microbiologie (bacteriologie).pdf

1ère année de Médecine Dentaire - Semestre 2 - Module : Microbiologie - Immunologie Cours de Microbiologie - Partie I : Bactériologie - Pr Itto MAROUI Année universitaire 2021 - 2022 *****************...

1ère année de Médecine Dentaire - Semestre 2 - Module : Microbiologie - Immunologie Cours de Microbiologie - Partie I : Bactériologie - Pr Itto MAROUI Année universitaire 2021 - 2022 ***************** 1  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Objectifs 1. S’initier au monde bactérien (procaryotes) 2. Acquérir les connaissances élémentaires de bactériologie nécessaires à la compréhension des maladies infectieuses : 2.1. Connaître les principales caractéristiques de l’anatomie bactérienne. 2.2. Comprendre le rôle des structures bactériennes dans l’identification des bactéries, leur virulence et le mode d’action des antibiotiques. 2.3. Connaître les principaux éléments de la physiologie bactérienne et leurs implications dans la conduite d’un examen bactériologique lors du diagnostic biologique d’une infection bactérienne. 2.4. Connaître les structures génétiques bactériennes et les principaux mécanismes de variabilité génétique. 2.5. Connaître les principaux facteurs et mécanismes de la virulence bactérienne. 2.6. Connaître les principales familles d’antibiotiques et leurs mécanismes d’action sur les bactéries. 2.7. Connaître les principaux mécanismes de résistance des bactéries aux antibiotiques. 3. Connaître les caractères bactériologiques, antigéniques et épidémiologiques des principales bactéries d’intérêt médical. 2  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Contenu I. Bactériologie générale I.1. Structure bactérienne I.2. Physiologie bactérienne I.3. Génétique bactérienne I.4. Pouvoir pathogène des bactéries I.5. Antibiotiques : - Classification et mode d’action ; - Mécanismes bactériens de résistance. II. Bactériologie spéciale II.1. Streptocoques II.2. Staphylocoques II.3. Heamophilus influenzae II.4. Neisseria meningitidis / Neisseria gonorrhae II.5. Pseudomonas aeruginosa II.6. Entérobactéries II.7. Anaérobies II.8. Mycobactéries 3 Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI 4  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Structure bactérienne 1. Généralités 1.1. Historique  1ère observation et description des bactéries au début du 18ème siècle par Anthony VAN LEEUWENHOEK (1632-1723) : Découverte du microscope optique.  Étude des bactéries en 2ème partie du 19ème siècle par Louis Pasteur (1822-1895).  XXème siècle : Ère de la biologie moléculaire ; 1995 : Séquençage du 1er génome bactérien (Haemophilus influenzae).  XXIème siècle : Next Generation Sequencing (NGS). 1.2. Identification et nomenclature  Taxonomie (ou taxinomie) bactérienne : le regne, le domaine, le phylum, la classe, l’ordre, la famille, le genre et l’espèce.  Échelons hiérarchiques (taxons) les plus utilisés en bactériologie médicale : ordre, famille, genre et espèce. Ils sont exprimés par un nom latin (italique) dont la terminaison est : - "ales" pour l'ordre, - "aceae" pour la famille, - "us", "er" ou "a" pour le genre et l'espèce.  Espèce : unité de classification, souvent subdivisée en différentes sous espèces.  En pratique courante, genre et espèce suffisent pour caractériser une souche. L'initiale du nom du genre s'écrit en caractère majuscule, le reste de ce nom s'écrit en minuscules et aussi le nom de l'espèce. 5  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Exemples : Rang Ex.1 Ex. 2 Ex. 3 taxonomique Escherichia coli Streptococcus mutans Mycobacterium tuberculosis Regne Procaryotae Procaryotae Procaryotae Domaine Bacteria Bacteria Bacteria Phylum Proteobacteria Firmicutes Actinobacteria Classe Gammaproteobacteria Bacilli Actinobacteria Ordre Enterobacteriales Lactobacillales Actinomycetales Famille Enterobacteriaceae Streptococcaceae Mycobacteriaceae Genre Escherichia Streptococcus Mycobacterium Espèce E. coli S. mutans M. tuberculosis 1.3. Définition d’une bactérie  Microorganisme à structure unicellulaire procaryotique ;  Petite taille (en moyenne de 0,5 à 2 µm de l et de 2 à 10 µm de L) ;  Paroi rigide formée de peptidoglycane ;  Sans noyau différencié ;  Structure relativement simple ;  Pouvoir de multiplication autonome ;  Croissance exponentielle. 6  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI 1.4. Caractères de différenciation entre eucaryotes et procaryotes Caractères distinctifs Cellule eucaryote Cellule procaryote Taille 10-100 µm 1-10 µm Noyau Vrai noyau avec Chromosome (ADN) non entouré chromatine (ADN + d’une membrane nucléaire, histones) et membrane baignant dans le cytoplasme nucléaire => Nucléoïde Division cellulaire Mitose (multiplication Division directe par fission cellulaire) binaire transversale Méiose (formation de gamètes ou spores) Paroi cellulaire avec Non Oui peptidoglycane (Archées sans peptidoglycane) Organites cellulaires : - Réticulum endoplasmique (RE) Oui Non - Appareil de Golgi Oui Non - Mitochondries Oui Non - Microtubules Oui Non - Localisation des ribosomes Dispersés dans le Dispersés dans le cytoplasme ou cytoplasme ou liés au RE liés à la membrane cytoplasmique 2. Structure bactérienne 2.1. Morphologie  Forme :  Formes arrondies : cocci ou coques ;  Formes allongées dites en « bâtonnets » : bacilles ;  Formes en bâtonnets incurvées : vibrions ;  Formes spiralées : spirilles, spirochètes.  Taille : Variable de 0,1 à 600 µm.  Mode de groupement  Cocci : en paires (ex. pneumocoques), en "grains de café" (ex. gonocoques) en amas (ex. staphylocoques), en chainettes (ex. streptocoques).  Bacilles : en chaines (ex. Lactobacilles), en palissades (ex. Corynébactéries). 7  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Formes et modes d’association bactérienne 2.2. Anatomie de la cellule bactérienne Organisation cellulaire d’une bactérie 2.2.1. Structures obligatoires a. Paroi  Enveloppe rigide assurant la forme de la cellule (exosquelette) et sa protection ;  Présente chez toutes les espèces bactériennes à l’exception des mycoplasmes ;  Comporte un polymère commun, partie la plus interne : peptidoglycane ;  Rôle dans les échanges ;  Rôle antigénique ;  Rôle dans l’activation du complément (immunité non spécifique) ; 8  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Cible d’action des enzymes (exogènes : lysozyme et endogènes : autolysines) et d’antibiotiques (ex. béta-lactamines) ;  Selon sa structure, deux groupes de bactéries sont définis : Gram positif et Gram négatif. Structure moléculaire de la paroi des bactéries à Gram négatif et à Gram positif a.1. Peptidoglycane Hétéropolymère complexe formé :  d’une structure complexe composée d’une alternance de molécules de N-acétyl glucosamine et d'acide N-acétyl muramique ;  de chaînes latérales tétra-peptidiques fixées à l'acide N-acétyl muramique (ex. : L- Ala-D-gly-L-Lys-D-Ala) ;  d’un ensemble de ponts (peptidiques) inter-peptidiques. Structure du peptidoglycane  Structure de polymère en réseau => rigidité. a.2. Acides téichoïques  Polymères de glycérol et de ribitol reliés par des groupes phosphates ; 9  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Chargés négativement ;  Permettent au peptidoglycane de s’attacher à la membrane plasmique des bactéries ;  Présents chez les bactéries à Gram positif mais pas chez les bactéries à Gram négatif. a.3. Membrane externe Membrane trilamellaire avec :  une double couche phospholipidique ;  des protéines :  Protéines de structure assurant la cohésion de la membrane et sa liaison avec le peptidoglycane,  Porines : perméabilité ;  des lipopolysaccharides (LPS), les plus externes portent les antigènes O des bactéries et constituent l'endotoxine des bactéries. a.4. Espace périplasmique Contient des exoenzymes et protéines intervenant dans plusieurs processus biochimiques : assemblage du peptidoglycane, respiration bactérienne, dégradation de macromolécules, mouvement flagellaire, résistance aux antibiotiques, etc. b. Membrane cytoplasmique  Trilamellaire formée de :  phospholipides (double couche) ;  protéines : perméases, protéines liant les pénicillines (PLPs), protéines respiratoires, ATPases, etc. Structure de la membrane cytoplasmique bactérienne 10  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Absence de stérols ;  Rôle :  Limite mécanique de la cellule ;  Perméabilité sélective (perméases) et barrière osmotique ;  Lieu de plusieurs processus métaboliques : synthèse lipidique, synthèse de la paroi, fonction respiratoire et de phosphorylation oxydative pour les bactéries aérobies, etc. ;  Molécules réceptrices ;  Excrétion d’enzymes hydrolytiques ;  Fixation des flagelles et initiation de leur mouvement. c. Cytoplasme Hydrogel colloïdal, il contient :  ADN chromosomique et plasmidique ;  ARNs ;  Protéines, glucides, lipides, ions minéraux ;  Ribosomes ;  Inclusions : granules de stockage, vacuoles gazeuses, etc. d. Ribosomes  Nombreux : jusqu’à 20000 ribosomes / bactérie (40% du poids de la bactérie, 90% de l’ARN total) ;  Constitués de protéines ribosomales (40%) associées à l’ARNr (16S, 23S, 5S) sous forme de deux unités 30S et 50S ;  Libres dans le cytoplasme ou liés à la membrane cytoplasmique ;  Rôle : synthèse protéique. e. Appareil nucléaire  Diffus non entouré de membrane nucléaire, appelé nucléoïde ;  Composé de : (i) ADN à 80% (chromosome) : - Circulaire (rare cas linéaire, ex. Borrelia burgdorferi), - Bicaténaire, - Surenroulé, - Chromosome souvent unique ; 11  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI (ii) ARN à 10% ; (iii) Protéines à 10% : ADN polymérase (Réplication, réparation et recombinaison), ARN polymérase (Transcription), topoisomérases. 2.2.2. Structures facultatives a. Polysaccharides de surface a.1. Glycocalyx  Feutrage de fibres polysaccharidiques (= structure réticulée lâche) à l’extérieur de la paroi ;  Difficile à visualiser, sauf en microscopie électronique ;  Si quantité importante, on parle de "SLIME" ;  Intérêt médical : Facteur de virulence cours génétique bactérienne) c. Pili c.1. Pili communs (Fimbriae)  Structure fibrillaire protéique ;  Rigides, courts, nombreux et régulièrement disposés à la surface ;  Chez les bactéries à Gram négatif (exceptionnellement à Gram positif) ;  Rôle dans l’attachement aux surfaces => Pili communs chez E. coli favorisent la formation de biofilms. c.2. Pili sexuels (Pili F)  Peu nombreux (1 à 4) ;  Plus épais que les Fimbriae ;  Longs, creux, extrémité distale ronflée ;  Codés par des plasmides (facteur F) ;  Rôle dans l’attachement des bactéries entre elles => transfert de matériel génétique Conjugaison bactérienne (2 E. coli) (conjugaison bactérienne). d. Flagelles  Facteurs de mobilité de nature protéique "flagelline" ;  Très fins et beaucoup plus longs que la bactérie ;  Spécificité antigénique « Ag H » (ex. Sérodiagnostic de la fièvre typhoïde) ;  Disposition =>  Ciliatures polaires : monotriche, lophotriche, amphitriche ;  Ciliature péritriche. 13  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Exemples de systèmes ciliaires bactériens e. Spores  Structures spéciales, résistantes et dormantes.  Formes de résistance aux conditions défavorables ; replacée dans des conditions favorables, l’endospore germe et redonne une cellule végétative.  Leur position dans la cellule est variable : centrale, terminale, subterminale.  Chez certaines bactéries à Gram positif (Bacillus, Clostridium et Sporosarcina).  Propriétés par rapport à la cellule végétative :  Thermo résistance ;  Résistance aux agents physiques et chimiques ;  Résistance à la dessiccation et au vieillissement ;  Synthèse d’antibiotiques et de toxines. Spores bactériennes 14  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Physiologie bactérienne 1. Introduction  La physiologie bactérienne est la science des fonctions et des constantes du fonctionnement normal de la cellule bactérienne. Elle regroupe la nutrition permettant le métabolisme des bactéries et la croissance bactérienne.  La nutrition bactérienne permet à la bactérie de couvrir ses besoins en énergie et en nutriments afin d’assurer son métabolisme.  Métabolisme bactérien est l’ensemble des transformations biochimiques qui assurent l’élaboration des constituants bactériens et leur fonctionnement.  La croissance bactérienne correspond à un accroissement ordonné et coordonné de tous les composants de la bactérie. Elle se manifeste par une augmentation du nombre de cellules, et non pas, par une augmentation de la taille comme chez les organismes supérieurs.  Intérêt en médecine :  Diagnostic et évaluation des possibilités thérapeutiques d’une maladie infectieuse : - isoler, dénombrer et identifier la ou les bactéries en cause ; - déterminer son ou leurs antibiogrammes.  Réalisation de contrôles bactériologiques de l’environnement (atmosphère des blocs opératoires, surfaces, etc.). 2. Principaux éléments de la physiologie bactérienne 2.1. Besoins nutritifs des bactéries  Besoins élémentaires :  L’eau ;  O2, H2, C, N, P, S ;  Ions minéraux : Na, Mg, K, Cl, Fe, etc. ;  Oligoéléments : Zn, Mn, etc. 15  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Différents types trophiques chez les bactéries Besoin Source Type nutritionnel ou trophique Substrat minéral Photolitotrophe Lumineuse Phototrophe Substrat organique Photo-organotrophe Énergie Composé minéral Chimiolitotrophe Chimique Chimiotrophe Composé organique Chimio-organotrophe Minérale Autotrophe Carbone Organique Hétérotrophe Autres : Obligatoires Auxotrophe (=> bac. exigeante) sources d’azote, de soufre ; facteurs de croissance ; ions, Facultatifs Prototrophe (=> bac. non exigeante) oligoéléments ; etc. La plupart des bactéries d’intérêt médical sont chimio-organotrophes. 2.2. Métabolisme bactérien  Ensemble des réactions de biosynthèse et de dégradation.  Permet de définir des caractères d'identification biochimique qui représentent des critères essentiels dans la classification (ou Taxonomie) bactérienne. 2.3. Conditions environnementales  Hormis les exigences nutritionnelles, les bactéries requièrent des conditions physicochimiques particulières pour leur développement à savoir : (i) Le pH :  Bactéries neutrophiles se développent à 6 ≤ pH ≤ 8. (ex. Escherichia coli)  Bactéries alcalophiles se développent à pH alcalin (> 8). (ex. Pseudomonas, Vibrio)  Bactéries acidophiles : se multiplient mieux à pH acide (< 6). (ex. Lactobacillus) (ii) La pression osmotique : les bactéries sont assez tolérantes aux variations des concentrations ioniques. Certaines bactéries dites halophiles nécessitent du chlorure de sodium pour leur croissance (ex. Vibrio parahaemolyticus) ; d’autres dites halotolérantes acceptent des concentrations modérées en sels mais non obligatoires pour leur croissance (ex. Staphylococcus aureus). (iii) La pression mécanique ou hydrostatique : Bactéries =>  bonne tolérance générale à la pression.  espèces des grands fonds marins sont barophiles. 16  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI (iv) La température :  Bactéries mésophiles : 10 °C ≤ T° de croissance < 45 °C ; (optimum 30-37 °C).  Bactéries psychrophiles : T° de croissance proche de zéro (< 5-7 °C) ; (optimum : 5-10 °C).  Bactéries thermophiles : 45 °C ≤ T° de croissance < 70 °C.  Bactéries cryophiles : T° de croissance < 0 °C.  Bactéries hyper-thermophiles : T° de croissance > 80 °C. Les bactéries d’intérêt médical sont mésophiles. (v) L’oxygène : les bactéries peuvent être =>  aérobies strictes : nécessitant une teneur en oxygène moléculaire suffisante pour pouvoir se multiplier (ex. Pseudomonas, Acinetobacter).  micro-aérophiles : se développant mieux ou exclusivement lorsque la teneur en oxygène moléculaire est réduite (inférieure à celle présente dans l’atmosphère => ≃ 5 %). (ex. Campylobacter, certaines mycobacteries).  aéro-anaérobies facultatives : la croissance n’est pas affectée par la concentration en oxygène moléculaire, (ex. entérobactéries, streptocoques, staphylocoques).  anaérobies strictes ne se développent qu’en absence d’oxygène (ex. Bacteroides, Fusobacterium, Porphyromonas).  En pratique, afin de pouvoir réunir les conditions environnementales favorables à la croissance de bactéries différentes, les laboratoires de bactériologie disposent :  d’étuves permettant l’incubation des cultures à diverses températures (30°C, 37°C, 42 °C, etc.) et  de systèmes générateurs d’atmosphère particulière (microaérophilie, anaérobie, etc.). ex. jarres, sacs scellés en plastique. 17  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI 2.4. Croissance bactérienne  Milieux de culture  Supports nutritifs stériles qui permettent la prolifération des bactéries.  