Hfdst 1, 2, 3 en 4 Medische microbiologie - pathologische specimens - MO - kweekmethoden.pdf

Medische microbiologie: bacteriologie theorie BL 2 Kennismaking Medische Microbiologie bacteriologie theorie BL 2  [email protected]  2 uur per week gedurende 12 weken  Cursus:  Powerpoint presentaties (Canvas)  Medische microbiologie voor laboratoriumtechnologen deel 1: J.Verhaegen, J....

Medische microbiologie: bacteriologie theorie BL 2 Kennismaking Medische Microbiologie bacteriologie theorie BL 2  [email protected]  2 uur per week gedurende 12 weken  Cursus:  Powerpoint presentaties (Canvas)  Medische microbiologie voor laboratoriumtechnologen deel 1: J.Verhaegen, J.Vandeven, M.Pyckavet, uitgeverij ACCO  Medische microbiologie voor laboratoriumtechnologen deel 2: J.Verhaegen, J.Vandeven, M.Pyckavet, uitgeverij ACCO 3  Examen in juni na periode 3 en 4: multiple choice via Canvas  4 studiepunten (120 u = 24 u les en 96 u studeren)  Hoofdstuk 5 = zelfstudie  Mix van lessen en ingesproken PowerPointpresentaties  Per hoofdstuk vraagjes op Canvas om te oefenen.  Na elk hoofdstuk: vragen a.d.h.v. wooclap : https://app.wooclap.com/home 4 Inhoud 1. Medische microbiologie 2. Pathologische specimens 3. Microscopisch onderzoek 4. Kweekmethoden 5 Medische microbiologie 1.1. Terrein van de medische microbiologie  onderdeel van de microbiologie  mens:  commensalen  specifieke of toevallige pathogenen  transiënte omgevingsflora  huid en slijmvliezen: permanente kolonisatie → onschadelijk: commensalen 7 Weetjes  10 x meer bacteriën dan cellen in lichaam  3% totale lichaamsgewicht  10 000 verschillende soorten  50% faeces = bacteriën  Slechts 15% kweekbaar 8 Normale omstandigheden  vóór de geboorte → geen contact micro-organismen  vanaf de geboorte → progressief contact micro-organismen 9 10 Commensalen - residente flora – blijvende flora  leven van onze afvalproducten = mee-eters  slijm, excretieproducten, afgeschilferde cellen, voedselresten  leven op onze huid en slijmvliezen → niet schadelijk 25 Hoe houden we die massa commensalen onder controle?  Binnendringen door huid  mechanische barrière  aanwezigheid vetzuren  Binnendringen via slijmvliezen  slijmproductie  antistoffen (IgA)  lysozyme (algemene antibacteriële stoffen)  Bij beschadiging van de weefsels: vernietiging door fagocytose 26 27  commensalen → aangepast aan levensomstandigheden voeding, temperatuur, vochtigheid, vasthechten op huid en slijmvliezen  dynamisch evenwicht tussen verschillende commensalen -> beletten kolonisatie nieuwe soorten (= kolonisatieresistentie) 28 Transiënte flora – tijdelijke flora  omgevingsorganismen regelmatig aanwezig  darm  orofarynx (= bovenste gedeelte van de keelholte)  huid  geen kans om zich te vestigen en vermenigvuldigen 30 Pathogenen  schadelijk → toxines → doordringen in weefsels / bloedbaan → vernietigen weefselcellen → excessieve aangroei en uitputten van energiereserves  ! Virulentie-factoren ! (toxiciteit, invasiviteit, kapselvorming,….)  strikt menselijke pathogenen ↔ gemeenschappelijke pathogenen ↔ mens als toevallige gastheer 31 Opportunistische pathogenen  normaal onschadelijk  niet in staat binnen te dringen  niet vermenigvuldigen en vestigen  produceren geen toxines  afweer gastheer verzwakt  algemeen (ondervoeding, medicatie, onderliggende ziekte)  lokaal doorbreken epitheelbarrière huid en slijmvliezen (wonden, vreemde voorwerpen, katheters,….) 