Travaux pratiques de microbiologie médicale - PDF

# Travaux pratiques de microbiologie médicale ## Université Sidi Mohamed Ben Abdellah - Faculté des Sciences et Techniques-Fès - Département de biologie ## Filière: Sciences biologiques appliquées à la santé ## Pr. Bekhti Khadija # Recherche des microorganismes pathogènes dans un prélèvement uri...

# Travaux pratiques de microbiologie médicale ## Université Sidi Mohamed Ben Abdellah - Faculté des Sciences et Techniques-Fès - Département de biologie ## Filière: Sciences biologiques appliquées à la santé ## Pr. Bekhti Khadija # Recherche des microorganismes pathogènes dans un prélèvement urinaire ## Méthode: Examen cytobactériologique des urines (ECBU) ## 1. Introduction Les infections urinaires sont très fréquentes. Souvent considérées comme banales et bénignes, elles peuvent aussi avoir des conséquences pathologiques sévères et peuvent entraîner des complications graves, notamment des atteintes de la fonction rénale. Le diagnostic d'infection urinaire évoquée par l'examen clinique du malade sera confirmé par l'examen cytobactériologique des urines (ECBU). ## Contexte clinique ### Signes - Incontinence urinaire - Douleurs lombaires - Hyperthermie associée à un signe urologique ### Systématique - Femme enceinte - Préopératoire - Diabétiques, porteurs de sonde - Contrôle post-thérapeutique ## II. Mode opératoire ### 1. Recueil des urines L'urine contenue dans la vessie est normalement stérile mais elle peut être contaminée lors de la miction par la flore normale qui colonise habituellement l'urètre. Pour limiter cette contamination on doit recueillir l'urine du milieu de la miction et éliminer celle du début qui aura entraîné la majeure partie des bactéries de l'urètre. L'urine peut être recueillie à n'importe quel moment de la journée, mais au mieux le matin après que le patient soit resté au moins 3 heures sans uriner. La toilette locale est très importante avec un savon antiseptique doux, puis rinçage à l'eau. Le premier jet (environ 20 ml) est éliminé et le deuxième jet est ensuite recueilli dans un récipient stérile. Il est important de bien expliquer au patient comment exécuter le prélèvement. ### Cas particuliers - Chez l'homme en cas de suspicion de prostatite on recueillera le premier jet, pour augmenter les chances d'isolement de la bactérie responsable qui est souvent en faible quantité. - Chez la femme en cas de pertes ou de règles, on devra mettre en place une protection vaginale. - Chez le nourrisson, on peut utiliser une poche plastique stérile, que l'on applique sur la peau, mais qui ne doit pas rester en place plus de soixante minutes. - Chez le patient porteur d'une sonde, on ne doit pas prélever dans la poche où la pullulation bactérienne est importante, mais par ponction directe dans la sonde après désinfection ou dans la chambre à prélèvement lorsqu'il y en a une. ## 2. Conservation et transport Le flacon doit être bouché hermétiquement, étiqueté précisément avec la date et l'heure du prélèvement et acheminé le plus rapidement possible au laboratoire. L'urine ne doit pas séjourner plus d'une heure à température ambiante pour éviter toute multiplication bactérienne. Elle peut être conservée à 4°C pendant 24 heures en cas de nécessité. ## 3. Examen cytologique L'examen en cellule dn Malassez permet de dénombrer les éléments figurés contenus dans un volume donné de l'urine à étudier. Leur concentration est exprimée par millilitre (ml). Cette technique est préférable à l'examen de l'urine entre lame et lamelle qui conduit à un résultat rendu en croix ou par champ microscopique, moins reproductible et plus difficile à interpréter, car soumis à l'appréciation de la personne qui réalise l'examen. Une urine non infectée contient moins de 10 000 leucocytes et moins de 5 000 hématies par ml. Une infection urinaire se traduit le plus souvent par la présence