine non ripiegate mediante interazioni idrofobiche con residui super ciali e catalizza processo scambio ponti disolfuro => evita ponti disolfuro non corretti andando a formare un disolfuro misto fra se stessa e proteine in fase di ripiegamento è possibile che durante il folding le proteine formino ponti disolfuro non corretti PDI ossidata catalizza formazione iniziale ponti disolfuro in polipeptide (necessita poi di agenti ossidanti che la riossidino) PDI ridotta catalizza processo scambio di ponti disolfuro, avvicinando tra loro cisteine che devono formare ponti corretti LEGAME H = un tipo di interazione elettrostatica debole dipolo-dipolo tra un atomo elettronegativo (accettore) e un atomo H legato a un altro atomo elettronegativo (donatore) —> es. acqua può essere intermolecolare (tra molecole diverse) o intramolecolare (tra atomi della stessa molecola) più forte delle forze di Van der Waals ma più debole dei legami covalenti o ionici => insieme legami fa sì che una molecola sia stabilizzata da legami H INTERAZIONI VAN DER WAALS = forze intermolecolari attrattive o repulsive tra molecole forze di debole entità (1 kJ/mol) origine ricercata nell’interazione elettrostatica tra nubi elettroniche e nuclei atomi coinvolti => distanza di validità dell’interazione ca. 0,4 nm fl ffi fi fi fi fi fi Chaperoni molecolari: proteine che si legano a proteine parzialmente ripiegate impedendo associazione scorretta tra porzioni idrofobiche (misfolding o precipitazione) misfolding = cambiamento di struttura tridimensionale; errato ripiegamento proteine ≠ unfolding ATPasi —> utilizzano ATP per dare spinta energetica alla proteina che si sta foldando; enzimi che catalizzano idrolisi ATP e usano favorevole variazione di energia libera per legare e rilasciare polipeptide assistono il processo di ripiegamento delle proteine con un contributo di tipo catalitico fondamentali nel caso di proteine multidominio e multisubunità = singola catena suddivisa in parti strutturali e funzionali ben distinte —> proteine divise in dominio N-terminale e C-terminale (può essere anche solo una suddivisione strutturale) HSP (Heat Shock Protein) = la loro sintesi aumenta a t° elevate; in condizioni di alto stress ambientale necessarie maggiori quantità di chaperoni per facilitare folding proteine che tenderebbero a denaturare Dominio strutturale = porzione proteina con indipendenza dal punto di vista del ripiegamento 3D => Dominio funzionale se si associa anche funzione distinta (non è detto che dominio strutturale sia anche funzionale, ma se è funzionale sicuramente sarà anche strutturale) Chaperoni molecolari distinti in due classi: 1. Chaperoni veri e propri (Hsp70, Hsp90) funzionano in associazione con la proteina co-chaperone Hsp40 si legano a catena polipeptidica nascente che emerge dal ribosomi (legano debolmente ATP dopo averlo fosforilato, legame forte con ADP) 2. Chaperonine o chaperoni di II classe (GroEL/GroES nei procarioti, Hsp60/Hsp10 negli eucarioti) GroEL (Hsp60): 14 subunità identiche di 549 aa; struttura a 2 anelli (cis e trans) di 7 subunità che lavorano in maniera alternata (a seconda della presenza o meno della catena polipeptidica da foldare all’interno della cavità; più piccola in conformazione trans) GroES (Hsp10): 7 subunità di 97 aa; struttura a cupola c —> si lega solo quando anello di GroEL è cis Processo ripiegamento proteico mediato da GroEL/ES coinvolge più cicli: a) conformazione opposta degli anelli di GroEL; anello inferiore in conformazione cis legato a GroES e ADP b) legame ATP-proteina substrato causa cambiamento conformazionale anello superiore che passa a trans per permettere legame di GroES c) legame ATP-GroES all’anello superiore induce rilascio GroEL da anello inferiore d) idrolisi ATP permette folding del polipeptide substrato e) legame ATP e nuova proteina substrato a cavità inferiore invia segnale allosterico che causa rilascio GroES e della proteina incapsulata del citosol  Hsp90 = chaperone omodimero ATP-dipendente; formata da 2 subunità (domini NTD, MD e CTD + sito binding per ATP nel dominio NTD) sua velocità di apertura e chiusura è direttamente correlata alla sua funzionalità (passano più client attraverso domini per foldare più e cacemente) numero importante di clients di Hsp90 sono proteine coinvolte nel processo tumorigenesi e metastatizzazione —> prima classe composti inibitori Hsp90 che è stata sviluppata include principalmente analoghi dell’ATP (non funzionale perché vanno a crearsi molti o -target) Motivi strutturali/funzionali delle proteine: Il modo in cui elementi di struttura secondaria si organizzano danno origine ai motivi proteici, sia strutturali (riferito a come si organizzano nello spazio) sia di sequenza (piccole porzioni conservati tra proteine che non hanno nessun tipo di collegamento logenetico) => modo per catalogare le proteine Molte volte i motivi strutturali e funzionali coincidono, ma altre volte no (solo strutturali). Come vengono catalogate le proteine: Residui, Siti, Motivi, Domini, Famiglia, Superfamiglia Parametri su cui si basano gli allineamenti di sequenze di proteine per poterle confrontare: - identità —> identi ca quanto 2 sequenze sono identiche - similarità —> identi ca % degli aa con caratteristiche chimico- siche nelle stesse posizioni Motivo: a) speci ca sequenza aa caratteristica di una speci ca funzione biochimica b) elementi di strutture secondarie continue che hanno una funzione speci ca o de niscono una porzione di un dominio ripiegato in modo indipendente => possibilità di identi care presenza di pattern (quanto determinati aa sono conservati in speci che posizioni delle proteine) Supersecondary Structures (Motifs) = combinazione di diversi elementi di struttura secondaria che si organizzano in modo speci co simple: 3 o meno elementi di struttura secondaria large: consistono in più di 3 elementi —> possono ricadere in un dominio a) Helix-turn-helix = α-elica si in la nel solco maggiore e lega DNA, altra α-elica ha ruolo strutturale; entrambe legate da corta regione di aa (la loro distanza è esattamente quella del solco maggiore 3.4 nm) => elica NTD ha una funzione strutturale e aiuta il posizionamento del CTD dell’altra elica (riconoscimento) b) Helix-loop-helix —> Leucine zipper (2 eliche che abbracciano DNA tenute insieme da Leucine) c) EF Hands —> 4 nella calmodulina d) Zinc nger = riconosce DNA; formato da 2 lamenti ß (formano 1 foglietto; 1-10 aa) collegati ad α-elica (12-24 aa) con loop possono essere presenti diversi zinc ngers in sequenza in una sola proteina perché riescono a interagire con DNA andandolo ad abbracciare lungo suo senso rotazione tra α-elica e foglietto ß c’è atomo Zn (ruolo strutturale) con 2 istidine legate ad α-elica e 2 cisteine a foglietto ß e) Four-helix bundle —> citocromo, GH, citochine, ferritina con questa conformazione perché solo con questa possono riconoscere partner f) Greek key = ripiegamento assomiglia a ornamenti greci —> prealbumina/transtiretina g) Jelly roll = 8 lamenti ß organizzati in senso antiorario (NTD e CTD su stesso lato; lamenti 1,8 più vicini); ritrovato nelle proteine del capisce nel mosaico del tabacco h) Struttura ß-α-ß i) Rossmann fold = 5 elementi alternati α-ß-α-ß-α fi fi fi fi fi fi fi fi ffi fi fi fi fi fi fi ff fi fi fi  Interazioni proteina-acidi nucleici: interazioni non speci che —> polimerasi, DNasi, istoni (non possono scegliere dove legare DNA perché la loro funzione è su tutto il DNA) interazioni speci che —> fattori trascrizione, endonucleasi di restrizione => interazioni proteina-DNA consistono in 10-20 contatti coinvolgendo diversi aa La di erenza fra accoppiamenti (2 o 3 legami H) fa sì che ci siano preferibilmente alcuni accoppiamenti rispetto ad altri. Ci sono dei gruppi esposti nei solchi: donatore e accettore del legame H, gruppi idrofobici, atomi H legati al C che non possono fare legame H - Asparagine formano almeno 2 legami H con residui Adenina per loro composizione chimica con cui riescono ad interagire - Guanina è spesso riconosciuta dall’Arginina per la geometria dei gruppi accettori del legame H Speci cità di sequenza = quella che viene riconosciuta in maniera speci ca è la sequenza di nt a livello del solco maggiore (c’è possibilità di esporre più gruppi chimici ed è ciò che lo rende preferenziale per interazioni speci che) domini legano speci catamente DNA solco maggiore contiene info su cienti per distinguere interazioni in maniera speci ca o non speci ca con i vari partner es. CAP (Catabolite gene Activator Protein) dimero che lega DNA su solco maggiore usando foglietti ß riconoscendo tratti DNA Interazioni non speci che con il solco minore: Essendo più stretto il solco, ci sono meno gruppi esposti in modo da creare limite a pattern di interazioni che proteina potrà eseguire con speci ca sequenza —> si limita capacità proteina di interagire con DNA; utile quando serve che ciò che interagisce con DNA deve riconoscerlo tutto (DNA Pol) solco minore ancora più stretto in presenza di A-T nel punto in cui è più stretto ci sarà un Arginina Struttura quaternaria delle proteine: = organizzazione di strutture terziarie nello spazio; si ha più di una catena polipeptidica organizzazione delle subunità nello spazio porta a formazione di una stabilità estremamente stabile le subunità possono essere identiche o di erenti Le forze principali sono quelle idrofobiche e quelle ioniche tra le catene di aa. Le super ci di interazioni possono variare fra 600 e 5000 Å2 => più ampia è la super cie, maggiori saranno le interazioni e la somma mi darà valore di ∆G basso (quindi più stabile sarà tutto il complesso) ff fi fi fi fi fi fi fi fi ffi fi ff fi fi fi  Le subunità possono assemblarsi a seconda della diversa geometria basata sugli assi di rotazione. Simmetria ciclica = singolo asse di rotazione (C1 con monomero; C2 con dimero…) Simmetria diedrica = 2 assi attorno a cui si organizzano proteine (D2, D3 con 3 proteine…) Simmetria cubica = assemblaggio lungo 3 assi Simmetria elicoidale = insieme delle diverse proteine forma struttura elicoidale Mioglobina: - formata da 8 α-eliche; si limita alla struttura terziaria - regioni stabilizzate da legami H - singola catena da 153 aa che contengono gruppo prostetico eme (anello tetrapirrolico) - funzione di immagazzinare O2 principalmente nel tessuto muscolare - una molecola di mioglobina può legare una sola molecola di O2 