32 2.1. Soorten pathogene micro-organismen  meeste infecties → virussen → zelf-limiterend → antivirale geneesmiddelen  bacteriën → spontane genezing ↔ levensbedreigend → effectieve antibiotica → weinig virulent → lokale infecties → frequenter door breedspectrumantibiotica  Schimmels en gisten (ééncelligen en meercelligen) → beperkt als ziekteverwekker geïndustrialiseerde landen ↔ ontwikkelingslanden  Parasieten 33 Pathologische specimens  opsporen van infecties → geschikte specimens → microbiologisch onderzoek  bijbesmetting vermijden  goede identificatie van de stalen  Aanvraagformulier + gewenste onderzoek + klinische informatie 35 2.1 Identificatie  Specimens en aanvraagformulier: duidelijk identificeerbaar  naam en voornaam patiënt  geboortedatum  gehospitaliseerde: eenheid en afdeling ambulante: adres  aanvragende arts  soort specimen + datum + uur  gevraagde onderzoeken  vermoedelijke diagnose/klinische informatie  eventueel gebruik van antibiotica 36 Nuttig  Tijdstip aankomst labo?  groot tijdsverloop → afsterven pathogenen en/of overgroei van commensalen  ongeschikt voor microbiologisch onderzoek 38 2.2. Transportmateriaal Wattendrager of wisser  houten of plastic staafje + cellulosepropje  metaaldraad: urethrale secreties of nasofaryngeale afname (kinderen)  slijmvliezen, wondsecreties en perineale huid 39 Nadeel:  geringe hoeveelheid materiaal  Snelle afsterving van bacteriën (uitdroging, toxisch)  >106 bacteriën per wisser voor microscopisch onderzoek  Bij cultuur: 10% van de aanwezige kiemen op wisser gegroeid  Noodzakelijk: dubbele afname (tenzij Eswab) Microscopisch onderzoek: Kleuring Cultuur (kweek) 40 Oplossing:  Transportbodems volgens Stuart  halfvaste bodem zonder voedende bestanddelen  Thioglycolaat en bufferzouten (actieve houtskool)  ↑ overleving tijdens transport /anaëroben 41 Nadeel:  niet bruikbaar voor kleuringspreparaten  2de droge wisser voor microscopisch onderzoek Nieuw:  Eswab  Nylonvezels: betere overleving/hogere opbrengst  Vloeibaar transportmedium: kleuringen/PCR/kweek 42 Spuit  etter en andere vloeistoffen (fistelvocht, wondspoeling)  alle gesloten ettercollecties of punctievloeistoffen (anaëroben)  vóór transport aanwezige lucht verwijderen  spuit versturen met beschermkapje zonder naald! 43 Transportrecipiënten  steriele flesjes, bekertjes en buisjes  vloeistoffen (sputum, urine,..), weefselmateriaal of ander materiaal (katheter,…)  lekvrij (schroefdop) en steriel  lumbaal vocht: steriel conisch centrifugeerbuisje met schroefdop  faeces: potjes met lepel  Handel verkrijgbaar 44 Transport in voedingsbodems  direct bij afname enten in of op voedingsbodem → Hemoculturen → steriel lichaamsvochten (pleurvocht, ascitesvocht,….) → delicate micro-organismen (gonokokken, Bordetella sp.,…) → rechtstreeks enten: correcte afname-instructies → transport van gekweekte bacteriën (naar referentielabo’s) 45 hemocultuurflessen transportvoedingsbodem 46 2.3. Transportomstandigheden  transport naar microbiologisch labo: zo snel mogelijk  leefbaarheid delicate micro-organismen  overgroei niet-pathogenen/commensalen voorkomen  niet mogelijk? → 4°C (≠ lumbaal vocht en hemoculturen)  steriel, goed gesloten, lekvrij ↔ bijbesmetting (buitenaf en personen) 47 2.4. Soorten microbiologische specimens 2.4.1 Bloed  steriel  bacteriëmie, sepsis → ernstige bedreiging  hemocultuur → afname veneus of arterieel  huid aanprikken → commensalen (CNS,…) → bijbesmetting  onterecht oorzaak van sepsis of bacteriëmie Belangrijk: ontsmetting van huid vóór afname 48 Goede hemocultuurafname  Asepsis (snelwerkend bactericide antisepticum (1%jood in alcohol 70%)  hoeveelheid  30 - 40 mL over 2 sets hemocultuurflessen (2 aërobe en 2 anaërobe)  2 – 5 mL (pediatrische hemocultuurfles)  tijdstip en frequentie  Endocarditis! 3 sets ≠ tijdstippen en langere incubatie 49 BacTalert 50 2.4.2 Punctievloeistoffen  virtuele holten → kleine hoeveelheid steriel vocht  pleura, pericard, gewricht, peritoneum,….  ontstekingsreactie → vasodilatatie → exsudaat → door punctie  ontsteking: infectieus / niet-infectieus  punctie: strenge asepsis (zie afname hemoculturen) 51 2.4.3 Cerebrospinaal vocht (CSV)  hersenen en ruggenmerg → omgeven door steriele vloeistof  lumbaal vocht of cerebrospinaal vocht  glashelder, geen cellen  meningitis: micro-organismen + leucocyten → troebel  2 – 3 mL afname in steriel centrifugeerbuis  afname → zeer strenge asepsis! 