Cultivos Celulares en Biología Molecular y Citogenética (PDF)

2. Cultivos celulares 2. Cultivos celulares La Citogenética es el estudio de los cromosomas y las enfermeda- des relacionadas, causadas por un número o estructura anómalos de aquellos. Normalmente los cromosomas no se pueden ver con el microscopio óptico, pero durante la metafase de la división...

2. Cultivos celulares 2. Cultivos celulares La Citogenética es el estudio de los cromosomas y las enfermeda- des relacionadas, causadas por un número o estructura anómalos de aquellos. Normalmente los cromosomas no se pueden ver con el microscopio óptico, pero durante la metafase de la división celular (mi- tosis) se condensan lo suficiente como para poderse identificarse indi- vidualmente. Para obtener células con sus cromosomas en este estado condensado, se las expone a un inhibidor de la mitosis, que bloquea la formación del huso mitótico y detiene la división celular en la etapa de metafase. Para obtener preparaciones de cromosomas se pueden usar distintos tejidos, como sangre periférica, medula ósea o líquido amniótico. Desde el punto de vista preventivo, los cultivos celulares son conside- rados agentes biológicos según la definición recogida en el párrafo a) del Artículo 2 del Real Decreto 664/1997, de 12 de mayo, sobre la pro- tección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo, en la que se con- sidera «Agentes biológicos [a los] microorganismos, con inclusión de los genéticamente modificados, cultivos celulares y endoparásitos humanos, susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad», y, en el párrafo c) del mismo Artículo, se define «Cultivo celular [como] el resultado del crecimiento in vitro de células obtenidas de organismos multicelulares». De manera que, en actividades que implican uso o ma- nipulación de estos cultivos se deberán adoptar medidas para proteger la salud y seguridad del trabajador y del medio ambiente. 25 Biología molecular y citogenética Tipos de cultivo celular en citogenética: líquido amniótico, 2.1. vellosidad corial y sangre periférica 2. El procedimiento de cultivo celular, ampliando la definición canóni- ca establecida en la legalidad vigente (vid. supr.) se conceptúa como el conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células de organismos pluricelulares in vitro, preservando al máximo sus pro- piedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. En función del grado de preservación de la estructura del tejido u órgano de origen, y de su duración, se puede hablar de diferentes tipos de cultivos: de órganos, explantes, primarios o secundarios, etc. En el cultivo de órganos (organotípico) la arquitectura característica del tejido in vivo se mantiene parcialmente. El órgano se deposita en un medio del que obtiene nutrientes, libera los desechos y conserva su estructura tridimensional. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es una buena réplica del tejido de origen, sin embargo, no permite su propagación pues el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia. Esta imposibilidad de propagación obliga, en cada nuevo proceso, a partir de nuevo material lo que conlleva una elevada heterogeneidad. Cultivo de explantes. Los explantes son fragmentos de tejidos u órga- nos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan las células de la periferia. Cultivo celular primario. Tipo de cultivo más habitual; se puede obtener a partir de explantes primarios o suspensiones de células disgregadas, sea por medios enzimáticos o mecánicos, obteniéndose una mezcla compleja formada por los distintos tipos celulares que constituyen el tejido. También se puede cultivar directamente desde un sujeto a partir de un tipo celular concreto. En estos cultivos se pierden las interaccio- nes célula-célula y las interacciones de la célula con la matriz extra- celular (MEC). Sin embargo, las células son capaces de proliferar y la población celular crece notablemente. Cuando las células ocupan toda la superficie disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En esta etapa, las células establecen contactos entre ellas que inhiben su 26  2. Cultivos celulares proliferación y el crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que trasplantar las células a un nuevo soporte (subcultivo o pase). La suspensión que se obtiene se puede cultivar como monocapa (las células crecen adheridas sobre un soporte sólido ―plástico o vidrio―; es el método usado para la mayoría de células excepto hematopoyé- ticas) o en suspensión en el medio de cultivo (las células se encuen- tran dispersas en el medio de cultivo y su crecimiento no depende del anclaje; este tipo de cultivo se restringe a células hematopoyéticas, células madre, líneas celulares transformadas y células tumorales). Hay que hacer notar que, en todo tejido, existe una fracción celular capaz de crecer en suspensión. A pesar de que su origen no está claro se cree que se trata de células madre indiferenciadas. Concepto de subcultivo: las células del cultivo primario, en monocapa, se dispersan por métodos enzimáticos y se pasan