con legame cooperativo Emoglobina: - esempio di struttura quaternaria (α2ß2) —> esiste solo come tetramero - ogni subunità ha gruppo eme - interazioni principali sono elettrostatiche, idrofobiche e legami H - funzione di legare O2 (4 molecole) nei polmoni e lo porta nelle cellule; trasporta CO2 e H+ dai tessuti ai polmoni - e etti negativi con cianuro e CO - 2,3-BPG aiuta emoglobina a legare O2 Immunoglobuline (anticorpi): anticorpi prodotti in risposta a molecola estranea - molecole a forma di Y con i siti di legame sulle parti terminali della Y - anticorpi composti da 4 catene identiche fra loro a 2 a 2 (2 Heavy e 2 Light); ogni catena L si lega alla H mediante un ponte disolfuro mentre le catene H si legano fra loro - le anse di polipeptidi alla ne del sito di legame sono responsabili del riconoscimento dell’antigene - speci cità: cambiamenti nella sequenza delle anse permettono all’anticorpo di riconoscere antigene Proteine brose: hanno ripetizione di speci ci elementi di struttura secondaria; ruolo di protezione, connessione o supporto negli organismi (strutturale) => sequenze di aa ripetute; capacità di resistere a t°, pH e stress meccanico; insolubili in acqua Collagene = principale proteina strutturale del nostro organismo (~1/4 del totale) struttura speci ca; ruolo di sostegno degli organi interni più grandi in grado di resistere a stress meccanici; componente di tanti tessuti (ossa, denti, cartilagini, tendini…) ci sono 28 tipi di collagene (tipo 1 più comune) composti da almeno 46 distinte catene unità funzionale composta da 3 catene avvolte a formare una tripla elica stabilizzata da connessioni incrociate tra aa (quelli ripetuti sono Gly, Pro, Hyp) ogni strand è de nito come catena di poliprolina di tipo II (PPII) ff fi fi fi fi fi fi  Cheratina = divisa in α e ß-cheratina; % residui Cys determina α-hard o α-soft (per presenza ponti disolfuro) principale elemento costituente strato corneo dell’ epidermide (parte a contatto con esterno); ruolo protezione α-cheratina formata da catena polipeptidica con Ala, Leu, Arg, Cys e formano α-elica; 2 catene polipeptidiche si avvolgono in senso sinistrorso e formano struttura dimerica più strutture dimeriche che si associano a livello di NTD e CTD formano proto lamento; 2 proto lamenti formano proto brille (unità funzionale) Mutazioni: - Mutazione silente: cambiamento singolo nt che non provoca cambiamento nella sequenza aa perché ci sono più triplette che codi cano per stesso aa - Mutazione missenso: cambiamento base provoca cambiamento aa ma non cambia struttura proteina - Mutazione nonsenso: cambiamento base provoca inserimento codone stop - Mutazione run-on: cambiato codone stop in aa - Frameshift: inserzione di un singolo nucleotide; cambiata completamente proteina che viene sintetizzata - Open-reading frame: eliminato singolo nucleotide Interazioni proteina-proteina nelle cellule: trasporto elettroni, trasduzione segnale, trasporto in membrana, metabolismo cellulare, contrazione muscolare Ruolo delle interazioni proteina-proteina: possono alterare la cinetica degli enzimi, possono regolare interazioni fra proteina e substrato, possono formare nuovi siti legame per speci che molecole, possono cambiare la speci cità di una proteina per il suo substrato, possono avere ruolo regolatorio Interazioni transienti = controllano la maggior parte dei processi cellulari possono essere forti o deboli (legato a quante e quali interazioni si stabiliscono), lente o veloci (fattore legato alla concentrazione) richiedono condizioni che promuovono interazione come fosforilazione, cambiamenti conformazionali o localizzazione Kb (costante di dissociazione) è parametro per stabilire se interazione è forte o debole; inversamente proporzionale alla forza dell’interazione Interazioni proteina-ligando: IC50 = concentrazione alla quale una determinata molecola inibisce il 50% dei recettori delle molecole a cui si deve legare; target può essere enzima, cellula, recettore… Ligando = una piccola molecola organica che lega speci ca proteina o macromolecola Substrato = ligando endogeno di un determinato enzima Inibitore = ligando che inibisce interazione del substrato endogeno Recettore = proteina di membrana (o proteina solubile) che induce e etto dopo aver legato antagonista Agonista = ligando che provoca e etto intrinseco che causa risposta del recettore (emula e etto molecola endogena) —> tendenzialmente agonisti prodotti in vitro hanno a nità maggiore dell’endogeno stesso Antagonista = ligando che inibisce legame dell’agonista direttamente o indirettamente fi fi fi fi ff fi fi ffi ff fi ff  Modello lock and key: perfetta complementarità geometrica e chimico- sica fra substrato (chiave) ed enzima (lucchetto) che interagendo formano un complesso => non viene presa in considerazione la essibilità delle molecole Altri modelli: conformational isomerism: recettore (enzima) si trova non in equilibrio ma esiste in 2 diverse conformazioni con equilibrio spostato verso una delle due; ligando ha a nità solo per una delle 2 e la seleziona per interagire induced t: recettore e ligando hanno propria conformazione; nel momento in cui interagiscono, entrambi modi cano la loro struttura