Consistance : (i) Liquide : bouillons de culture en tubes ou en flacons. La croissance peut alors être objectivée par un trouble du bouillon après incubation. Ex. Bouillon LB. (ii) Solide : milieux gélosés en boîte de Pétri. Après incubation, la croissance est objectivée par la mise en évidence de colonies bactériennes à la surface du milieu gélosé. Ex. Gélose Chapman (iii) Semi-liquide ou faiblement gélosé. Ex. Milieu Mannitol-mobilité  Plusieurs types de milieux de culture : (i) Milieux synthétiques de composition définie. Ex. Milieu urée indole, Citrate de simons. (ii) Milieux semi-synthétiques : milieux synthétiques additionnés d'un extrait biologique de composition inconnue. Ex. Milieu de christensen. (iii) Milieux complexes ou non synthétiques : très nutritif de composition indéfinie (extraits de viande, de levure, extraits enzymatiques, protéines ou peptones). Ex. Milieu cœur-cervelle (iv) Milieux d'enrichissement : bouillons permettant de favoriser la croissance d’une espèce en faible proportion dans un échantillon. Ex. Eau peptonée alcaline => enrichissement sélectif de Vibrio. (v) Milieux d’isolement :  Milieux enrichis par addition de diverses substances (sérum, œuf, sang, vitamines, etc.) => permettent la croissance des bactéries exigeantes. Ex. Géloses au sang frais, gélose chocolat.  Milieux sélectifs : favorisent la croissance d’un type bactérien particulier tout en inhibant celle des autres types bactériens. Ex. - Gélose Columbia ANC (Ac. Nalidixique + Colistine) => isolement de S. aureus, des streptocoques hémolytiques et des entérocoques. - Gélose au cétrimide (Ac. Nalidixique + Cétrimide) => isolement de Pseudomonas.  Milieux différentiels : permettent l'identification et l’isolement de certaines espèces de bactéries sur la base de l'apparence et de la couleur des colonies. Ex. Milieux chromogènes pour l’identification présomptive. 18  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Division bactérienne, délais de croissance et délai des résultats (i) Division bactérienne  Les bactéries sont des organismes asexués dont la reproduction a lieu par fission binaire encore appelée scissiparité. (ii) Délais de croissance  Temps de génération (TG) : désigne la durée nécessaire au doublement de la population.  Taux de croissance (TC) : désigne le nombre de division par unité de temps.  Ces deux paramètres sont variables d’une espèce bactérienne à une autre et pour la même espèce en fonction des conditions de son environnement. Ex. Dans les conditions idéales (in vitro) : Escherichia coli => TG = 20 min ; TC = 3/heure. Mycobacterium tuberculosis => TG = 20 h ; TC = 0,05/heure. (iii) Délai d’obtention des résultats de l’analyse bactériologique Les délais de croissance bactérienne conditionnent le délai de l’analyse et donc du rendu des résultats. Ex. L’analyse bactériologique d’un spécimen pathologique à entérobactéries (Escherichia coli ou Klebsiella pneumoniae par exemple) dure dans la plupart des cas 48 heures environ. Le diagnostic bactériologique d’un cas de tuberculose causé par Mycobacterium tuberculosis peut nécessiter un délai de 4 semaines. 19  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI 2.5. Dynamique de la croissance bactérienne La croissance bactérienne est un phénomène dynamique ; en milieu non renouvelé, elle comporte six phases représentées schématiquement dans la figure suivante : (i) Phase de latence : la croissance est nulle, il y a accoutumance de la bactérie à l’environnement. (ii) Phase d’accélération : augmentation progressive de la vitesse de croissance. (iii) Phase de croissance exponentielle durant laquelle le taux de croissance est maximal. (iv) Phase de ralentissement : la vitesse de croissance diminue. (v) Phase stationnaire : le taux de croissance est constant, il y a autant de division que de mort cellulaire. (vi) Phase de déclin : les bactéries ne se divisent plus, elles meurent par lyse cellulaire. 3. Implications dans l’examen bactériologique 3.1. Applications au diagnostic des maladies infectieuses  Phase pré-analytique :  Conditions des prélèvements.  Délais de l’examen des prélèvements.  Conditions de transport, de conservation.  Phase analytique :  Choix des milieux de culture selon le germe suspecté et l’analyse à effectuer. 20  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Conditions de stérilisation.  Ensemencement : culture qualitative et/ou quantitative.  Choix des conditions d’incubation selon les exigences environnementales.  Délais de culture et rendu des résultats.  Examen des cultures => identification phénotypique des bactéries analysées après combinaison des résultats obtenus des études : - de la morphologie, la structure pariétale, du mode de groupement ; - du profil métabolique : exigences nutritives ; métabolisme respiratoire ou fermentatif ; métabolismes protéique, glucidique, lipidique, etc. ; - des conditions physicochimiques de croissance. 3.2. Applications au dénombrement bactérien  Mesure directe du nombre de bactéries par unité de volume du prélèvement par des lames spéciales.  Dénombrement des bactéries par unité de volume d’échantillon analysé après culture sur boite de pétri. Le résultat est exprimé en Unités Formant Colonie par millilitre (UFC/ml). 3.3. Application à l’étude de la sensibilité aux antibiotiques  L’étude de la croissance bactérienne en présence de différents antibiotiques (antibiogramme) permet de définir pour chaque bactérie analysée un profil de sensibilité/résistance aux différentes molécules antibiotiques.  Mesure de l'activité antibactérienne d’un antibiotique donné sur une souche bactérienne donnée. => déterminer l’antibiothérapie la mieux adaptée. 3.4. Autres applications  Contrôle de la qualité bactériologique : aliments, eaux, médicaments, produits cosmétiques, etc. ;  Les domaines agricole et industriel ;  L’ingénierie génétique. 21  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Génétique bactérienne 1. Définitions 1.1. Génétique bactérienne La génétique bactérienne a pour objet l’étude du génome bactérien, son expression et ses variations. 1.2. Génome bactérien  Ensemble de gènes présents sur l’ADN chromosomique et extra-chromosomique ;  Modification possible / adaptation environnement. 1.3. Génotype / phénotype  Génotype : ensemble des constituants génétiques d'un organisme, qu'ils soient exprimés ou non.  Phénotype : correspond à la réalisation du génotype (expression des gènes) modulée par l’action de l’environnement. Du génotype au phénotype Ex. Régulation de l’opéron lactose chez E. coli 2. Éléments du génome bactérien 2.1. Chromosome bactérien  Un chromosome (sauf exception), habituellement circulaire, bicaténaire et enroulé. 22  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Composition : ADN associé à des protéines.  ADN : 2 chaines polynucléotidiques de polarités inversées (nucléotide = désoxyribose + acide phosphorique + une base purique (C ou T) ou pyrimidique (A ou G)) réunies par des liaisons hydrogène (A = T et C ≡ G).  Protéines : ADN polymérase (réplication, réparation), ARN polymérase (transcription), et les topoisomérases.  Taille variable de 500 à 10000 Kb. 2.2. Plasmides  Éléments génétiques facultatifs mobiles.  Molécules d'ADN extra-chromosomiques, bicaténaires, généralement circulaires.  Taille : petite, variable.  Une cellule bactérienne peut en contenir une à plusieurs copies.  Possèdent des gènes qui assurent leur réplication autonome.  Certains plasmides (plasmides conjugatifs) possèdent des gènes qui assurent leur transfert horizontal entre les bactéries (conjugaison bactérienne).  Non indispensables au métabolisme normal de la cellule hôte, ils représentent un élément essentiel d'adaptation bactérienne. En effet, ils confèrent aux bactéries qui les hébergent de nombreux caractères sélectifs (mais instables) : (i) la synthèse de protéines qui confèrent des propriétés de résistance : aux antibiotiques (bêta-lactamines, aminosides, phénicolés, cyclines, macrolides), aux antiseptiques mercuriels, aux métaux lourds (antimoine, argent, bismuth, etc.) et aux bactériophages. (ii) la production de certains facteurs de virulence (ex. Colibacilles entéropathogènes, staphylocoques). (iii) la synthèse de bactériocines qui inhibent la croissance d'autres bactéries (ex. E. coli => colicines létales pour les entérobactéries). (iv) le métabolisme du lactose ou de la lysine (ex. Proteus), la production de H2S (ex. E. coli), la dégradation du toluène ou de l'octane (ex. Pseudomonas), etc. 2.3. Transposons  Séquences de gènes de taille limitée qui peuvent se déplacer de manière autonome dans un génome.  