a un nuevo frasco de cultivo. En el caso de células en suspensión, sencillamente se diluyen en medio fresco. Los sucesivos cultivos así formados se denominan línea celular. La formación de una línea celular a partir de un cultivo primario hace que aumente el número de células obtenidas de forma que acaban predominando uno o dos tipos celulares (los que tienen mayor tasa de crecimiento); así, la población celular se hace uniforme y homogénea y sus características se conservan durante sucesivas generaciones (si se introducen en nitrógeno líquido, lo hacen de forma indefinida). Normalmente, las líneas celulares tienen una vida finita que, según el tipo de célula, se puede prolongar entre 20 y 100 generaciones. Superado ese límite, las células entran en una etapa que se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar (supues- tamente por acortamiento de los telómeros) y mueren. Sin embargo, algunas células (como las tumorales) evitan este proceso y dan lugar a líneas celulares continuas, que crecen indefinidamente. Estas células pueden surgir de forma espontánea (exposición a radiaciones ionizan- tes o a carcinógenos químicos) o inducida (infección vírica o transfec- ción de ADN) y son el resultado de un cambio genotípico denominado transformación. Las células transformadas se caracterizan por ser inmortales; por su crecimiento aberrante: se pierde la inhibición por contacto, la limitación de la densidad celular durante la proliferación y la dependencia del 27 Biología molecular y citogenética anclaje; por ser malignas: invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores y genéticamente inestables: son aneuploides (varía el número de cromosomas) y presentar aberraciones cromosómicas. Las líneas celulares que nunca se convierten en estables se mantienen euploides. 2.1.1. Recolección de muestras para obtención de cultivos celulares La recolección de muestras constituye un paso muy importante en la obtención de preparaciones de alta calidad. Implica, generalmente, la exposición de las células a una disolución hipotónica, seguida de una serie de disoluciones fijadoras. Esto hace que las células se expandan, de modo que los cromosomas se extiendan y puedan examinarse individualmente. En el ámbito de la Citogenética posnatal, la muestra de elección es la sangre periférica y las células más empleadas para extraer ADN genómico son las nucleadas (leucocitos), ya que son las de más fácil acceso y proporcionan ADN abundante y de alta calidad. De prefe- rencia, la sangre ha de ser total y sin coagular (5-10 mL en un tubo con heparina sódica al 1%, sin conservantes). En realidad, la cantidad necesaria de ADN para realizar estudios genéticos es muy pequeña y con unos pocos microgramos se pueden realizar multitud de estudios, como los de secuenciación o de polimorfismos de un solo nucleóti- do (SNPs). No obstante, si lo que se quiere es dejar ADN para estudios posteriores, se debe recomendar extraer 10 mL como cantidad míni- ma. El paciente, o donante, no tiene que estar en ayunas y no necesita ningún tratamiento previo. Por último, se debe etiquetar perfectamente el tubo e identificarlo. Los hemocultivos periféricos, para obtener mejores resultados, deben prepararse dentro de las 24 horas posteriores a la recolección. Han de evitarse temperaturas extremas si las muestras se transportan o almacenan. Generalmente deben conservarse a temperatura ambiente o refrigerarse por encima de 4°C hasta su procesamiento. A veces, se añade medio de cultivo a muestras de sangre pequeñas, ya que tienden a secarse, especialmente si se recogen en recipientes grandes. 28  2. Cultivos celulares En el diagnóstico citogenético prenatal las muestras se obtienen a partir del líquido amniótico mediante amniocentesis. Esta se realiza, generalmente, entre las semanas 15-18, ya que antes de las 15 sema- nas no supone una alternativa segura, debido al aumento del riesgo de aborto. Deben obtenerse de 15-30 mL de líquido en condiciones estériles y recogerse en un recipiente estéril, apropiado para cultivo celular (en las amniocentesis realizadas antes de las 15 semanas, gene- ralmente se extrae 1 mL de líquido por cada semana de gestación). La parte inicial de la muestra es la que tiene más probabilidades de estar contaminada con células maternas y no debe enviarse a citogenética. Las muestras han de transportarse a temperatura ambiente, evitando temperaturas extremas y tiempos de transporte prolongados. Esta téc- nica, no obstante, presenta un riesgo real, aunque pequeño, de aborto espontáneo y no debe repetirse a menos que sea absolutamente necesario. Se debe hacer todo lo posible por recuperar las muestras recolectadas o manipuladas incorrectamente para disminuir la necesi- dad de repetir el procedimiento. Una alternativa a la amniocentesis es la biopsia de vellosidades co- riales (BVC), técnica invasiva que se realiza entre las 11-13 semanas de gestación. Estas vellosidades poseen la misma constitución genética que el feto, reflejando, por tanto, la situación cromosómica, bioquímica y genética del mismo. La primera BVC, realizada al final de la década de los 60 del siglo XX, se hizo mediante histeroscopia. En la década si- guiente (1975) se llevó a cabo vía transcervical. Y, en los 80, se introdujo la guía ecográfica para la toma de muestra transcervical o transabdo- minal utilizando diferentes tipos de cánulas. El riesgo de aborto para la BVC transabdominal en el primer trimestre es similar que para la amniocentesis en el segundo trimestre; alrededor del 2%. Se indica una BVC cuando existe un alto riesgo de anomalía fetal [ano- malía cromosómica en gestación previa, anomalía cromosómica en uno de los progenitores, edad materna avanzada (≥ 38 años) o anoma- lía fetal ecográfica detectada en el estudio morfológico precoz]. 