per poter interagire (indotto dal ligando) conformational selection: recettore esiste in diverse conformazioni ma solo una è quella per la quale il ligando ha la maggiore a nità —> sarà ligando a selezionare conformazione recettore per legame Costante di binding (associazione) è direttamente correlata ad energia libera di Gibbs attraverso: G0 = RTlnKa = RTln(1/Kd) Ki = 10-9 corrisponde a una di G0 = 53.4 kJ/mol a t° ambiente => cambio di Ki si ri ette in una variazione di G0 = 5.4 kJ/mol ∆G = –RTlnK = ∆H – T∆S L’acqua gioca ruolo importante perché di solito le proteine sono solvatate (binding cavities): ligando interagisce con proteina attraverso molecole d’acqua a ponte devo spendere energia per far uscire molecole d’acqua dalle tasche e poi far entrare ligando che interagisce con ligando; acqua rientra per solvatare tutto complesso proteina-ligando => contributo entropico dell’acqua/solvente —> ha costo energetico (acqua è organizzata intorno alla proteina e questa organizzazione va persa per far uscire acqua, entrare ligando per interazione e acqua si dovrà riorganizzare introno al complesso) fi fi fl fl ffi fi ffi  5. REPLICAZIONE DEL DNA La replicazione del DNA è semiconservativa: dei due lamenti originali, ciascuno dei due va in una cellula da glia a fare da lamento stampo per la formazione di una nuova doppia elica. DNA POLIMERASI = enzima responsabile della sintesi del DNA sintetizza DNA in maniera DNA-dipendente e solo in direzione 5’-3’ catalizza formazione del legame fosfodiesterico fra un’estremità 3’ OH di un nucleotide e il fosfato in posizione α di un altro nucleotide non è in grado di iniziare la sintesi di un lamento ma ha bisogno di un innesco (3’ OH) Per catalizzare reazione ha bisogno di 2 substrati: 1) un nucleotide (qualsiasi dei 4) 2) un lamento 5’-3’ in parte dsDNA (da questo riconosce 3’ OH e fa partire processo) e in parte ssDNA => è una reazione di sostituzione nucleo la di tipo SN2 1) innesco stampo 2) polimerasi riconosce innesco 3) lega secondo substrato (nucleotide) 4) catalizza formazione legame tra OH e fosfato α 5) viene rilasciato pirofosfato 6) scisso in 2 fosfati da pirofosfatasi Processività = DNA Polimerasi in grado di legarsi al suo substrato e sintetizzare lamento rimanendo associata allo stesso lamento di DNA DNA polimerasi usa stesso sito attivo per legare i 4 dNTP a) appaiamento corretto garantito dalla presenza della base complementare nel sito attivo b) appaiamento non corretto riduce velocità di reazione, si dissocia il nucleotide sbagliato così enzima fa una selezione cinetica e favorisce appaiamento giusto => velocità di incorporazione del nucleotide corretto è 10.000 volte maggiore => non usa rNTP; esistono aa discriminatori che formano interazioni di Van der Waals con anello dello zucchero (con ribonucleotidi ci sarebbe OH e non farebbe legame) fi fi fi fi fi fi fi fi Cambiamenti strutturali nella DNA Polimerasi: Regione che forma α elica O che si abbassa solamente quando entra dNTP corretto per appaiamento e provoca formazione di nuove interazioni Tyr forma interazioni di stacking con una base Arg e Lys cariche positivamente vanno a interagire con fosfato carico negativamente —> se dNTP non è corretto, non si formeranno interazioni Fedeltà della replicazione = attività esonucleasica 3’-5’ di tutte le DNA Polimerasi detta correzione di bozze; in grado di tornare indietro per tagliare e rimuovere errore Le diverse subunità della DNA Polimerasi III di E.coli hanno funzioni diverse determinate attraverso isolamento di mutanti e caratterizzazione in vitro Oloenzima = complesso formato da subunità associate tra loro durante la replicazione DNA Primasi = RNA Polimerasi specializzata Primer = molecola RNA di ca. 11 nucleotidi ; sintetizzato uno su lamento leading e uno per ogni frammento di Okazaki sul lamento lagging —> OH riconosciuto da DNA Polimerasi e allungato in 5’-3’ DNA Elicasi = enzima in grado di aprire la doppia elica 6 subunità identiche che legano e idrolizzano ATP energia derivante da idrolisi fa spostare molecola lungo lamento DNA che passa attraverso buco centrale con polarità speci ca (principalmente 5’-3’) SSB: single strand DNA binding protein = proteine che legano (legame cooperativo) DNA a singolo lamento in forma di tetramero; lo avvolgono cercando di mantenerlo a singolo lamento (altrimenti le basi andrebbero a creare interazioni fra loro) Replisoma = insieme di tutte le proteine che sono in grado di garantire sintesi DNA corrispondenza della forca sono presenti 3 copie del core della DNA Polimerasi (e 3 subunità τ) interazioni fra diverse proteine stimolano progressione della forca replicativa DNA elicasi e subunità τ interagiscono tra loro => aumenta sia velocità sintesi DNA che velocità elicasi (separazione lamenti) interazione elicasi-primasi fondamentale per sintesi primer; interazione pinza ß con caricatore solo quando complesso è legato ad ATP, poi si stacca per idrolisi ATP e si associa a core DNA Polimerasi Nelle cellule eucariotiche, primer sintetizzato da DNA Polimerasi α/primasi formata da 2 subunità (una con attività RNA-polimerasica e l’altra con attività DNA-polimerasica) dopo sintesi breve tratto viene sostituita