Gènes sauteurs ou mobiles : peuvent passer d’un plasmide sur le chromosome, du chromosome au plasmide, de plasmide à plasmide (transposition intermoléculaire) ou d’un site à l’autre sur le même réplicon (transposition intramoléculaire).  N’apparaissent jamais à l’état libre. 23  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Codent pour les déterminants de la transposition (excision, intégration, transposition) et ceux d’autres fonctions.  Le transposon est constitué d'un fragment d'ADN limité de part et d'autre par des séquences répétitives inversées (IR) appartenant à des séquences d'insertion (IS). Transposition  La transposition est définie comme étant l’intégration directe d’une séquence de gènes, de petite taille, au sein d’un génome en l’absence d’homologie de séquence nucléotidique.  La transposition est un mécanisme d'adaptation génétique particulièrement efficace des bactéries à leur environnement. Les déterminants génétiques transposables peuvent être : (i) la résistance à une variété d’antibiotiques (bêta-lactamines, aminosides, phénicolés, cyclines, érythromycine, sulfamides et triméthoprime) ; (ii) la résistance aux sels de métaux lourds ; (iii) certains caractères métaboliques ; etc. 2.4. Intégrons  Éléments génétiques facultatifs.  Incapables d'autoréplication, ils sont portés par un réplicon (plasmide ou chromosome), peuvent aussi être véhiculés par un élément transposable.  Dotés d’un système de recombinaison site-spécifique permettant de capturer, exprimer et échanger des gènes sous forme de cassettes. Ils sont caractérisés par la présence d’un gène intI qui code pour une intégrase, d'un site d'attachement attI (site d’action de l’intégrase) et d'un promoteur (P). 24  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Intégration de gènes cassettes dans l’intégron  Plusieurs classes d'intégrons ont été décrites dans une grande variété de bactéries.  Les cassettes contiennent des gènes codant pour des toxines, des fonctions métaboliques ou encore de résistance aux antibiotiques. => rôle important dans l'acquisition et la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries. 3. Spécificité génétique des bactéries  Organismes Haploïdes :  Un allèle de chaque gène ;  Expression facile des mutations.  Reproduction asexuée :  Par division cellulaire => clones bactériens.  Temps de génération court.  Plasticité du génome bactérien : grande variabilité génétique qui permet aux bactéries de s’adapter à un environnement en constante évolution. Plasticité conférée par :  Remaniements intra-génomiques (mutations, transposition) ;  Acquisition de gènes exogènes. 4. Mécanismes de la variabilité génétique bactérienne 4.1. Mutations 4.1.1. Définition Mutation : modification brusque, définitive et héréditaire de la structure du matériel génétique. 25  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI 4.1.2. Types de mutations  Mutations ponctuelles : Délétion, insertion (addition), substitution. Conséquence au niveau Conséquence au niveau de la Fonctionnalité de la Mutation protéine à la suite du gène Protéine de la mutation Substitution : Mutation muette (silencieuse) Fonctionnelle - Transition si La protéine n’est pas modifiée purine → purine Mutation faux sens ou pyrimidine → Remplacement d’un Un acide aminé est remplacé par Fonctionnelle ou pyrimidine ; et nucléotide par un autre un autre non fonctionnelle - Transversion si Mutation non sens purine ↔ Non fonctionnelle Protéine incomplète (raccourcie) pyrimidine) Ajout d’un nucléotide qui Mutation faux sens entraine : un décalage de Protéine intégralement modifiée Non fonctionnelle Addition lecture des nucléotides ou à la suite de la mutation apparition d’un codon Mutation non sens non sens Non fonctionnelle Protéine incomplète (raccourcie) Perte d’un nucléotide qui Mutation faux sens entraine : un décalage de Protéine intégralement modifiée Non fonctionnelle Délétion lecture des nucléotides ou à la suite de la mutation apparition d’un codon Mutation non sens non sens Non fonctionnelle Protéine incomplète (raccourcie)  Microdélétions ou microinsertion : délétion ou insertion de quelques bases.  Macrolésions : Réarrangement (inversion, translocation) ; duplication ; délétion ; insertion. 4.1.3. Caractères des mutations  Rareté : événement rare. Le taux de mutation est la probabilité pour une bactérie de muter (pour un caractère donné) pendant une unité de temps (temps d’une génération). Ce taux varie de 10-3 à 10-20 suivant les caractères.  Spontanéité : bactérie mutante préexiste au sein de la population avant même tout contact avec l’agent sélectif.  Discontinuité : phénomène en « tout ou rien », c'est-à-dire que la modification se fait en une seule étape.  Spécificité et indépendance : la mutation n’affecte le plus généralement qu’un seul caractère sans modifier les autres (spécificité). Une mutation d’un caractère donné ne modifie pas chez un mutant la probabilité d’apparition d’une autre mutation pour un autre caractère (indépendance).  Stabilité : le caractère acquis par mutation est transmissible à la descendance. 26  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI 4.2. Acquisition d’ADN exogène : transferts génétiques La bactérie peut aussi être l'objet de variations génétiques par :  Transfert horizontal de matériel génétique entre bactéries par trois principaux processus naturels : la transformation, la conjugaison et la transduction ;  Acquisition de gènes phagiques : conversion lysogénique. 4.2.1. Transformation  Absorption et intégration par une cellule bactérienne d’extraits d’ADN bactérien étranger (ADN nu).  Seules les bactéries capables d’exprimer un état physiologique de « compétence » sont capables de fixer et absorber l’ADN libre de l’environnement. Ex. Bactéries pathogènes : Streptococcus spp., Haemophilus spp., Neisseria spp.  la transformation n’est possible qu’entre bactéries génétiquement proches (même espèce ou appartenant à des espèces voisines). Mécanisme de la transformation bactérienne 4.2.2. Conjugaison  Transfert unidirectionnel d’ADN d’un donneur (mâle) à un receveur (femelle) par contact physique direct entre deux cellules bactériennes. 27  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Transfert, à travers un pont cytoplasmique, d’ADN plasmidique (plasmides conjugatifs et plasmides mobilisables) et, parfois, d’ADN chromosomique.  Chez les bactéries à Gram négatif par l’intermédiaire de pili sexuels et chez celles à Gram positif par des protéines d’attachement. Pilus sexuel connectant 2 cellules d’E. coli  Une bactérie donatrice Hfr (plasmide F intégré dans le chromosome) peut transmettre non pas l’ADN plasmidique, mais celui de son propre chromosome. Conjugaison bactérienne 28  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Le transfert d’ADN chromosomique n’est possible qu’entre bactéries génétiquement proches, il est fréquent chez les bactéries à Gram négatif notamment E. coli, Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa. En revanche, le transfert de plasmides conjugatifs est un phénomène largement rencontré chez toutes les espèces bactériennes ; ces plasmides peuvent être porteurs de transposons et/ou d’intégrons. 4.2.3. Transduction  Transfert d’ADN entre bactéries par l’intermédiaire d’un bactériophage (ou phage). Structure d’un bactériophage Schéma bilan du mécanisme de la transduction généralisée 29  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Les phages existent sous la forme lytique (φ virulent) ou lysogène (φ tempéré) : (i) Les phages lytiques se multiplient dans la bactérie et la lysent. Parfois, accidentellement, il y a encapsidation d’un fragment d’ADN bactérien qui remplace l’ADN viral. Cette particule virale défectueuse peut conserver les propriétés « infectieuses » et rester capable d’injecter l’ADN exogène dans la bactérie réceptrice. Cet ADN peut s’intégrer, par recombinaison, dans le chromosome de la bactérie réceptrice : transduction généralisée. (ii) Les phages lysogènes s'intègrent dans le chromosome bactérien et se répliquent en même temps que lui. Dans ce cas l’ADN viral est qualifié de prophage. Dans une population de bactéries lysogènes, un prophage se libère de temps à autre du chromosome bactérien, se multiplie, provoque la lyse de la bactérie et peut infecter de nouvelles bactéries. Si, au cours de sa libération, le prophage emporte avec lui certains gènes bactériens, il peut permettre leur transfert d'une bactérie (lysogène) à une autre (lysogène) : transduction spécialisée. 