29 Biología molecular y citogenética 2.1.2. Técnicas de obtención, mantenimiento y proliferación de cultivos La característica fundamental que define un laboratorio de cultivos celulares es el mantenimiento de la asepsia porque la tasa de creci- miento de células en cultivo de mamífero es muy inferior a la de los contaminantes habituales (hongos, levaduras, micoplasmas y bacte- rias); por tanto, para el correcto mantenimiento del cultivo celular se requiere de una técnica experimental que evite la aparición de cualquier microorganismo no deseado. La situación ideal es disponer de una sala aislada del resto de activi- dades, lejos de vías de paso y dedicada exclusivamente al cultivo de células. La aparición de las cabinas de flujo laminar redujo las nece- sidades de aislamiento del área de trabajo, pero, aun así, es recomen- dable mantener un gradiente de esterilidad, desde el medio exterior al interior de las cabinas de flujo, donde se manipularán los cultivos, y de las incubadoras. Hay dos tipos de laboratorios de cultivos celulares, según la patogenici- dad de estos: Laboratorio de cultivo de tejidos sin patógenos. Básicamente es una sala aislada con suministro de aire climatizado y filtrado (HEPA). Esta entrada de aire produce un aumento de presión at- mosférica en el interior del laboratorio (entre 15-20 Pa) que impide la entrada de contaminantes del exterior (sala limpia). Laboratorio de cultivo con patógenos. Para evitar la salida acci- dental de estos, se filtra el aire que sale a través de un filtro HEPA y se genera un déficit de presión en el interior (mínimo -15 Pa). Si se determina que es necesario que el aire que entra sea también filtrado se deberán ajustar los caudales de aire para que el balance neto permita mantener una presión negativa en el interior. Hay que considerar también cualquier otro equipamiento que pueda afectar a este balance (p. ej. vitrinas y cabinas con conexión al exterior). 30  2. Cultivos celulares La función de la cabina de flujo laminar es proporcionar un área libre de partículas y posibles contaminantes para poder trabajar con cultivos en condiciones de asepsia. Debe colocarse en una zona libre, dentro del laboratorio, apartada de puertas y ventanas de tal manera que no sea posible caminar cerca del área de trabajo ni detrás del usuario con objeto de evitar corrientes de aire que puedan provocar introducción de contaminantes. Existen varios tipos de cabinas de bioseguridad II. Los más comunes son A, B1, B2 y B3. Disponen de dos rejillas, una frontal y una trasera. A través de la rejilla frontal es succionado el aire que proviene de la habita- ción y que pasa alrededor del trabajador a una determinada velocidad, aislándolo de los agentes existentes en el interior de la cabina. Como ya se comentó (vid. supr.), cuentan con un filtro HEPA a través del cual se suministra un flujo de aire vertical laminar5 (filtro de suministro) que protege el producto y evita la posibilidad de contaminación cruzada en la superficie de trabajo. Un segundo filtro HEPA, sirve para la salida del aire de la cabina (filtro de extracción). Así, el aire que circula dentro de la cabina está libre de contaminantes y puede ser reciclado. Debido al tamaño relativo de los filtros, aproximadamente el 30% del volumen del aire que circula es extraído de la cabina; el 70% restante es recirculado hacia la zona de trabajo. Es una cabina que se caracteriza por suminis- trar protección al personal, al cultivo del interior y al medio ambiente. En los laboratorios de citogenética se emplea el incubador de CO2, equipo destinado al mantenimiento de los cultivos celulares y que simula las condiciones fisiológicas óptimas mediante la regulación de la temperatura, la humedad relativa y la concentración de CO2 u O2 en su atmósfera interior. De forma general, están configurados con los siguientes valores, aunque pueden variar según el linaje del cultivo celular: Temperatura: 37ºC Concentración de CO2: 5% (v/v) Humedad relativa elevada: evita la evaporación del agua del medio de cultivo. 5 Flujo laminar: la velocidad de cada punto en un fluido ideal es la misma y que cada punto del fluido se mueve en líneas paralelas a la dirección el flujo. 