da DNA Polimerasi δ (sintetizza lamento discontinuo) e DNA Polimerasi ε (sintetizza lamento continuo) enzima responsabile rimozione primer è RNAsi H (in grado di riconoscere doppio lamento ibrido e su esso taglia RNA) —> non riesce a tagliare ultimo nucleotide (legame RNA-DNA) per cui deve intervenire 5’-esonucleasi Fen1 che taglia quel nucleotide DNA Polimerasi può intervenire e usare come innesco estremità del frammento Okazaki precedente, poi verrà completato da DNA Ligasi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi  Nelle cellule procariotiche, il primer viene rimosso da enzima DNA Polimerasi I (organizzata in 3 domini ognuno dei quali ha funzione enzimatica diversa) dominio Pol ha centro catalitico polimerasico (in grado di sintetizzare DNA); dominio con attività esonucleasica 3’-5’ (correzione bozze); dominio con attività esonucleasica 5’-3’ (catalizza rottura legame fosfodiesterico riconosciuto Nick (punto in cui manca legame fosfodiesterico), rimosso primer con dominio Exo 5’-3’, contemporaneamente riconosce estremità 3’ e allunga lamento DNA Ligasi = enzima che, usando ATP, catalizza legame frammenti Okazaki adiacenti dopo sostituzione primer 1) legame AMP a residuo Lys dell’enzima 2) trasferimento dell’AMP al 5’ P che funge da donatore 3) si forma legame fosfodiesterico fra 5’ P e 3’ OH Replicazione nei procarioti: L’inizio della replicazione avviene in corrispondenza di siti speci ci: procarioti hanno cromosoma circolare, negli eucarioti il cromosoma è lineare (+ quantità DNA di erenti) nei procarioti la duplicazione inizia sempre nello stesso punto Origini di replicazione = punito esatto in cui viene incorporato primo nucleotide del nuovo lamento siti di legame dell’iniziatore = siti in cui proteina andrà a riconoscere sequenze e promuoverà inizio replicazione siti che facilitano apertura della doppia elica; presentano maggiore quantità di basi A-T appaiate => composizione basi rende DNA più facilmente denaturabile —> se regione ricca di A e T sarà più facile aprirla per iniziare processo replicativo Modello del Replicone: evento che da inizio alla duplicazione è risultato dell’interazione tra un replicatore e un iniziatore - Replicatore = insieme di sequenze cis-agenti su cienti per dirigere inizio della replicazione - Iniziatore = elemento trans-agente (proteina) in grado di riconoscere replicatore e innescare inizio replicazione; identi cato nella proteina DnaA che si lega in maniera sequenza-speci ca alle sequenze di 9 bp (legame cooperativo DnaA-ATP provoca cambiamento conformazione e apertura sequenze di 13 bp ricche di A-T) Organizzazione oriC (origine replicazione E.coli): Utilizzando le tecniche del DNA ricombinante è stato possibile identi care oriC in regione DNA di 245 bolo: 5 copie di una sequenza di 9 nucleotidi = regioni DNA riconosciute da iniziatore (proteina DnaA) 3 sequenze di 13 nucleotidi ricche in A-T (L, M, R) 13 coppie della sequenza GATC bersaglio dell’enzima DAM metilasi (DNA-metiltransferasi) Dopo l’apertura del doppio lamento la DNA Elicasi (DnaB; perché da sola non è in grado) si lega grazie al caricatore dell’elicasi (DnaC) la cui attività è ATP-dipendente DnaB cambia conformazione a seguito dell’idrolisi ATP da parte del caricatore DnaC elicasi caricata singolarmente su 2 SSB si associa anche primasi e inizia sintesi dei primer su lamenti leading => poi DNA Polimerasi sintetizza fi fi fi ffi fi fi fi fi fi ff  L’inizio della replicazione deve avvenire solo una volta per ciclo cellulare. Il livello di DnaA nella cellula è costante ed è di circa 1000-2000 copie per cellula - prima dell’inizio della replicazione, DnaA attiva e legata ad ATP - dopo l’inizio della replicazione, viene idrolizzato ATP e DnaA è legata ad ADP => forma inattiva non riesce a legare DNA Meccanismi che regolano frequenza eventi di inizio e contribuiscono a periodo di eclissi durante cui nuovi eventi di inizio sono inibiti 1) RIDA = complesso formato da subunutà ß della Polimerasi+ADP-Hda+DNA che interagisce con ATP- DnaA stimolando idrolisi ATP e portando a formazione ADP-DnaA 2) DDAH —> presenti numerosi sequenze di legame per DnaA in altri punti cromosoma non distanti da oriC, legano proteina con a nità ridotta (quantità raddoppia dopo inizio duplicazione) => c’è numero elevato di sequenze DNA che possono legare DnaA, innescando idrolisi ATP e inattivazione => scopo nale è ridurre quantità di ATP e DnA attiva all’interno della cellula 3) Sequenze GATC che sequestrano oricC emimetilato attraverso legame con SeqA (proteina membrana) alcuni nucleotidi nel DNA possono essere modi cati post-sinteticamente (dopo essere state incorporate nel DNA) —> nei procarioti ci sono metiladenina e 5-metilcitosina (basi metilate ad opera di Dam metilasi) quando oriC è emimetilato non viene più riconosciuto da DnaA (inattivo) e non può più essere usato come origine di replicazione Sito di terminazione: contiene serie di sequenze Ter a cui si lega proteina Tus che si dispone in maniera asimmetrica sulle sequenze per bloccare avanzamento elicasi I cromosomi replicati dovranno poi essere separati dall’intervento di una topoisomerasi di tipo II. Replicazione negli eucarioti: Sui cromosomi lineari