de: - 50 000 leucocytes/ml, parfois en amas - 10 000 hématies/ml; - des cellules du revêtement urothelial - la présence de cylindres leucocytaires est importante à prendre en compte; ## 4. Examen bactériologique ### 4.1. Culture bactérienne Elle permet l'isolement des bactéries et leur numération. Elle doit être quantitative par ensemencement d'une quantité connue d'urine sur un milieu gélosé en boîte de Pétri. Le milieu gélosé de CLED (cystéine, lactose, électrolyte déficient) convient à la culture des principales bactéries responsables d'infection urinaire. Dans des cas particuliers à la suite de l'examen direct on ensemencera une gélose au sang ou une gélose chocolat sous 10% de CO2 pour la culture des bactéries exigeantes. #### Milieu CLED ##### Principe Le milieu CLED (Cystine Lactose Electrolyte Déficient) est un milieu non sélectif, très utilisé dans l'étude des bactéries contenues dans l'urine. Etant un milieu non sélectif de nombreuses bactéries, tant Gram + que Gram-, pourront se développer. L'absence d'électrolytes (pas de NaCl) limite le phénomène d'envahissement par les Proteus. ##### Composition - Peptones 4g - Extrait de viande 3g - Hydrolysât trypsique de caséine 4g - L-cystine 0.128g - Lactose 10g - Bleu de Bromothymol 0,002g - Agar 15g - Eau distillée 1L La lecture s'effectue après 18 à 24 heures d'incubation à 37°. ##### Lecture Les bactéries : - lactose + apparaissent jaunes - lactose - apparaissent bleues vertes Après 18 h d'incubation à l'étuve à 37° C, chaque bactérie ou amas de bactéries présent dans l'urine donne naissance à une colonie visible à l'œil nu. L'absence de culture lorsque des bactéries ont été vues à l'examen direct, chez un malade non traité par des antibiotiques doit conduire à refaire l'ECBU : en présence de bactéries au Gram il faudra suspecter des bactéries déficientes ou inhabituelles et utiliser alors des milieux de culture appropriés plus riches (gélose au sang frais ou au sang cuit: gélose chocolat) et incuber en atmosphère contenant 10% de CO2. ### 4.2. Identification du germe #### 4.2.1. Morphologique - Taille des colonies - Contour - Opacité - Aspect #### 4.2.2. Coloration de Gram ##### Matériel - lames, colorants ##### Mode opératoire - Réaliser un frottis ou un étalement - Fixer la préparation à la flamme, sécher soigneusement puis laisser refroidir la lame. - Immerger les lames dans la solution de Cristal Violet pendant 1mm. - Lavage à l'eau en transvasant les lames - Immerger les lames dans du Lugol en les agitant - Laver à nouveau à l'eau - Décolorer jusqu'à disparition de la couleur violette dans l'alcool en faisant couler goutte à goutte sur la lame inclinée ou en immergeant les lames pendant une dizaine de secondes dans le décolorant. - Laver à l'eau. - Contre colorer avec la solution de safranine diluée pendant 20 à 30 secondes. - Laver à l'eau et sécher à l'air. - Observer à l'objectif X100, en immersion avec de l'huile. ##### Résultat Les bactéries gram + sont colorées en violet, les bactéries gram - sont colorées en rose, ceci étant du à une différence de composition de la paroi ##### Risques d'erreurs ###### Faux Gram (+) : - Étalement trop épais, - Dépôt de colorant dans le flacon de violet de gentiane: filtrer le colorant pour y remédier, - Décolorant laissé trop peu de temps (globalement, mieux vaut trop que pas assez. - Solution de safranine laissée très longtemps (plus d'une minute). ###### Faux Gram (-) : - Solution iodée de Gram laissée trop peu de temps, - Décolorant laissé trop longtemps et mal rincé, L'identification est orientée par l'examen des frottis colorés au Gram effectués à partir des différents types de colonies isolées, la recherche de la catalase pour les bactéries à Gram positif et pour les bacilles à Gram négatif l'identification est réalisée par l'étude des caractères biochimiques avec galeries classiques: #### 4.2.3. Identification