4.2.4. Conversion lysogénique  Acquisition par une bactérie d’un (de) caractère(s) particulier(s) suite à l’intégration du génome d’un bactériophage dans son chromosome. L’expression de ces caractères est liée à l’état lysogène.  Le prophage apporte des gènes conférant à la bactérie hôte un avantage sélectif. Ex. Toxine du bacille diphtérique hébergeant le phage β. Toxines A et B du Vibrio cholerae hébergeant le phage CTX. 4.3. Remaniements intra-génomiques Modification de l’organisation du génome : un élément de la dynamique des génomes au cours duquel un génome subit des réarrangements par :  Transposition de séquences d’un site à l’autre ;  Délétion, inversion ou duplication d'une ou plusieurs séquences nucléotidiques ou  Translocation de séquences. 30  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Pouvoir Pathogène des bactéries 1. Notions élémentaires  Pouvoir pathogène : ensemble de propriétés biologiques qui permettent à un agent infectieux de provoquer une maladie chez un organisme hôte (notion qualitative).  Virulence : une notion quantitative, elle indique le degré de pathogénicité d’un agent infectieux.  Bactérie pathogène stricte : engendre une maladie même chez un sujet sain immunocompétent. Ex. Tuberculose, typhoïde, choléra, shigellose.  Bactérie pathogène opportuniste : commensale ne donnant pas de maladie chez les sujets sains immunocompétents, mais peut devenir pathogène suite à : (i) un déséquilibre de la flore normale du territoire où elle réside, (ii) un affaiblissement des défenses de l’hôte, (iii) sa migration vers un autre territoire de l’hôte.  Interactions hôte/bactéries : (i) Transit : Absence d’implantation de la bactérie sur l’hôte. (ii) Colonisation : Implantation de bactéries (commensales ou pathogènes) sur le revêtement cutanéo-muqueux sans provoquer de dommage à l’hôte. La colonisation simple par des bactéries pathogènes est qualifiée de portage (=> porteurs sains). (iii) Maladie infectieuse : Conflit hôte-bactérie aboutissant à des lésions chez l’hôte infecté (maladie). Transmission d’un individu à l’autre (infection).  Mécanismes généraux du pouvoir pathogène : (i) adhésion suivie de colonisation, (ii) invasion des tissus, (iii) production de toxines, (iv) déclenchement d’une réponse immunitaire délétère. 2. Mécanismes généraux de pathogénicité bactérienne 2.1. Facteurs d’adhésion et de colonisation  L’adhésion : facteur déterminant dans le processus de colonisation et d’infection bactérienne, elle permet aux bactéries de :  résister à l’expulsion par des phénomènes mécaniques tels que la toux, l’éternuement, le flux (péristaltisme, miction, etc.) ; 31  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  assurer un contact étroit avec les nutriments présents à la surface cellulaire.  L’adhésion bactérienne fait intervenir des constituants superficiels de la bactérie (= adhésines) et des récepteurs cellulaires de l’hôte. 2.1.1. Adhésines protéiques  Fimbriae ou pili communs : appendices extracellulaires filamenteux dont les extrémités (adhésines) reconnaissent des récepteurs spécifiques (glycoprotéiques ou glycolipidiques) à la surface des cellules à coloniser et s’y attachent. Ces pili sont retrouvés à la surface de nombreuses bactéries à Gram négatif (ex. Neisseria gonorrheae, Escherichia coli entérotoxinogènes (ECET), etc.). Ex. Chez E. coli : Pili Pap ↔ cérébroside des cellules de l’épithélium vésical.  Adhésines non fimbriales ou adhésines d’enveloppe : protéines de surface de la paroi bactérienne permettant un contact serré bactérie/cellule à coloniser. Elles sont retrouvées chez les bactéries à Gram négatif et les bactéries à Gram positif. Ex. Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus 2.1.2. Autres adhésines  polysaccharidiques : Glycocalyx => réseau polyosidique qui reconnait des structures analogues complémentaires à la surface des cellules. Ex. Streptococcus mutans : glycocalyx => formation de la plaque dentaire (biofilm).  L’acide teichoiques et lipotéichoique (cocci Gram positif). Ex. Streptocoque : acide lipotéichoique ↔ fibronectine des cellules épithéliales.  Lipopolysaccharide (LPS) de la membrane externe (Gram -). Ex. Pseudomonas aeruginosa : LPS = ligand bactérien aux cellules épithéliales. 2.2. Facteurs d’invasion Éléments favorisant la propagation des agents infectieux à travers les tissus de l’hôte. 2.2.1. Facteurs de mobilité Facteurs membranaires impliqués dans la mobilité permettant la colonisation des tissus de l'hôte. Ex. les flagelles ; certains types de pili (pili type IV). 2.2.2. Protection contre les défenses de l’hôte  Invasines de surface : Résistance à la phagocytose  Capsule polysaccharidique : rôle anti-phagocytaire. Ex. Streptococcus pneumoniae et Bacillus anthracis.  Protéines de la paroi Ex. Protéine M des streptocoques pyogènes (streptocoques β-hémolytiques du groupe A) : interagit avec certains facteurs du complément et réduit l’opsonisation => inhibition de la phagocytose. 32  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Enzymes inactivatrices de la réponse immunitaire ou inflammatoire Ex. - IgA-protéases Entérobactine, aérobactine.  Expression des récepteurs de lactoferrine ou de transferrine. Ex. Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis et gonorrhea => R-transferrine. 2.2.5. Persistance en intracellulaire (Macrophages) Propriété de résister aux lysosomes macrophagiques et de se multiplier à l’intérieur des phagocytes ⇒ Infection chronique ou rechute suite à une réactivation. Ex. Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes, Salmonella typhi. 2.3. Production de toxines 2.3.1. Exotoxines  Protéines produites par la bactérie et libérées dans le milieu extérieur ;  Thermosensibles et très immunogènes => Peuvent être transformées en anatoxines pour la préparation de vaccins.  Actions spécifiques. => Ex. (i) Toxines bloquant la synthèse protéique  Dénombrement des bactéries sur milieu gélosé.  Intérêt du rapport CMI/CMB :  Si la CMI d’un ATB est proche de sa CMB (CMB/CMI < 2), il est dit bactéricide.  Si la CMB est assez éloignée de la CMI, l’ATB est bactériostatique.  Le rapport CMB/CMI permet également de définir la tolérance d’une souche bactérienne à un ATB bactéricide (CMB/CMI > 32).  Courbes de croissance d’un inoculum bactérien en présence d’ATB en concentrations croissantes. 1.5. Évaluation in vitro de la sensibilité / résistance d’une souche vis-à-vis des ATB => Technique de l’antibiogramme Antibiogramme en milieu gélosé :  examen bactériologique qui permet d'apprécier la sensibilité ou la résistance d'une bactérie à un panel d’antibiotiques.  méthode standardisée.  étudie l’activité bactériostatique des ATB. 37  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI 2. Classification des antibiotiques 2.1. Critères de Classification La classification se fait selon :  l’origine (biologique, semi-synthèse ou synthèse) ;  la formule chimique (très variable) ;  la cible ou site d’action (variable) ;  le spectre d’activité antibactérienne (étroit ou large). 2.2. Principales familles d’antibiotiques 38 Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI 39  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI 3. Modes d’action des antibiotiques Plusieurs groupes d'ATB sont disponibles pour le clinicien, ils peuvent cibler divers processus bactériens vitaux. 40  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Structures et processus cellulaires cibles de l’action des ATB 2.3. ATB agissant sur la paroi bactérienne (synthèse du peptidoglycane) Actions sur la synthèse du peptidoglycane 41  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI 3.1.1. Bétalactamines Structure chimique des β-lactamines  Agissent au stade pariétal de la synthèse du peptidoglycane.  Inhibent, de manière compétitive, les PLPs (transpeptidases) par analogie structurale entre le noyau β-lactame et le dipeptide d’alanine.  Effets bactériostatique et bactéricide. 