sono presenti multiple origini di replicazione perché il cromosoma è più lungo ca. 350 nei lieviti e 20.000 nell’uomo la forca di replicazione viaggia a velocità inferiore perché struttura cromatina è più complessa origini replicazione attivate spesso in gruppi di 20-80 origini => unità di replicazione Struttura ARS (Autonomously Replicating Sequence) di un lievito = sequenza ACS formata da 11 bp; essenziale per funzionamento origine presente regione DUE ricca in A-T e più facilmente denaturabile legame con proteine iniziatrici porta ad apertura DUE e a successivo assemblaggio del replisoma Sequenza “consenso” = sequenza ideale in cui per ogni posizione c’è base maggiormente rappresentata in quella posizione della sequenza L’inizio della replicazione del DNA negli eucarioti prevede due passaggi fondamentali: a) selezione del replicatore da parte dell’iniziatore ORC (fase G1) ORC (Origin Recognition Complex) lega ATP ed è legato alle ARS durante tutto ciclo (analogo DnaA) legame elicasi (Mcm 2-7) su origine replicazione —> elicasi caricata da caricatori (Cdc6 e Cdt1) => si forma complesso pre replicativo che conferisce competenza alla replicazione agli origini b) attivazione dell’origine (fase S) => una volta attivata elicasi comincia a muoversi e innesca serie di eventi della replicazione fi ffi fi  Il transito da una fase all’altra del ciclo cellulare è controllato da una serie di complessi proteina-chinasi eterodimeriche costituite da: - una subunità regolatrice (ciclina) - una subunità catalitica (chinasi ciclina-dipendente CDK) => CDKp34 indica la subunità catalitica di una CDK associata alla sua subunità regolativa (ciclina) TELOMERI = estremità dei cromosomi lineari formati da sequenze ripetuti te ricche di G che, a causa del meccanismo di duplicazione, si accorciano causando intervento Telomerasi => RNA si lega a regione a singolo lamento e dà sequenza complementare a quella sul telomero Telomerasi: enzima responsabile del mantenimento dei telomeri Formata da: a) TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) => componente proteica con attività di transcrittasi inversa b) TERC (Telomerase RNA Component); ha due funzioni importanti appaiamento complementare con sequenze del telomero stampo per attività RT di TERT —> allungherà estremità 3’ telomero no a quando tratto allungato non sarà su cientemente lungo da poter permetter sintesi nuovo primer e frammento di Okazaki Duplicazione DNA mitocondriale (circolare): esistono 2 origini di replicazione su due lamenti H e L lamenti duplicati indipendentemente uno dall’altro (non si forma complesso replisoma) viene riconosciuta origine in un punto su lamento H e inizia separazione copiato per primo lamento L con DNA Polimerasi singola ci sarà seconda DNA Polimerasi quando durante sintesi di un lamento si arriva all’altra origine di replicazione Meccanismi di “priming” alternativi: 1. 3’-OH di innesco dormito da RNA sintetizzato dalla primasi 2. DNA a doppio lamento tagliato per fornire estermità 3’-OH a DNA Polimerasi 3. 3’-OH di innesco fornito da proteina che si lega covalentemente a DNA (adenovirus) fi ffi fi fi fi fi fi fi fi  6. TECNICHE DEL DNA RICOMBINANTE Sono tecniche ed enzimi/proteine che permettono di isolare, manipolare, sequenziare, caratterizzare e modi care gli acidi nucleici. Diversi metodi di estrazione e puri cazione in base a: materiale di partenza, tipo di acido nucleico, applicazione post-estrazione, qualità acido nucleico estratto Tutte le metodiche per l’estrazione di acidi nucleici usano 4 fasi: 1. Lisi cellulare: rottura parete e/o membrana spesso combinata con inattivazione nucleasi cellulari 2. Separazione acidi nucleici tra loro (degradato ciò che non ci interessa) DNasi (degradano DNA) per puri care RNA: richiedono ioni metallici per loro attività (cofattori), termolabili, facilmente inattivate da agenti chelanti e da sterilizzazione in autoclave RNasi (degradano RNA) per puri care DNA: nono hanno bisogno di cofattori, attive in ampio range pH, resistono a ebollizione prolungata e sterilizzazione in autoclave 3. Eliminazione proteine —> si possono usare enzimi o solventi organici proteasi vanno a scindere legame peptidico fenolo (solvente organico) forma 2 fasi con acqua cosicché DNA rimanga solubile in soluzione acquosa (proteina si denatura esponendo residui idrofobici e andando nella fase organica) 4. Concentrazione acido nucleico puri cato (precipitazione) —> si sfruttano cationi o alcoli => necessario ridurre volume soluzione acquosa per utilizzare meglio DNA e etto cationi monovalenti (es. Na+) è quello di neutralizzare cariche negative del PO3- rendendo molecola meno idro lica e meno solubile in acqua interazione elettrostatica fra ioni e fosfati è inversamente proporzionale a costante dielettrica del solvente (solubilità diminuirà in soluzione perché attrazione tra ioni e fosfati è maggiore) dopo la centrifugazione, eliminato sopranatante e acido nucleico può essere risospeso in piccolo volume di solvente adatto a successive manipolazioni (solitamente acqua) => una delle tecniche più usato per puri care molecole DNA è cromatogra a su gel di silice Cromatogra a = tecnica separazione dei diversi componenti