biochimique ##### La Galerie d identification utilisée : ###### LE MILIEU DE HAJNA -KLIGLER Le milieu de Hajna-Kligler est un milieu complexe, qui permet la recherche de plusieurs caractères biochimiques. Il est très utilisé dans l'identification des Enterobacteriaceae. ##### Composition du milieu - Extrait de viande de boeuf 3g/L - Extrait de levure 3g - Peptone (riche en lysine) 20g - NaCl 5g - Citrate ferrique 0,3g - Thiosulfate de sodium 0,3g - Lactose 10g - Glucose 1g - Rouge de phénol (solution à 1%) 5mL - Agar 12g - Eau distillée 1L ##### Technique Ensemencer abondamment la surface par stries serrées ou par inondation, puis le culot par simple piqûre, à l'aide de la même pipette boutonnée. Il est important de ne pas oublier de dévisser partiellement la capsule afin de permettre les échanges gazeux. Mettre à l'étuve 24h à 37°C. ##### Lecture ###### Utilisation de sucres Deux glucides sont retrouvés dans le milieu de Hajna-Kligler, le glucose et le lactose. L'utilisation des glucides par une bactérie suit toujours la loi de la diauxie: quand une bactérie est capable de cataboliser deux glucides dont le glucose, elle utilise dans un premier temps le glucose jusqu'à son épuisement dans le milieu. Elle utilisera ensuite le deuxième glucide (ici le lactose). Il est par ailleurs important de se rappeler qu'une bactérie glucose - est toujours lactose-, le catabolisme du lactose passant par celui du glucose (l'hydrolyse du lactose donne les deux oses simples glucose et galactose). La technique particulière d'ensemencement du milieu Hajna-Kligler permet de distinguer les phénomènes selon leur lieu, pente ou culot. ###### Sur la pente: L'utilisation de la source de carbone est aérobie si la capsule est correctement dévissée. Le principal acide produit est le dioxyde de carbone. On peut distinguer plusieurs cas de figure : - Les bactéries glucose alcalinisent le milieu en utilisant les peptones. - Les bactéries glucose + et lactose + acidifient le milieu. - Les bactéries glucose + et lactose acidifient le milieu dans un premier temps par utilisation du glucose. Ce glucide étant en faible concentration (voir composition du milieu) il sera rapidement épuisé. - Les bactéries utilisent les peptones, ce qui conduit à une alcalinisation du milieu. ###### Dans le culot : L'utilisation de la source de carbone est anaerobie. Les principaux acides organiques produits sont non volatils : ils restent enfermés dans la gélose. - Les bactéries glucose - laissent le milieu alcalin en utilisant les peptones. Ces bactéries sont en général aérobies strictes, et leur culture sera normalement nulle dans le culot, - Les bactéries glucose + et lactose + acidifient le milieu. - Les bactéries glucose + et lactose - acidifient dans un premier temps le milieu par utilisation du glucose. Comme sur la pente le glucose est en faible concentration et il sera rapidement épuisé. Les bactéries utiliseront alors les peptones en alcalinisant le milieu. Cependant les acides produits par fermentation sont des acides relativement forts et le milieu reste acide. ###### Production d'H₂S La présence de thiosulfate de sodium et de Fer III dans ce milieu permet d'apprécier la capacité des bactéries à produire de l'H2S à partir du thiosulfate. Cette production est matérialisée par la formation à la limite du culot et de la pente d'un précipité noir de sulfure de fer. ##### Résultats - a) Bactérie de type fermentatif du glucose et lactose + : culot jaune et pente jaune. - b) Bactérie de type fermentatif du glucose et lactose : culot jaune et pente rouge. - c) Bactérie de type oxydatif du glucose ou glucose - et lactose culot rouge et pente rouge. - d) Bactérie de type oxydatif du glucose et lactose +: culot rouge et pente jaune. Ces bactéries sont aérobies strictes: le culot ne doit pas présenter de culture et sera donc rouge. La pente peut présenter une culture et