31 Biología molecular y citogenética Otros elementos que forman parte del acervo técnico del laboratorio de cultivos celulares son el microscopio óptico convencional y el in- vertido, así llamado por tener invertidas la posición de la fuente de luz (por encima de la platina) y el revolver de objetivos (por debajo) respec- to de uno convencional. Lo ideal, además, es que esté equipado con un sistema de contraste de fases para facilitar la visualización de las células en crecimiento, ya que son estructuras vivas, transparentes y sin coloración. 2.1.3. Técnicas de sembrado y cultivo celular en el laboratorio de citogenética El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados mediante mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas com- plejas, en el interior de incubadores que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas para el cultivo y sobre soportes ―o reci- pientes― que los contienen y aíslan del exterior (placas Petri, placas multipocillo6, frascos o botellas tipo Roux7 y botellas tipo roller8). Por lo que se considera que el medio de cultivo está formado por cuatro elementos: 1. La naturaleza del sustrato o fase en la que crecen las células. La mayoría de células en cultivo crecen en monocapa, de ahí que, el ma- terial con que se fabrican los recipientes, debe permitir la adhesión de las células, además de ser fácilmente esterilizable y tener una mínima calidad óptica para poder visualizar el cultivo con microscopía. Suele tratarse de vidrio y plásticos desechables (más usados). El cultivo ce- lular en 3D es una técnica en la que las células se comportan de mane- ra más parecida a como lo hacen in vivo. Las tecnologías utilizadas son esponjas y geles (colágeno, gelatina, y laminina), y microportadores. 6 Presentan un número variable de pocillos (de 6 a 96) cubiertos por una tapa no hermética. Útiles para experimentos puntuales simultáneos con distintas líneas celulares o diferentes condiciones de cultivo, pero no aconsejables para el mantenimiento de líneas celulares. 7 Planos con tapón de rosca. Los más habituales tienen una superficie de crecimiento de 25 y 75 cm2. Idóneos para todo tipo de cultivo y mantenimiento de líneas celulares 8 Cilíndricas, con gran superficie de crecimiento. Se incuban sobre rodillos que las hacen girar lentamente, así, las células pueden crecer en toda la superficie interior. 32  2. Cultivos celulares 2. Las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio. En térmi- nos generales, las células cultivadas requieren un entorno estéril y un suministro de nutrientes para su crecimiento. Los medios de cultivo deben ser isotónicos o ligeramente hipotónicos respecto de las célu- las que se cultivan. Además, el entorno de cultivo debe ser estable en términos de pH y temperatura. Componentes básicos de los medios: Sales inorgánicas. Su inclusión ayuda a mantener el equilibrio osmótico de las células y a regular el potencial de membrana al pro- porcionar iones sodio, potasio y calcio. Todos ellos son necesarios para la unión celular y como cofactores enzimáticos. Tampón. La mayoría de las células requieren condiciones de pH en el rango de 7,2-7,4 y un control estrecho del mismo. La regulación del pH se logra, bien mediante un sistema tampón natural donde el CO2 gaseoso está en equilibrio con el contenido de bicarbonato del medio de cultivo; o bien mediante tamponamiento químico (HEPES). Los cultivos que utilizan el sistema bicarbonato / CO2 deben mantener- se en una atmósfera de 5-8% de CO2, generalmente suministrado por la incubadora. HEPES tiene una capacidad amortiguadora superior, pero es relativamente caro y puede ser tóxico para algunos tipos de células en concentraciones elevadas. Los cultivos tamponados con HEPES no requieren atmósfera gaseosa controlada. La mayoría de medios de cultivo comerciales incluyen rojo de fenol como indicador de pH. Por lo general, el medio debe cambiarse si el color se vuelve amarillo (ácido) o púrpura (básico). 33 Biología molecular y citogenética Carbohidratos. Principal fuente de energía. Los más utilizados son glucosa y galactosa, sin embargo, algunos medios contienen mal- tosa o fructosa. Los medios con mayor concentración de azúcares apoyan el crecimiento de una gama más amplia de tipos celulares. Aminoácidos. Los aminoácidos esenciales deben añadirse a los medios, ya que las células no pueden sintetizarlos por sí mismas. La concentración de aminoácidos en el medio de cultivo determina- rá la densidad celular máxima que se puede lograr; es decir, una vez agotados, las células no podrán proliferar. Vitaminas. El suero es una fuente importante de vitaminas en el cultivo. Sin embargo, muchos medios también están enriquecidos con vitaminas, lo que los hace más adecuados para una gama más amplia de líneas celulares. Actúan como precursoras de numerosos cofactores. Las comúnmente utilizadas incluyen riboflavina, tiami- na y biotina. Péptidos y Proteínas. Particularmente importantes en medios sin suero. Las más comunes: albúmina, transferrina y fibronectina. Ácidos grasos y lípidos. Importantes en medios sin suero. Oligoelementos, como zinc, cobre o selenio (ayuda a eliminar las especies reactivas de oxígeno). Antibióticos y antifúngicos. Su adición es esencial para prevenir contaminación por