52 2.4.4 Weefselmateriaal  weefselstukje (biopsie of operatie) → uitdroging → vochtig  Steriel recipiënt met fysiologisch water  grote weefselstukken  steriele mortier, wit zand en stamper → fijngewreven  steriel bouillon → suspensie opzuigen → steriel buisje → bovenstaande vloeistof = inoculum overblijvende suspensies bewaren op 4°C (bijkomend onderzoek) 53 2.4.5 Etter, wondvocht, klierpunctievocht Etter of pus → ontstekingsreactie → vasodilatatie  plasma, fagocyten, polymorfonucleairen en macrofagen → binnendringen weefsel  fagocytose (opname van bacteriën)  polymorfonucleairen → enzymen → vernietigen organisch materiaal  bij lysis → enzymen komen vrij → lokale vernietiging van weefselcellen Etter of pus = plasma, fagocyten (ettercellen), weefselresten en micro-organismen 54 55  Etter → alle plaatsen waar ontsteking voordoet  oppervlakte van de slijmvliezen  oppervlakte beschadigde huid (brandwonde, verwonding, chirurgie,..)  diepte huid of diepere weefsels (abces)  natuurlijke lichaamsholte: pleuraholte, pericard, gewricht,.. (empyeem)  Open abces (fistel) ↔ gesloten abces  etter collecteren in spuit → bacteriologisch onderzoek → asepsis!  bij vermoeden anaëroben: lucht verwijderen/speciaal transportmedium 56  Wondvocht en etter van slijmvliezen → 2 steriele wissers  één voor cultuur  één voor microscopisch onderzoek 2.4.6 Keel-en neusspecimens (bovenste luchtwegen) keelontsteking → wisser voor cultuur (drager MRSA → wisser voor cultuur) sinusitis → punctie (afgesloten sinus) of 2 wissers van gedraineerde sinus 57 2.4.7 Specimens uit de onderste luchtweg Bronchus = luchtwegvertakking  mucus, kleverig slijm (stofdeeltje, bacteriën)  trilhaarepitheel → slijmlaag omhoog → farynx → inslikken, spijverteringskanaal 58 Ontsteking diepere luchtweg: ↑ mucusproductie  “lage luchtweginfectie”: hoestreflex met fluimen  sputum = slijm, fibrine, ettercellen en micro-organismen  viraal = wit (mucoïd), geen bacteriën of ettercellen  bacterieel: fagocyten → geel-groen sputum (purulent) 60 1.Sputum  = vermengd met keelslijm, speeksel, keel-en mondflora  > 25 mondepitheelcellen /microscopisch veld (100x) = speeksel → ongeschikt voor bacteriologisch onderzoek  kwalitatief sputum: talrijke polymorfonucleairen → geschikt voor bacteriologisch onderzoek Ongeschikt staal Geschikt staal 61 2. Tracheale aspiratie  punctie huid en trachea: bijbesmetting mondflora  risico op bloeding 3. Broncho-alveolaire lavage of B.A.L.  brochoscopie: minimale bijbesmetting  hoeveelheid vocht → longblaasjes → opzuigen  kiemen isoleren → uit alveolaire macrofagen (Legionella, Pneumocyctis jirovecii) 4. Endotracheaal aspiraat/Bronchusaspiraat  Bij patienten (beademing) → kiemen onderste luchtwegen 62 5. Tracheostomie-aspiraat  patiënten met tracheostomie → aspiraat bijbesmet  bronchi → snel gekoloniseerd met ≠ micro-organismen  geen criterium: infectie ↔ bijbesmetting 63 6. Geïnduceerd sputum  Inhalatie van vernevelde 10% NaCl-oplossing  Niet spontaan ophoesten sputum  Nuttig → vermoeden infectie mycobacteriën, Pneumocystis jirovecii en fungi 64 2.4.8 Urine  in de blaas = steriel  geloosde urine = steeds bijbesmet → maatregelen:  wassen  “midstream” urine  Urine na losing → snel labo/4°C bewaren  Kwantitatieve kweek: regel van Kass  ≤ 10 000 KVE/mL: bijbesmetting  ≥ 100 000 KVE/mL: significante bacteriurie  tussen 10 000 – 100 000 KVE/mL: twijfel 65 Gesondeerde urine: Niet spontaan/andere diagnostische doeleinden  kans op bijbesmetting (urethrale flora)  kans om patiënt zelf te besmetten  meestal onbetrouwbare stalen Suprapubische punctie  Punctie door de huid in de blaas  Vrij van bijesmetting  kinderen, opsporen