sera jaune si l'acidification est suffisante et rouge dans le cas contraire. #### LE MILIEU CITRATE DE SIMMONS ##### Principe Dans ce milieu le citrate (C6H5O73-) est l'unique source de carbone. L'utilisation de ce substrat, pour la plupart des bactéries pouvant le cataboliser, est une utilisation aérobie, et se traduira par une alcalinisation du milieu. L'équation de l'oxydation par respiration aérobie du citrate est : $2 C6H5O73-+ 9 02 ---> 12 CO2 + 2 H2O + 6 OH-$ ##### Composition (en grammes par litre) - Sulfate de magnésium 0,2g - Citrate de Na+ 2g - NaCl 5g - Hydrogénophosphate d'ammonium 0,2g - Hydrogénophosphate d'ammonium monosodique 0,8g - Bleu de bromothymol 0,08g - Agar 15g - Eau distillée (qsp) 1L ##### Technique Le milieu est présenté sous forme de gélose inclinée. La pente est ensemencée par une strie longitudinale, réalisée à l'anse, à partir d'une suspension de la culture solide en eau distillée stérile. Il est important de ne pas apporter de substrats carbonés. Ainsi l'ensemencement à partir d'une souche pure fournie en bouillon nutritif ou en eau peptonée est impossible. Ne pas visser le bouchon à fond, afin de permettre les échanges gazeux (en particulier élimination du dioxyde de carbone). Mettre à l'étuve 24 heures à 37°C. ##### Lecture - Virage de l'indicateur de pH au bleu : il y a eu alcalinisation du milieu et la souche est citrate de Simmons +. - Pas de virage de l'indicateur de pH: il n'y a pas eu alcalinisation et le milieu ne présente pas de culture. La souche est citrate de Simmons -. ##### Causes d'erreurs : - Inoculum apportant une source de carbone - Bouchon mal dévissé #### MILIEU MANNITOL MOBILITE NITRATE Ce milieu permet l'étude de la dégradation du mannitol qui est un produit de dégradation du mannose et la recherche des nitrates reductase ##### Composition - pectone trypsique de viande 20 g - mannitol 2 g - KNO3 1 g - rouge de phénol 1% 4 ml - agar 4 g ##### Technique Ensemencer par piqûre centrale à l'aide d'un fil droit. Incuber 24 h à T° optimale. R: ce milieu est utilisable uniquement pour les bactéries fermentatives. Recherche de nitrate réductase: par les réactifs de GRIESS (acide sulfanilique et le naphtylamine) ##### Lecture - La mobilité - Culture dans tout le milieu: souche mobile - Culture le long de la piqûre: souche immobile - Utilisation du mannitol - Milieu devenu jaune: mannitol + - Milieu rouge: mannitol - Après lecture des milieux, ajouter à la surface du milieu 3 gouttes d'acide sulfanilique qui forme un sel avec les nitrites puis ajouter 3 gouttes d'alpha naphtylamine pour visualiser. #### LE MILEU UREE TRYPTOPHANE est un milieu synthétique qui fournit un ensemble de résultats utiles à l'identification de nombreux germes bactériens, notamment parmi les Enterobacteriaceae. ##### Composition - L-tryptophane 3g/L - Urée 20g - Hydrogénophosphate de potassium 1g - Dihydrogénophosphate de potassium 1g - NaCI 5g - Alcool à 95° 10mL - Rouge de phénol 25mg - Eau distillée (qsp) 1L ##### Principe Ce milieu ne contient pas de source de carbone utilisable, les bactéries ne pourront pas se multiplier. Trois activités enzymatiques peuvent être recherchées à partir de ce milieu: - l'uréase, enzyme hydrolysant l'urée, activité directement détectable par le suivi de l'alcalinisation $H2N \\ C-0 \\ H2N$ + H2O + H --> 2 NH3 + HCO3- - Les ions CO32- vont entrainer une forte alcalinisation du milieu qui sera révélée par un virage de l'indicateur de pH (le rouge de phénol) à sa teinte basique (rouge). - la tryptophane désaminase (TDA), après addition de chlorure de Fer III. Le Fer III forme un complexe avec le produit de l'activité de la TDA, l'acide indole-pyruvique, complexe décelable par la formation d'un précipité marron Tryptophane Tryptophane désaminase Acide indole pyruvique + NH3 + 2H+ + 2e- - la tryptophanase, après addition du réactif de Kovacs. Le diméthyl-amino-4-benzaldehyde