bacterias, levaduras y hongos. Se pueden usar solos o en combinación, pero hay que controlar rigurosamente la concentración final para evitar el daño célular. El suero, mezcla compleja de albúminas, factores de crecimiento e in- hibidores del crecimiento, es probablemente uno de los componentes más importantes del medio de cultivo. El más utilizado es el suero fetal bovino (FBS), aunque existen otros, incluido el suero de ternero recién nacido y el de caballo. Sin embargo, el suero está sujeto a variaciones de un lote a otro, lo que dificulta su estandarización9. También existe 9 Es el principal inconveniente del uso de sueros animales. Para evitarlo y poder estandarizar protocolos experimentales y de producción, se formulan medios libres de suero, reemplazando este por sus principales componentes. 34  2. Cultivos celulares riesgo de contaminación que puede minimizarse obteniendo el suero de una fuente confiable. El suero animal debe usarse, siempre, des- complementado para evitar posibles lisis celulares. El suero puede aumentar la capacidad amortiguadora de cultivos lo que es importantes para células de crecimiento lento o si la densidad de siembra es baja. También ayuda a proteger contra daños mecánicos que pueden ocurrir en cultivos en agitación. Una ventaja adicional es la amplia gama de tipos celulares con los que se puede usar, a pesar de los diferentes requisitos de los distintos cultivos en términos de facto- res de crecimiento. Además, puede neutralizar toxinas. 3. La naturaleza y composición de la fase gaseosa. Los componen- tes de la atmósfera del cultivo son controlados y suministrados por el incubador. En general, la concentración de O2 atmosférico es su- ficiente para cubrir las necesidades de cualquier cultivo. Sin embargo, algunos cultivos de órganos requieren mayor concentración por la mala difusión al interior del órgano. Por otra parte, los incubadores lle- van acopladas botellas de CO2 y un dispositivo que permite controlar su concentración en la atmósfera de incubación. 4. Las condiciones de incubación, especialmente de humedad y tem- peratura. La humedad ambiental debe ser lo suficientemente elevada como para evitar la evaporación del medio de cultivo (causa aumento de concentración de los componentes y la osmolaridad, así como varia- ciones de pH). En cuanto a la temperatura óptima de crecimiento de las células, esta suele ser la misma a la que están sometidas, fisiológi- camente. en sus órganos de procedencia. Así, las células de mamífe- ros crecen bien a 37ºC. En la manipulación de cultivos celulares se realizan, generalmente, las siguientes tareas: Disgregación celular para obtener células en suspensión, que, como ya se ha especificado (vid. supr.) puede realizarse por mé- todos enzimáticos, mecánicos o una combinación de ambos. Sin embargo, debe ser por un tiempo mínimo para evitar dañar o matar las células. Los métodos mecánicos se basan en cortar, picar e incluso triturar suavemente fragmentos de órgano o tejido colocados en una placa de Petri, con tampón o medio de cultivo, en la que se recogen las células disgregadas tras su filtración. Los 35 Biología molecular y citogenética enzimáticos se basan en el tratamiento del tejido con enzimas pro- teolíticas (tripsina, colagenasa, papaína o elastasa) que digieren las proteínas de la MEC, liberando las células. Tras la disgregación se obtiene una compleja mezcla de células en suspensión que se puede usar, directamente, para iniciar un cultivo primario. Sin embargo, en otras ocasiones, interesa seleccionar un tipo celular concreto para cultivarlo. Siembra mediante suspensión o depósito de las células en el medio de cultivo. En condiciones de laboratorio, se puede seguir la evolución del número de células de un cultivo a lo largo del tiempo. Si se representan los resultados obtenidos se obtiene la denomi- nada curva de crecimiento que, con una morfología típicamente sigmoidea, comprende cuatro fases: – Fase de latencia o adaptación, que corresponde a las primeras 24 horas de evolución y comprende el período de fijación al sus- trato e inicio del ciclo celular; no hay crecimiento y el número de células se mantiene constante o puede disminuir ligeramente (concavidad inicial). 36  2. Cultivos celulares – Fase de crecimiento exponencial. Dura unos 8 días y durante su desarrollo, el número de células se duplica aproximadamente cada 24 horas hasta alcanzar un máximo. – Fase estacionaria. Ocurre a partir de los 10 días, cuando las células del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (en los cultivos en monocapa, por inhibición por contacto; en las sus- pensiones, por consumo del medio) y su número permanece constante. – Fase de senescencia y muerte. Cuando el cultivo se prolonga durante demasiado tiempo, las células entran en una etapa de senescencia que culmina con la muerte de las mismas. Los cultivos primarios de muchos tipos celulares son posibles por- que las células pierden algunas de sus propiedades diferenciadas, entre ellas la incapacidad de dividirse. Esta pérdida puede deberse a desdiferenciación o a desadaptación. La