3.1.2. Glycopeptides 42  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Agissent au stade pariétal de la synthèse du peptidoglycane.  Se complexent et recouvrent l’extrémité D-Ala-D-Ala des unités disaccharides- pentapeptides, précurseurs du peptidoglycane, lorsque ils émergent de la membrane cytoplasmique => par encombrement stérique inhibent l’élongation (transglycosylation).  Effet bactéricide. 3.1.3. Fosfomycine  Agit au stade cytoplasmique de la synthèse du peptidoglycane.  Inhibe de la synthèse de l’UDP-ANAM (précurseur de la paroi) : la fosfomycine se comporte comme un analogue du phosphoénolpyruvate et inhibe l’enzyme pyruvyl- transférase => bloque la formation d'acide N-acétylmuramique.  Effet bactéricide. 43  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Inhibition de la synthèse du peptidoglycane 3.2. ATB inhibant la synthèse protéique 3.2.1. Inhibiteurs de la sous unité 30S (i) Aminosides ou aminoglycosides  Se fixent sur l’ARN ribosomal 16S (sous unité 30S) => altération de la structure du ribosome => synthèse de protéines anormales qui seront intégrées par exemple dans la membrane cytoplasmique qui va ainsi perdre son intégrité => mort cellulaire.  Action bactéricide. 44  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI (ii) Tetracyclines  Se lient de façon réversible à la sous unité 30S des ribosomes et empêchent l’accès des amino-acyl-tRNA au site A du ribosome.  Action bactériostatique. 3.2.2. Inhibiteurs de la sous unité 50S (i) Phénicolés (ii) Macrolides et apparentés Structures chimiques d’un Phénicolé (chloramphénicol) et d’un macrolide (l’érythromycine)  Se lient à la sous unité 50S du ribosome et bloquent l’élongation par inhibition de la transpeptidation. 45  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Certaines molécules (macrolides, lincosamides et streptogramines) peuvent aussi inhiber la phase de translocation.  Action bactériostatique. 3.3. ATB inhibant la synthèse des acides nucléiques 3.3.1. Quinolones / Fluoroquinolones 46  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Structure de base des quinolones : le groupe R (bleu) est assez souvent un groupe pipérazine; si la molécule est liée à un fluor (rouge), il s'agit d'une fluoroquinolone.  Agissent sur 2 enzymes impliquées dans la régulation du surenroulement de l’hélice ADN sur elle-même : l’ADN gyrase et l’ADN topoisomérase IV.  Induisent un changement de conformation des enzymes et leur inhibition (inhibition de l’ADN gyrase chez les Gram – ou de la topoisomérase IV chez les Gram +) ; => blocage de la réplication d’ADN suivi par la mort rapide de la bactérie.  Action bactéricide. 3.3.2. Rifamycines  Se fixent sur la sous unité β de l’ARN polymérase => inhibition de la reconnaissance du promoteur par l’ARN polymérase => inhibition de l’initiation de la transcription.  Action bactéricide. 3.3.3. Nitro-imidazolés 47  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Structure chimique du métronidazole  Réduits dans les bactéries anaérobies et microaérophiles, ils forment des métabolites qui diffusent vers l’ADN et l’oxydent => coupure des brins d’ADN et mort rapide de la cellule.  Action bactéricide. 3.4. ATB à action sur le métabolisme intermédiaire Sulfamides et triméthoprime  Inhibiteurs compétitifs.  Inhibent successivement la synthèse de l’acide folique qui est un cofacteur de la synthèse des bases puriques et pyrimidiques.  Chaque composant est isolément bactériostatique, l'association (Sulfamide + triméthoprime) est bactéricide. 48  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Actions successives des sulfamides et du triméthoprime sur la synthèse de l’acide folique 3.5. ATB agissant sur la membrane cytoplasmique 3.5.1. Polymyxines B et E (colistine)  Actifs que sur les bactéries aérobies à Gram négatif.  Agissent comme détergents cationiques : leurs extrémités hydrophobes s’insèrent parmi les phospholipides de la membrane externe, interagissent avec les molécules anioniques lipopolysaccharidiques (LPS) de la membrane externe => déstabilisation de la membrane cellulaire et perturbation de la perméabilité membranaire => sortie des éléments hydrosolubles => mort cellulaire.  Effet bactéricide rapide. 49  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI 3.5.2. Daptomycine  Glycolipopeptide cyclique naturel, actif uniquement sur les bactéries à Gram +.  Mécanismes d'action distincts, perturbant plusieurs aspects de la fonction de la membrane cellulaire : sa liaison (en présence d’ions calcium) à la membrane cellulaire entraîne une perte du potentiel membranaire qui entraine l’inhibition de la synthèse des protéines, d'ADN et d'ARN.  Effet bactéricide. 4. Conditions d’action d’un antibiotique Pour qu’un antibiotique soit efficace :  il lui faut une cible bactérienne spécifique ;  il faut qu’il atteigne sa cible => (i) traverser la paroi ; (ii) ne pas être modifié (rester actif), ni dégradé, ni rejeté ; (iii) être en concentration suffisante.  Il faut que la cible soit apte à interagir avec l’antibiotique. Si l'une de ces conditions n'est pas remplie, l'antibiotique se révèle inefficace, c'est le phénomène de résistance. 5. Mécanismes de la résistance bactérienne 5.1. Principales caractéristiques de la résistance aux ATB  Émergence rapide ;  Fréquence : en augmentation, variable selon l’ATB ;  Résistance transférable : Gènes transférables entre bactéries surtout ceux portés sur des éléments mobiles (plasmides ou transposons) => risque de diffusion épidémique ; 50  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI  Cumule de résistance => Bactéries multirésistantes, dont l’émergence représente une menace grave pour la santé publique. 5.2. Origines de la résistance : naturelle ou acquise (i) Résistances naturelles ou intrinsèques : l’espèce bactérienne est naturellement résistante à certains ATB. Résistance programmée sur le génome bactérien, elle est fixe et constante à l’intérieur du taxon (définit le phénotype sauvage) =>> constitue un critère de classification. Exemples : - Cible absente : Mycoplasmes  Béta-lactamines. - Cible inaccessible : Bactéries à Gram négatif  Vancomycine. - Inactivation : P. aeruginosa  Amoxicilline. (ii) Résistances acquises : apparaissent chez certaines bactéries jusqu’alors sensibles aux ATB. Elles sont consécutives à des modifications génétiques (chromosomique ou plasmidique) et ne concernent, souvent, que quelques souches de l’espèce. 5.3. Supports génétiques de la résistance aux ATB - Résistance naturelle :  chromosomique,  transmission verticale, mais peut être horizontale (via les transposons et plasmides). - Résistance acquise :  Chromosomique ; secondaire à une mutation, transformation, transduction ;  Extra-chromosomique ; par acquisition plasmidique ;  Transmission : verticale et horizontale (via les transposons et plasmides). 5.4. Mécanismes de la résistance aux ATB - Résistance par : (i) Perméabilité réduite ou imperméabilité de la membrane bactérienne à l’ATB ; (ii) Efflux de l’ATB hors de la bactérie ; (iii) Modification de la cible de l’ATB (=> l’ATB ne reconnait plus la cible) ; (iv) Inactivation enzymatique de l’ATB, mécanisme le plus fréquent. - Une souche bactérienne peut posséder plusieurs mécanismes concomitants. 51  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Mécanismes de la résistance aux ATB 5.5. Détection des résistances aux ATB : Moyens et intérêt - Moyens de détection :  Méthodes phénotypiques : - Détermination des CMI en milieu liquide, milieu gélosé ou E-tests. - Antibiogrammes (en milieu gélosé ou en milieu liquide).  