di una miscela basata su distribuzione tra due fasi: una stazionaria e una mobile che si muove lungo direzione de nita separazione avviene in base a diversa velocità con cui componenti migrano nella fase stazionaria sotto in uenza fase mobile principali sistemi sono su colonna o su carta tipi di cromatogra a si di eriscono in base a caratteristiche delle componenti da separare: su gel ltrazione o esclusione molecolare (dimensioni); a scambio ionico (carica); di a nità (basata su interazioni speci che del tipo antigene-anticorpo, enzima-substrato, recettore-ligando) => cromatogra a su gel di silice si basa su a nità e carica DNA puri cato si può analizzare determinandone la concentrazione mediante analisi spettrofotometrica o visualizzarlo mediante elettroforesi su gel di agarosio (setaccio molecolare sotto azione campo elettrico). Frammenti DNA ottenuti da digestione con ER possono essere separati mediante elettroforesi su gel agarosio. Fondamentali per tecnologie del DNA ricombinante sono serie di enzimi per tagliare, sintetizzare, legare e modi care molecole DNA: DNasi (eso/endonucleasi) => endonucleasi di restrizione riconoscono speci che sequenze DNA e e tagliano fi ff fl fi fi fi fi fi fi fi fi ff fi fi fi fi fi ffi fi fi fi ffi Sistema di restrizione (taglio) e modi cazione (metilazione): esistono coppie di enzimi di cui un membro è metilasi e altro è una nucleasi => in grado di riconoscere stessa sequenza DNA Endonucleasi di restrizione di tipo II: 500 enzimi isolati da più di 200 ceppi batterici - codice di 3 lettere per riconoscere origine enzima - 4a lettera corrisponde a sierotipo diverso dello stesso organismo - numeri romani per distinguere enzimi di sistemi di restrizione/modi cazione diversi isolati da stesso batterio Sequenze di riconoscimento: possono essere di diversa lunghezza (4, 6 o 8 nucleotidi) sequenza palindromica (si legge in entrambe direzioni) isoschizomeri = enzimi isolati da batteri diversi che però riconoscono stessa sequenza Siti di taglio = si produce scissione idrolitica di entrambi lamenti DNA secondo schemi caratteristici che producono è diverso il punto di taglio e quindi l’estremità che si crea estremità sporgenti prodotte da ER possono protrudere al 5’ o al 3’ ER possono tagliare DNA generando estremità piatte (blunt) o sporgenti (sticky; possono legare insieme lamenti con origini diversi) => riconoscimento sequenza speci ca innesca cambiamenti conformazionali sia dell’enzima che del DNA che portano ad attivazione del centro catalitico Enzimi che modi cano estremità frammenti DNA: a) Deossinucleotidil trasferasi terminale: catalizza formazione e legame peptidico senza bisogno dello stampo; lega nucleotidi uno all’altro indipendentemente dallo stampo b) Fosfatasi alcalina/Polinucleotide chinasi: possono rimuovere o aggiungere gruppi fosfato da molecole DNA fi fi fi fi fi fi  Ingegneria genetica: Un insieme di tecniche che permette di costruire molecole DNA ricombinante, dirigere la loro replicazione in un organismo ospite e ottenerne moltissime copie DNA RICOMBINANTE = molecole DNA in laboratorio da combinazione materiale genetico di origini diverse CLONAGGIO DNA = divisione delle cellule ospiti produce popolazione di cellule identiche (clone) tutte contenenti la stessa molecola DNA Schema esperimento di clonaggio: vettore (plasmide), DNA da clonare (inserto), ER, ligasi, cellule ospiti 1) DNA da clonare ottenuto da organismo di interesse e trattato con ER per generare frammenti 2) frammenti legati con molecole plasmide 3) risultante molecola DNA ricombinante inserita in organismo ospite Vettori: molecole DNA che vengono usate come trasportatori di frammenti DNA esogeno e che possono essere introdotte all’interno di cellule ospiti Caratteristiche essenziali: - replicazione autonoma rispetto a cromosoma ospite - presenza siti restrizione unici e marcatori selezionabili (geni che esprimendosi conferiscono a cellule ospiti caratteristiche fenotipi che che le rendono selezionabili) - facilità di isolamento da cellule ospiti - numero di copie/cellula variabile —> a seconda delle esigenze si sceglie vettore ad alto/basso n° copie Plasmidi = molecole DNA circolari a doppio lamento presenti nei batteri (extracromosomali e con origine replicazione autonoma rispetto a cromosoma) => plasmidi naturali modi cati in laboratorio per avere siti restrizione unici (es. enzima che taglia solamente una volta per poter inserire frammento DNA di interesse) Costruzione del DNA ricombinante: 1) vettore e DNA da clonare tagliati con stessi enzimi di restrizione —> per avere stesse terminazioni 2) per ottenere DNA da clonare: a) DNA genomico trattato con enzimi di restrizione per generare frammenti, estratti poi con da gel agarosio => tecnica ormai poco utilizzata b) regioni speci che sono ampli cate con PCR (= si ottengono moltissime copie sequenza DNA) PCR = reazione ciclica in cui numero copie di una certa sequenza raddoppia a ogni ciclo (2n copie) Per la reazione sono necessari: DNA stampo, 2 primer, dNTPs, bu er, DNA polimerasi termostabile (Taq) reazione distinta in 3 fasi a t° diverse (denaturazione stampo, appaiamento primer, estensione primer) primer sono oligonucleotidi (~20 