desdiferenciación implica una pérdida irreversible de una propiedad diferencial del tipo celular. En la desadaptación, la pérdida no es irreversible ya que se debe a la ausencia de algún tipo de señal (hormonal, nerviosa, etc.) y basta con recuperarla para que la característica se vuelva a expresar. El crecimiento en monocapa presenta etapas: Adhesión a la superficie. Período en el que las células comienzan su adhesión al soporte. Coincide con período de latencia de la curva. Proliferación y formación de colonias. Una vez que las células se han adherido a la pared del soporte, empiezan a proliferar expan- diéndose por la superficie y formando colonias. Se corresponde con la fase exponencial de la curva. Inhibición por contacto. Cuando las células ocupan toda la super- ficie disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En esta etapa, las células establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferación y el crecimiento se detiene. Da inicio a la fase esta- cionaria de la curva. 37 Biología molecular y citogenética Cuando se alcanza la confluencia en un cultivo, debe pasarse o hacer un subcultivo en una superficie mayor. En el crecimiento en suspensión, también se distinguen etapas: Adaptación al medio de cultivo. Período relativamente corto que, se corresponde con el de latencia de la curva. Proliferación en suspensión. Aumentan su número, mediante cre- cimiento exponencial (fase de crecimiento exponencial de la curva). Inhibición dependiente de la densidad. Cuando el cultivo alcanza un número crítico de células en relación al volumen del medio y los nutrientes que quedan, se produce un fenómeno de inhibición del crecimiento. Se corresponde con la fase estacionaria de la curva. Al igual que ocurría en los cultivos en monocapa, es necesario hacer un pase para que el crecimiento se reanude. 2.1.4. Mantenimiento del cultivo 1. Control periódico microscópico (entre 1 y 3 días). Para ello se re- tiran del incubador y se examinan con un microscopio invertido para observar el crecimiento celular. Las células de los cultivos en mono- capa deben mostrar una morfología adherente (dependiente de la línea celular) y refractar la luz alrededor de su membrana. Las células de los cultivos en suspensión deben mostrar una morfología circular y refrac- tar la luz alrededor de su membrana. Los medios que incluyen rojo fenol deben ser de color rosa / naranja (el color del medio puede cambiar según la concentración de CO2). Un color amarillo pálido indicaría una disminución del pH que, a menudo, se asocia a contaminación. Las células deben desecharse si se des- prenden en grandes cantidades y/o se ven arrugadas o no parecen crecer en absoluto. 38  2. Cultivos celulares 2. Cambio de medio. Operación de mantenimiento más frecuente, cada 2-3 días y siempre que exista cambio de color del medio. Se hace para renovar aquellos nutrientes consumidos por las células y retirar los productos de desecho generados por el metabolismo celular. Una vez cambiado el medio se reanuda la incubación. En cultivos monocapa se retiran 2/3 del medio de cultivo y se susti- tuyen por un medio nuevo. En cultivos en suspensión, se centrifugan a 700-800 rpm, luego se retiran 2/3 del volumen del medio y se sustituye por medio nuevo. 3. Subcultivo o pase. Tras cierto tiempo de cultivo, como ya hemos co- mentado (vid. supr.), los cultivos en monocapa se encuentran en situa- ción de confluencia y los cultivos en suspensión alcanzan la densidad crítica. En ambos casos, se produce una detención del crecimiento y es el momento de realizar un pase o subcultivo. Para ello, en los culti- vos en monocapa, es preciso separar las células entre sí, y del sustrato, manteniendo la viabilidad. Se logra mediante lisis de la malla de proteí- nas que forma la MEC, ya sea por procesos de rascado (scrapping) de la placa, que arrancan las células adheridas; o por métodos que sepa- ran las proteínas de la MEC (es el caso del ácido etilendiaminotetraacé- tico, EDTA, que secuestra los iones de calcio que mantienen la unión) o realizan su proteólisis (fundamentalmente proteasas, como tripsina). En los laboratorios de Citogenética se utiliza, de manera preferente, la tripsinización con una solución de Tripsina/EDTA en tampón fosfato salino, PBS (phosphate buffered saline). En los cultivos en suspensión se realiza un recuento de viables y se cal- cula el factor de dilución necesario para que, la densidad celular, sea la adecuada para reiniciar el proceso. Otra posibilidad es hacer un es- calado del cultivo (scaling-up), es decir, aumentar la escala del mismo. Para ello existen diferentes sistemas como aumentar el tamaño del recipiente de cultivo; así, cada pase se realiza en un recipiente de mayor capacidad que el anterior. 