van anaëroben  Regel van Kass 66 2.4.9 Faeces  Virussen, bacteriën en parasieten  Verse stoelgang → snel labo/4°C  Parasieten zijn intermittent aanwezig → 2 à 3 aparte stalen 70 Microscopisch onderzoek 72 3.1. Rechtstreeks (vers) onderzoek  onderzoek van ongekleurde preparaten  vorm, beweeglijkheid van bacteriën (parasieten)  gisten en schimmels  leucocyten ≠ epitheelcellen 73 3.2 Gramkleuring  Differentiële kleuring  Verdeelt bacteriën in 2 groepen  Grampositieve bacteriën – Gramnegatieve bacteriën  onderscheid: verschillen in celwandstructuur (gevolgen ABgevoeligheid  kwaliteit preparaat (dun uitstrijkpreparaat)  Kleurautomaten  besparing in tijd en kleurstof 74  Kristalviolet – lugol – alcohol/aceton – safranine/fuchsine  Immersieolie (1000x) Gram positief Gram negatief 75 3.3 Ziehl-Neelsen kleuring – zuurvaste kleuring  Differentiële kleuring  Zuurvaste bacteriën (mycobacteriën, Nocardia) en parasieten  Dikker uitgesmeerd (2 – 3 cm)  Omslachtig en tijdrovend → methode van Kinyoun 76 Ziehl Neelsen kleuring ↔ Kinyoun (zonder verwarming) 77  basisch fuchsine – zure methyleenblauwoplossing  zuurvaste bacillen: rood gekleurd op blauwe achtergrond  immersieolie 1000x 78 3.4 Auraminekleuring  alternatief zuurvaste kleurstof  sneller en vlotter  fluorescentiemicroscoop  auramine – zure alcohol – methyleenblauw  zuurvaste bacillen: fluoresceren (fel geel-groen) op donkere achtergrond  gekleurde preparaten → herkleuren met Kinyounmethode 79 3.5 immunofluorescentietechnieken 3.6 flagellakleuring 3.7 giemsakleuring 80 3.8 calcofluorkleuring  fungi (fungi-FluorTM)  Kleurloze kleurstof → chitine en cellulose → fluoresceert  Pneumocystis jirovecii  methanol (fixatie) – calcofluorkleuring  fluorecentiemicroscoop 81 Pneumocystis jirovecii (vroeger Pneumocystis carinii)  Gist  Longontseking  Immuungecompromiteerde patiënten (HIV, immunosuppressiva)  PCP = Pneumocystitis jirovecii-pneumonie 82 Kweekmethoden 4.1. Isolatiebodems  Isolatie  4 soorten voedingsbodems  universele vaste en vloeibare  selectieve en differentiële  aanrijkingsbodems  specifieke voedingsbodems 84 Universele vaste voedingsbodem  Rijke media  Groei: veel soorten micro-organismen  Bloedagar  rijke basisbodem (TSA, Columbia agar, Mueller-Hinton)  Na sterilisatie en afkoeling tot 56°C → 5% paarden-of schapenbloed = basisbodem voor cultuur van pathologisch specimens 85 Universele vloeibare voedingsbodem  TSB, thiolglycolaat  kleine hoeveelheden → kans geven om te groeien  groter inoculum  identificatie → overenten op vaste voedingsbodem  Thioglycolaat: groei van anaëroben (lage redoxpotentiaal) 86 Selectieve en differentiële voedingsbodem  selectief:  bepaalde groepen groeien, anderen worden onderdrukt  specimens met mengflora  bv. Mac Conkey en MSA  differentieel  differentiatie tussen micro-organismen Mac Conkey: lactose en neutraalrood MSA: mannitol en fenolrood Mac conkey 87 Aanrijkingsbodem  Schaarse pathogenen selecteren en aanrijken uit mengflora ↑  sterk remmende factoren  groeimogelijkheden Seleniet  Voorbeelden:  Seleniet aanrijken Salmonella in faeces  rappaport 88 Specifieke isolatiebodems  Sterke selectiviteit  Slechts één species of genus  Voorbeeld:  Legionella medium  Thayer-Martin-agar (Neisseria)  Karmali agar (Campylobacter sp.)  Löwenstein-Jensen-bodem (Mycobacteriën) 89 4.2. Entingstechnieken  Streepenting of vijfhoekmethode  Wisser: agar → vloeibaar medium  Punctievloeistoffen: vloeibaar → agar 90 4.3. Incubatie-omstandigheden Temperatuur  30°C = fungi  36°C = optimaal  42°C = Campylobacter sp., andere micro-organismen ↓ 91 Omgeving  Aëroob en facultatief anaëroob  sommige micro-organismen: 5% CO2 : eerste isolatie  speciale CO2 broedstoof: bloedagar en chocolade agar  Strict anaëroob: indicator methyleenblauwstrip  Micro-aërofiel: verminderde zuurstofspanning 92 Vragen?