nt) di ssDNA complementari alle estremità della regione da ampli care; speci ci solo per quella sequenza; scarsa propensione ad appaiarsi tra loro; valori Tm vicini 1) Denaturazione: aumentando la t° (90-95°) per qualche minuto, entrambi i lamenti si separeranno 2) Appaiamento primer (annealing): abbasso t° (non ssa per scelta dei primer, 5-10° sotto Tm primer) per favorire appaiamento tra primer e sequenza complementare => primer devono essere in eccesso perché rimarranno no alla ne di tutti i 25-30 cicli 3) Estensione da parte della Taq Polimerasi: si alza di nuovo t° (68-72°) per far partire sintesi polimerasi Per veri care che la reazione si avvenuta con successo: elettroforesi su gel di agarosio (lunghezza bp) fi fi fi fi fi fi fi fi fi ff fi fi  Ampli cazione di regioni speci che DNA per clonaggio: primer per ampli care quella regione —> complementari a estremità della regione e con una coda al 5’ in cui inserisco sequenza x sito di restrizione polimerasi copierà anche quel sito durante PCR —> otterrò doppio lamento con alle estremità i siti di restrizione ligasi catalizza legame delle estremità del vettore tagliato e dell’inserto tagliato (che saranno uguali e si appaiano molto facilmente) Trasformazione: inserimento DNA ricombinante in cellule ospiti “competenti” per farlo replicare a) metodo chimico: trattamento delle cellule con soluzioni contenenti cationi bivalenti (CaCl2) seguito da breve shock termico aumenta permeabilità per DNA delle cellule batteriche b) metodo sico (elettroporazione): esponendo a campo elettrico, aumenta potenziale di membrana della cellula inducendo permeabilità a molecole cariche come DNA Selezione dei “trasformanti”: costruzione del plasmide ricombinante non avviene con e cienza del 100% prima selezione con marcatore soluzione —> gene conferisce resistenza ad antibiotico => in un terreno di coltura contenente antibiotico, solo cellule che contengono plasmide sopravvivono seconda selezione permetterà identi cazione delle cellule che contengono inserto scelto a. mediante inattivazione inserzionale: si interrompe sequenza gene che conferisce resistenza con inserzione del frammento nel sito in questione (rimangono solo cellule con vettore non ricombinante) b. mediante α-complementazione: ß-galattosidasi costituita da 2 domini che anche separati possono associarsi e dare origine ad enzima attivo; inserimento DNA da clonare nel sito mcs; trasformazione cellule con gene codi cante per regione C-terminale della ß-galattosidasi e si otterranno colonie bianche positive e blu con ß-galattosidasi attiva => ß-galattosidasi riconosce anche altre molecole analoghe a lattosio come substrato (X-gal), lo scinde e questa si dimerizza spontaneamente diventando blu => inserto ha interrotto sequenza gene lac impedendo produzione enzima Vettori fagici: a) Fago λ per clonare frammenti DNA > 10 kb => presenza siti cos, DNA con 48.490 bp ma dimensioni necessarie per impacchettamento 38-52 kb, presenza regione b2 non essenziale, possibilità rimozione geni ciclo lisogenico (fago solo con ciclo litico) => durante impacchettamento tagliati i siti cos e ogni fago conterrà frammento DNA ciclo litico —> si replica e causa lisi cellula per cui viene rilasciato ciclo lisogenico —> si integra nel cromosoma ospite e rimane no a che non viene indotta escissione DNA λ: duplicazione a cerchio rotante, taglio di siti cos (12 basi complementari) per produzione monomeri, formazione multimeri b) Fago M13 per ottenere DNA ricombinante a singolo lamento fi fi fi fi fi fi fi fi fi ffi  7. GENI E GENOMI Le dimensioni del genoma e il numero dei geni mostrano ampie variazioni nei diversi organismi. In linea generale sia le dimensioni del genoma che il numero di geni sono correlati alla complessità dell’organismo. Densità genica = n° geni/Mb —> inversamente correlata a complessità organismo perché negli organismi più complessi le sequenze intergeniche sono più lunghe e i geni sono più lunghi GENE = regione DNA che controlla determinata caratteristica ereditaria speci cando la produzione di un prodotto funzionale (proteina o molecola RNA) costituito da regioni codi canti e regolatrici possono variare in lunghezza da meno di 100 nt a più di 2.4 milioni nt sequenza codi cante rappresenta ~ 5% gene I geni sono organizzati sui cromosomi in una serie lineare più o meno ttamente addensati a seconda della dimensione del DNA intergenico spaziatore. Le di erenze nelle dimensioni del genoma di organismi diversi dipendono da: 1) lunghezza delle regioni intergeniche => ruolo critico nella regolazione dell’espressione genica 2) presenza introni => organismo con numero modesto di geni può ugualmente produrre grande numero di prodotti funzionali diversi perché da ogni singolo gene si possono originare diversi prodotti ff fi fi fi fi  8. TRASCRIZIONE PROCARIOTI TRASCRIZIONE = trasferimento dell’informazione da DNA a RNA; sintesi lamento RNA su stampo DNA processo altamente regolato vengono prodotti tutti i tipi di RNA: mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, altri RNA non codi canti Filamento stampo: DNA copiato Filamento codi cante: sequenza complementare a stampo equivalente a RNA trascritto DNA si apre si fo