39 Biología molecular y citogenética 2.1.5. Recuento y viabilidad celular Las células se cultivan y mantienen a una apropiada temperatura y mezcla de gases en un incubador. Las condiciones de cultivo varían para cada tipo celular, y, estas variaciones, pueden dar lugar a la expre- sión de diferentes fenotipos. Además de la temperatura y la mezcla de gases, el factor que, de manera más común, varía en cultivos es el medio. Para mantener unas condiciones de cultivo reproducibles entre experi- mentos se recomienda sembrar las células a la misma densidad. Para ello es preciso saber el número de células que existen en suspensión por mililitro y la manera más habitual de hacerlo es el contaje median- te el uso de un hemocitómetro, fundamentalmente una cámara de Neubauer. Se trata de un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a medir. En su parte central presenta una depresión de 0,1 mm respecto a la superficie, que está aislada del resto por dos surcos laterales y dividida en dos partes (superior / inferior) por un surco horizontal central. Cada una de las depresiones, situadas por encima y debajo del surco central, es una cámara de contaje que tiene grabada una cuadrícula. Esta consistente en un cuadrado de 3 x 3 mm con una separación entre dos líneas consecutivas de 0,25 mm. Para recuentos en cultivos se usan los 4 cuadrados de 1 x 1 mm (1 mm2) de las esquinas de la cámara que, a su vez, están subdivididos en 16 cuadrados. Para determinar la viabilidad celular se emplear diferentes métodos, siendo el más común la tinción con un colorante vital como azul de tripán, un coloide que se introduce en el interior de las células que pre- sentan lisis de membrana. De esta manera, las células que aparecen de color azul se consideran no viables, mientras que las blancas, en las que colorante no ha podido entrar por tener su membrana indemne, se considera vivas y viables para cultivo. Una vez diluida la suspensión en una disolución de azul de tripán en PBS, y montado el hemocitómetro, se cargan 10 µl de la suspensión 40  2. Cultivos celulares teñida en cada cámara se puede llevar a cabo el recuento de células blancas (viables) y azules (no viables). Existen otros métodos de determinación de la viabilidad celular más precisos como la tinción con ioduro de propidio, el uso de contadores electrónicos de células (cell counter) o la citometría de flujo. 2.1.6. Conservación de células En el trabajo cotidiano de los laboratorios de Citogenética y Biología Molecular es importante disponer de alícuotas congeladas de las células con el fin de minimizar la acumulación de cambios genéticos en las líneas continuas, evitar la senescencia y la transformación en las líneas finitas, y minimizar la pérdida accidental de una línea por muerte o contaminación. El mejor método de almacenamiento lo constituye la congelación en nitrógeno líquido10. El cultivo debe presentar una viabilidad > 90%, sin signos de contaminación. Una vez que alcanza el 70-80% de confluen- cia (durante la fase exponencial) se procede con las células como si se fuera a realizar un pase. Se suelen someter a tripsinización, tras la cual se retira el medio de cultivo por centrifugación y se sustituye por un volumen apropiado de suero animal con un agente preservante como el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO). La suspensión celular que se obtiene, idealmente de alta concentración celular (una densidad celu- lar aceptable en un medio de congelación es de, aproximadamente, 106 células/ml), debe ser congelada lentamente para evitar la formación de cristales que lisen las células (disminuir 1°C / minuto hasta llegar a -20ºC o -25°C). Posteriormente, cuando alcanzan una temperatura < -50ºC las células se transfieren, de manera rápida al nitrógeno líquido (-196ºC) donde se almacenan durante largos periodos de tiempo (años) 10 El almacenamiento en nitrógeno en fase líquida permite mantener la temperatura de almacenamiento más baja posible con absoluta consistencia, pero requiere el uso de grandes volúmenes de nitrógeno líquido, lo que constituye un potencial peligro. También se han documentado casos de contaminación cruzada por virus a través del nitrógeno líquido. Por estas razones, el almacenamiento a temperaturas tan bajas se realiza, más comúnmente, en nitrógeno en fase de vapor. 41 Biología molecular y citogenética sin deterioro celular apreciable. El almacenamiento a temperaturas de -70ºC a -80ºC también es factible, aunque se detecta deterioro de las células en un período de 6 meses a 2 años. La descongelación de criotubos almacenados ha de llevarse a cabo con la mayor rapidez posible. Para ello, se toma el vial indicado del tan- que de nitrógeno líquido y se somete a un baño a 37ºC en agitación. Luego, se añade la suspensión celular resultante a un tubo Falcon que contiene 5 ml de solución de FBS al 10% en PBS y se centrifuga para eliminar el DMSO. Una vez descartado el sobrenadante, el precipitado celular se resuspende en medio de cultivo y se siembra. Cuando las células comienzan su proliferación, se cambia el medio de cultivo para eliminar posibles trazas de DMSO que perjudicarían el cre- cimiento celular. Se realiza retirando el medio primario y sustituyéndolo por el volumen necesario de medio de cultivo fresco precalentado (a 37ºC en un baño o una incubadora). La manipulación de las células durante los procesos de congelación y descongelación conlleva un cierto riesgo de