Méthodes génotypiques : mise en évidence des gènes de résistance. - Intérêt :  Identification bactérienne culture sur milieux enrichis : gélose chocolat et gélose au sang (sauf entérocoques) ; Culturaux Hémolyse (gélose à 5% de sang) : - Totale (béta) : Strepto. groupe A (S. pyogenes), B (S. agalactiae), C, F, G ; - Partielle (Alpha) : ex. pneumocoque (S. pneumoniae) ; - Absente (gamma) : Strepto. du groupe D (entérocoques) et non groupables (= Strepto oraux => S. mutans, S. sanguis, S salivarius, etc.). Catalase (-), oxydase (-), nitrate réductase (-), fermentation du glucose et autres Biochimiques hydrates de carbone avec production d’acide lactique, test de lyse par la bile. Utilisation de la galerie d’identification API-Strepto. Sérotypage : Détection par agglutination d’un polyoside C pariétal spécifique => classification en groupes antigéniques. Antigéniques Exception : en cas d’absence du polyoside C (pneumocoque) => typage via les antigènes capsulaires libérés dans le milieu. Réservoir Transmission Streptococcus Homme (voies aériennes directe ou indirecte par voies pyogenes supérieures et/ou lésions respiratoire ou cutanéo-muqueuse. cutanées) Épidémiologie Streptococcus Homme, animaux directe verticale lors de agalactiae l’accouchement ou par voie sexuelle ; ou indirecte par voie digestive. Streptococcus Homme (voies aériennes transmission interhumaine par voie pneumoniae supérieures), animaux. respiratoire. Résistance naturelle : Aminosides (résistance à bas niveau), acide nalidixique (bas niveau), aztréonam, polymixine B, colistine, mecillinam. Antibio- Pour l’entérocoque on ajoute sulfamides, céphalosporines. résistance ATB actifs : Autres bétalactamines, tétracyclines, chloramphénicol, macrolides, lincosamides, synergistines, rifampicine, fosfomycine, glycopeptides. 54  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Bactérie Staphylocoques Caractères Famille : Micrococcacae ; Genre : Staphylococcus ; Le genre Staphylococcus comprend plusieurs espèces. Taxonomie Les trois principales espèces impliquées en pathologie humaine sont S. aureus, S. epidermis, S. saprophyticus. S. aureus et S. epidermis : germes commensaux de nombreux individus. S. aureus est l’un des pathogènes majeurs retrouvés en médecine du fait notamment de sa virulence et de sa fréquence. Cocci à Gram positif ; regroupement en amas (grappes de raisin), en tétrades, Morphologiques en diplocoques ou isolées. Immobiles ; non sporulés ; acapsulés (quelques fois capsulés). Aéro-anaérobies facultatifs ; non exigeants (=> milieux ordinaires) ; Gélose au sang + CNA (colistine + ac. nalidixique) : sélectif des gram positifs. S. aureus : Culturaux - Milieu sélectif => Milieu Chapman. - Hémolyse totale (β-hémolytique) ; - Colonies lisses, rondes, bombées ; habituellement pigment jaune-doré et parfois non pigmentées. Catalase (+) ; fermentent le glucose et le glycérol ; oxydase (-) ; S. aureus : Coagulase (+) (ǂ des autres staphylocoques qui sont à coagulase Biochimiques négative) ; DNase (+) ; fermente le mannitol ; citrate (+) ; indole (-). Utilisation de la galerie d’identification API Staph. Détection de plusieurs antigènes de surface par la technique d’agglutination : Antigéniques protéine A, récepteurs pour le fibrinogène, antigènes capsulaires. Réservoir : Homme (peau, muqueuses ; etc.), animaux, environnement. Épidémiologie Transmission : surtout interhumaine directe et indirecte par les voies : cutanéo- muqueuse, percutanée, digestive, respiratoire. Résistance naturelle : Acide nalidixique, mecillinam, aztréonam, colistine, Antibio-résistance polymyxine B. ATB actifs : Glycopeptides, rifampicine, pénicillines M, acide fusidique. 55  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Bactérie Heamophilus influenzae Caractères Famille : Pasteurellaceae ; Genre : Heamophilus ; Le genre Heamophilus comporte une vingtaine d’espèces dont quelque unes Taxonomie seulement sont pathogènes pour l’homme. Heamophilus influenzae est l’espèce responsable de la majorité des infections liées à ce genre. H. influenzae comporte 6 sérotypes (a, b, c, d, e, f). Petits bacilles ou coccobacilles à Gram négatif ; fins ; parfois filamenteux et Morphologiques polymorphes. Immobiles ; non sporulés ; parfois capsulés (souches invasives). Aérobies et anaérobies facultatifs. Exigeant => milieux enrichis contenant des facteurs de croissance (V et X) => gélose chocolat (sang cuit à 80°C) + polyvitamines. Culturaux Culture en atmosphère ordinaire ou enrichie en CO2. Souches capsulées => colonies muqueuses, volumineuses et bombées, facilement dissociables. Souches non capsulées : colonies lisses, plus petites, difficiles à prélever. Glucose (+) ; catalase (+) ; oxydase (+) ; nitrate réductase (+) ; uréase (+) ; indole (+) ; etc. Biochimiques Utilisation de la galerie d’identification API NH. Chez les souches capsulées => détection par agglutination d’antigènes Antigéniques capsulaires solubles (a-f). Le sérotype b étant le plus fréquent et le plus virulent. Réservoir : Homme (=> bactérie commensale des voies aériennes supérieures). Épidémiologie Transmission interhumaine : directe par voie respiratoire. Souches capsulées dites virulentes et souches non capsulées dites opportunistes. Résistances naturelles : macrolides à 16 atomes (spiramycine, josamycine) ; bacitracine ; lincosamides, mécillinam ; oxacilline ; glycopeptides. Antibio-résistance ATB actifs : aminopenicillines, céphalosporines de 3ème génération, aminosides, fluoroquinolones, trimethoprime, tetracycline , chloramphénicol. 56  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Bactérie Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhea Caractères (Méningocoque) (Gonocoque) Famille : Neisseriacae ; Genre : Neisseria ; Taxonomie Deux espèces Neisseria meningitidis et Neisseria gonorrhoeae sont des pathogènes stricts de l’Homme. Cocci à Gram négatif assemblées en paires (faces aplaties => aspect du Morphologiques diplocoque en grain de café) ; immobiles. Aérobies stricts mais nécessité d’un enrichissement en CO2 (5-10%). Bactérie exigeante : culture sur milieu Plus exigeante : culture sur milieu enrichi en aérobiose => gélose chocolat enrichi => gélose au sang cuit + (sang cuit) + polyvitamines. polyvitamines. Milieu peut être rendu Incubation à 35-37 °C en atmosphère sélectif par addition du mélange Culturaux d’ATB VCN (vancomycine, colistine humide et riche en CO2. et nystatine) Colonies blanches-grisâtres, bombées luisantes, plus ou moins muqueuses à Incubation à 37°C en atmosphère humide et riche en CO2. bords réguliers. Colonies petites, grisâtres, opaques ou translucides, à bords irréguliers. Catalase (+), Oxydase (+), glucose (+), Catalase (+), Oxydase (+), glucose (+), maltose (+), saccharose (-), alpha- maltose (-), saccharose (-), alpha- Biochimiques glutamyl-transférase (+) glutamyl-transférase (-). Utilisation de la galerie d’identification API NH. Identification antigénique : Détection Détection d’antigènes (protéine I) du Antigéniques d’antigènes capsulaires solubles par gonocoque par la technique ELISA agglutination (> 12 sérotypes). (plusieurs sérotypes). Réservoir : Homme (commensale du Réservoir : Homme (muqueuses des rhino-pharynx). voies uro-génitales). Transmission interhumaine directe par Transmission interhumaine directe Épidémiologie voie respiratoire. par : voie vénérienne (sexuelle) ; Plusieurs sérogroupes dont A, B, C, Y, périnatale. W135 et X sont les plus fréquents. Résistance naturelle : Triméthoprime, lincosamides, colistine, vancomycine, Antibio- glycopeptides. résistance ATB actifs : Ampicilline, céphalosporines de 3ème génération, ciprofloxacine. 57  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Bactérie Pseudomonas aeruginosa Caractères (bacille pyocyanique) Famille : Pseudomonadaceae ; Genre : Pseudomonas ; Le genre Pseudomonas comporte une quarantaine d’espèces. L’espèce type est Taxonomie Pseudomonas aeruginosa, elle est la plus fréquemment impliquée en pathologie humaine. Plusieurs sérotypes (O1-O20) définis par les antigènes O du LPS. Bacilles à Gram négatifs ; droits ; non sporulés ; Morphologiques Mobiles par 1 flagelle polaire. Non exigeant => culture sur milieux ordinaires ou sur milieu sélectif (gélose au cétrimide). Non fermentant ; aérobie strict (mais respire les nitrates). Incubation de 30 à 41°C en atmosphère humide. Colonies de 3 types : (i) Larges (grandes, isolées, bombées et à contour irrégulier) ; Culturaux (ii) Small (petites, mâtes, bombées et à contour régulier) ; (iii) Muqueuses (bombées, opaques et visqueuses). Production de pigments : bleu-vert (= pyocyanine) ; jaune-vert fluorescent (= pyoverdine), etc. Colonies à odeur caractéristique de la fleur de "seringa". Oxydase (+) ; catalase (+) ; indole (-) ; urée (-) ; Nitrate-réductase (+) ; etc. Biochimiques Utilisation de la galerie d’identification API 20NE Sérotypage => mise en évidence d’antigènes O du LPS de la paroi par Antigéniques agglutination. Habitat : bactérie ubiquitaire => environnement (eau, sol, plantes) ; environnement hospitalier ; elle est rarement un membre de la flore microbienne normale chez les Épidémiologie humains. Transmission directe ou indirecte. Résistance naturelle : pénicillines G, A et M, céphalosporines C1G et C2G, céfixime, céfuroxime, céfotaxime, ceftriaxone, glycopeptides, ertapéneme, kanamycine, tétracyclines, chloramphénicol, triméthoprime, sulfamides, quinolones 1G. Antibio-résistance ATB actifs : aminoglycosides (amikacine, tobramycine) ; fluoroquinolones (ciprofloxacine) ; céphalosporines (ceftazidime, céfépime, cefpirome) ; pénicillines antipseudomonas (ticarcilline et pipéracilline) ; carbapénemes (méropéneme, imipéneme) ; polymyxines (colistine) ; aztréonam. 