contenu dans le réactif de Kovacs réagit avec l'indole, produit de l'activité de la tryptophanase, et forme un composé coloré en rouge. Tryptophanase Tryptophane + H2O Acide pyruvique + Indole + NH3 ##### Technique - Faire une suspension en milieu Urée-tryptophane - Etuver - Lire ##### Résultats - Uréase - La coloration rouge traduit une alcalinisation du milieu, suite à l'hydrolyse de l'urée: uréase+ ## III. INTERPRETATION DE ECBU C'est une partie très importante de l'ECBU. Elle s'appuie sur la leucocyturie, la bactériurie, la nature des espèces en cause et le fait que l'on retrouve un seul ou plusieurs types de bactéries à la culture. Ces données doivent être complétées par la connaissance du contexte clinique,: d'éventuels antécédents urologiques du sexe, et de la notion de traitement antibiotique récent ou en cours. L'urine est normalement stérile ou ne contient que des germes de contamination en faible quantité (<10³ UFC/ml), avec une leucocyturie < 10 000/ml. La majorité des patients présentant une infection urinaire ont une leucocyturie > à 100 000/ml. La présence de leucocytes en quantité anormale, sans bactérie visible à l'examen direct, et une culture négative, doivent faire suspecter une infection des voies urinaires à bacille tuberculeux. Il s'agit là d'une recherche particulière, qui doit être effectuée sur la première miction des urines de la nuit, après restriction hydrique. ## Tableau n° 2. Interprétation de l'ECBU | Bactéries/ml | < 10000/ml | Leucocyturie > 10000/ml | |---|---|---| | Absence de bactérie | Pas d'infection urinaire | Traitement antibiotique en cours | | 102 < bact < 104: Monomicrobien | Contaminallon ou infection débutante à contrôler | Tuberculose urinaire | | > 105: Monomicrobien | Prélèvement défectueux Infection urinaire débutante Infection sur terrain particulier: - femme enceinte - sujet àgé -sonde - immunodépression à contrôler | Prélèvement défectueux Infection traitée par antibiotique ou par diurèse abondante Infection urinaire débulante Prostatite, uretrite Infection sur sonde Infection urinaire | | 102 <bact < 104: Polymicrobien | Souillure probable à contrôler | Souillure ou infection sur sonde à contoler | | < 105: Polymicrobien | Souillure ou infection urinaire à contrôler | Infection urinaire probable si anomalies urologiques Contamination possible à contrôler | ## Antibiogramme Du fait de l'augmentation croissante des résistances acquises aux antibiotiques, l'antibioramme doit être réalisé dans tous les cas d'infection urinaire ayant fait l'objet d'une prescription d'ECBU. La bactérie la plus fréquemment isolée dans es infections urinaires est Escherichia coli, suivie de Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, des autres entérobactéries et de Staphylococcus saprophyticus. Les pourcentages varient selon qu'il s'agit d'une population de patients sans antécédents (80 à 90% d'Escherichia coli), ou de patients à risque ayant déjà reçu plusieurs traitements antibiotiques et/ou hospitalisés (35 à 50% d'Escherichia coli). Par ailleurs la sensibilité à l'ampicilline de cette bactérie a beaucoup diminué ces dernières années et ce n'est plus le produit préconisé pour un traitement de première intention d'une infection urinaire. On lui préférera le cotrimoxazole (Bactrim). Il faut savoir que l'on peut retrouver parfois chez les patients dits à risque des bactéries de l'environnement (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter, etc) souvent devenues très résistantes car sélectionnées par des antibiothérapies mal conduites, ainsi que des entérocoques et des Staphylococcus aureus résistants à l'oxacilline. ## Conclusion L'ECBU est l'examen le plus fréquemment demandé. Sa réalisation est simple mais deux points sont essentiels: le recueil des urines et l'interprétation des résultats. ## Rapport Donner un compte rendu à la fin de la troisième séance.