58  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Bactérie Entérobactéries Caractères Famille : Enterobacteriaceae ; => famille d’une grande importante médicale. Plus de 30 genres, plus de 140 espèces et plusieurs sérotypes. Taxonomie Principales entérobactéries d’intérêt médical : Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Yesrsinia. Bacilles à Gram négatif ; isolés ; polymorphes ; non sporulés ; peuvent être capsulés (Klebsiella). Morphologiques Mobiles grâce à une ciliature péritriche ou immobiles (Klebsiella, Shigella, Yersinia pestis). Aérobies anaérobies facultatifs ; culture en milieu ordinaire (bouillon ou gélose) ; poussent à une température optimale de 37°C. Culturaux Divers milieux sélectifs. Colonies de taille, forme et aspect différents : lisses, rugueuses ; muqueuses (souches capsulées), etc.). Fermentent le glucose avec ou sans production de gaz; oxydase (-) ; catalase Biochimiques (+) (à l’exception de Shigella dysenteriae) ; réduisent les nitrate en nitrite. Utilisation de la galerie d’identification API 20E. Mise en évidence de 3 types d’antigènes spécifiques : Ag pariétaux (O), Ag flagellaires (H) et Ag capsulaires (K) => classer en sérotypes les souches d’une même espèce. Antigéniques Sérotypage : - par agglutination en présence d’un immunosérum spécifique ; - grand intérêt clinique et épidémiologique. Réservoir : sont ubiquitaires => Homme et animaux (tube digestif), environnement (eau, sol, plantes, environnement hospitalier). Ne font pas partie de la flore buccale, leur présence n’est que transitoire. Transmission large, directe ou indirecte. Épidémiologie Groupe hétérogène : - Pathogènes spécifiques (Shigella, Yersinia pestis, Salmonella, certaines Escherichia coli) ; - Pathogènes opportunistes (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogens, Serratia marcescens). Résistance naturelle : celle des bacilles à Gram négatif (pénicilline G, oxacilline, macrolides, lincosamides, glycopeptides, etc.) en plus d’autres Antibio-résistance résistances selon les groupes ou espèces. ATB actifs : Nombreux avec une grande diversité de sensibilité selon les groupes ou espèces. 59  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Bactérie Anaérobies Caractères - Flore exogène d’origine tellurique : bactéries saprophytes du sol et commensales des cavités naturelles de l’Homme et des animaux. Elles appartiennent au genre Clostridium et sont pathogènes par production de toxines puissantes. Classification - Anaérobies non telluriques (flore de Veillon) : bactéries commensales des voies respiratoires, digestives et génitales de l’Homme et des animaux. Elles ne peuvent pas survivre dans le sol, leur pouvoir pathogéne est dû à leur multiplication dans un site anatomique normalement stérile. Gram positif Gram négatif Bacilles Cocci Cocci Bacilles Non sporulés Sporulés Clostridium Actinomyces perfringens Bacteroides Peptostreptoc Morphologiques Bifidobacterium Clostridium (groupe fragilis) occus difficile Eubacterium Veillonella Prevotella Clostridium Peptococcus tetani Porphyromonas Lactobacillus Clostridium Fusobacterium Propionibacterium botulinum Milieux de culture enrichis en sang et vit K. additionnés d’un agent réducteur comme la L-cystéine. Milieux de Schaedler, géloses Brucella, Columbia ou Viande-Levure. Ces milieux doivent être ensemencés et incubés le plus rapidement possible en Culturaux atmosphère anaérobie (jarres, sacs en plastique fermés hermétiquement). Temps d’incubation est de plusieurs jours. Divers aspects de colonies. Recherche d’oxydase, catalase, fermentation des sucres, etc. Biochimiques Utilisation de galeries : Galerie API 20A, Galeries Rapid ID32A, Rapid ANA II. Espèces telluriques => mise en évidence de toxines spécifiques par ELISA. Antigéniques Anaérobies non sporulés : détection des antigènes de surface par ELISA, Immunofluoréscence. Réservoir : bouche, nez, gorge, tractus intestinal bas, vagin, portion terminale de Épidémiologie l’urètre. La nature des bactéries varie selon les sites. Transmission : directe ou indirecte. Résistance naturelle : varie selon les genres ou espèces. Aminosides, (sauf Bacteroides ureolyticus sensible à gentamicine et amikacine), Antibio- aztréonam (sauf Fusobacterium et B. ureolyticus), fosfomycine (sauf résistance Fusobacterium spp.), etc. ATB actifs : Nitro-imidazolés (sauf Actinomyces spp. - Propionibacterium spp) ; Bêta-lactamines + inhibiteurs de β-lactamases ; Carbapénèmes ; Chloramphénicol. 60  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Bactérie Mycobactéries Caractères Famille : Mycobacteriaceae; Genre unique : Mycobacterium ; Le genre Mycobacterium comprend : - Nombreuses espèces (> 150) saprophytes ou commensales => Bactéries atypiques (non tuberculeuses). Taxonomie - Des espèces pathogènes responsables essentiellement des maladies respiratoires : (i) Groupe Mycobacterium tuberculosis : bactéries tuberculeuses, comprend M. tuberculosis tuberculosis ; M. tuberculosis bovis ; M. tuberculosis africanum ; etc. (ii) Mycobacterium leprae (non tuberculeux). Bacilles acido-alcoolo-résistants : paroi épaisse riche en lipides => acido-alcoolo- résistance et une résistance naturelle relative à de nombreux antiseptiques et à certains antibiotiques. Morphologiques Colorés par la méthode de Ziehl-Neelsen. Bacilles fins légèrement incurvés, isolés ou groupés en amas ; immobiles, non sporulés et non capsulés. Aérobies stricts ; ne poussent pas sur milieux ordinaires => Culture sur milieu à l’œuf de Löwenstein-Jensen (milieu le plus utilisé). Croissance lente => - M. tuberculosis : colonies apparaissent en 21 jours en moyenne. Colonies d’une teinte crème-beige, sèches et à surface rugueuse. Culturaux - M. bovis : culture plus lente, colonies apparaissent en 30 à 60 jrs. Colonies petites, lisses et non pigmentées. - M. africanum : culture plus lente (4 à 8 semaines), colonies petites et mates. - M. leprae : non cultivable (mise en évidence sur frottis après coloration). La culture sur milieux liquides (ex. MGIT : Mycobacteria growth indicator tube) permet une détection des mycobactéries avec 7 à 14 jours d’avance. Catalase (+), nitrate (+), Biochimiques M. tuberculosis : Synthèse de l’acide nicotinique ou niacine. Recherche par immunochromatographie de l’Ag MPT64 (protéine sécrétée par les mycobactéries du groupe tuberculosis) dans le milieu de culture. Antigéniques Les protéines antigéniques de la famille ESAT-6 (Early Secretory Antigenic Target 6) permettent d’identifier rapidement le groupe tuberculosis. 61  Microbiologie, S2, Méd. Dent., FMDR, Pr I. MAROUI Mycobactéries (suite) Tuberculose = problème mondial de santé publique ; 95% des cas => Pays en voie de développement. Réservoir Transmission Homme (pathogène strict) ; Interhumaine : directe par voie M. tuberculosis Animaux familiers à aérienne ou indirecte (mains, ou l’Homme peuvent aliments, etc.) bacille de Koch occasionnellement être contaminés. Animal Contamination humaine par Épidémiologie voie aérienne au contact des M. bovis animaux ou par ingestion de lait cru contaminé (rare). M. africanum Homme Interhumaine par voie aérienne. Homme Interhumaine : difficile, par les M. leprae secrétions nasales, oro- pharyngées, ulcères cutanés. Environnement (sol et eau). Contamination par voie Mycobactéries L’homme peut être colonisé aérienne, percutanée. Pas de atypiques au niveau des muqueuses. transmission animal-homme, ni (pathogènes opportunistes). de transmission interhumaine. Résistance naturelle de Mycobacterium tuberculosis aux antituberculeux est rare. ATB actifs : Antibio- résistance - Groupe M. Tuberculosis : Isoniazide, streptomycine, ethambutol, rifampicine et pyrazinamide. - M. atypiques : sensibilité aux ATB variable d’une espèce à l’autre. 62