contaminación de las mismas. De manera que, es importante prestar especial atención para evitar errores como tocar las roscas de los tapones de los crioviales/ criotubos, y, tras descongelar en el baño, es imprescindible lavar el ex- terior del tubo con etanol al 70% de forma abundante, antes de trabajar con él. 2.1.7. Contaminaciones Las posibles fuentes de contaminación del cultivo incluyen otras lí- neas celulares, condiciones de laboratorio y personal poco capacitado en áreas como técnicas asépticas o buenas prácticas. Por tanto, el uso de células y reactivos de origen y calidad conocidos, por sí solo, no es garantía suficiente de calidad. El cribado de rutina ayuda a la detección temprana de contaminación, ya que todas las manipulaciones son una fuente potencial de la misma. 42  2. Cultivos celulares Para evitarlo se han de utilizar técnicas que supongan la máxima asep- sia posible, así como esterilización del material y trabajo en ambien- tes estériles (cabina de bioseguridad de flujo laminar). Es conveniente, también, mantener los recipientes abiertos el menor tiempo posible. De igual modo, se usan, como ya hemos visto, sustancias antimicrobia- nas y antifúngicas en el medio, aunque en ocasiones, o no es posible usarlas o bien no son suficientes para prevenir la aparición de microor- ganismos. De hecho, los antibióticos que se añaden a cultivos a corto plazo no son recomendables en cultivos a largo plazo. Si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir. Si se han de tomar mues- tras para su análisis conviene hacerlo en ambiente estéril y, después, limpiar cuidadosamente el área de trabajo, conectar la iluminación UV y eliminarlo por un procedimiento que incluya esterilización. Ante cual- quier duda limpiar con etanol al 70% o flamear el material que pueda estar contaminado si no es reemplazable, o reemplazarlo si es posible. Contaminación bacteriana y fúngica. Resulta evidente a simple vista, de forma típica, como consecuencia del aumento repentino de la turbidez y de un cambio de color del medio de cultivo resultado de una alteración en el pH. El cultivo puede sobrevivir por un corto período de tiempo, pero las células terminarán por morir. Para evi- tarla es necesario extremar las condiciones de esterilidad y realizar controles sobre las soluciones y envases a usar. La observación mi- croscópica diaria de los cultivos garantizará la detección temprana de la contaminación y permitirá que se tomen las medidas ade- cuadas tan pronto como aparezcan los primeros signos. Además, se deben usar pruebas específicas para detección de bacterias como parte de un procedimiento regular de control de calidad. Bacterias y levaduras son más habituales en cultivos a corto plazo; los hongos lo son en cultivos a largo plazo. Contaminación por micoplasmas. Se trata de los procariotas de vida libre más pequeños. Carecen de pared celular y de la capaci- dad de sintetizarla. Tienen un diámetro de 0,3-0,5 µm y se pueden observar como formas filamentosas o agrupados en cocos. Hay 6 especies principales que son contaminantes para cultivo de te- jidos: M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. fermentans, M. hominis y Acholeplasma laylawii. Los cultivos primarios suelen estar libres de micoplasmas, pero muchas de las líneas celulares continuas están infectadas, lo que suele tener su origen en suero animal 43 Biología molecular y citogenética contaminado. Para evitar que la contaminación por micoplasmas se extienda es conveniente eliminar y esterilizar cualquier cultivo positivo tan pronto se detecta. Si el cultivo es importante, se puede intentar su conservación tratándolo con antibióticos o suero inmu- ne antimicoplasma. En cualquier caso, debe aislarse de los demás. Los efectos de la infección por micoplasma son más insidiosos que los de las bacterias u hongos, e inducen alteraciones a largo plazo en los cultivos: – Tasa de crecimiento alterada. – Cambios morfológicos. – Aberraciones cromosómicas. – Alteraciones en el metabolismo de aminoácidos y ácidos nucleicos. Sin embargo, a pesar de estos efectos bien documentados, a menudo no se analiza su presencia. Y, si bien es cierto, que la contaminación por micoplasmas es difícil de detectar (no es tan evidente como la que causan lasa bacterias u hongos) y requiere el uso de técnicas especializadas, en la actualidad existe una varie- dad de kits comerciales disponibles, cuyo rendimiento puede ser extremadamente variable. Es por ello, que se aconseja utilizar una combinación de los mismos. Contaminación por virus. Es un problema grave pues su preven- ción y eliminación es realmente difícil por lo que los sueros deben ser controlados rutinariamente, aunque la validez de estos ensayos es limitada. Por ello la única alternativa es el uso de medios libres de suero. Ello es debido a que, el suero bovino, es una fuente po- tencial de contaminación por el virus de la diarrea viral bovina (BVDV). El uso de un suero infectado conducirá a la contaminación viral de las líneas celulares, lo que puede causar cambios leves en la tasa de crecimiento; pero dado que este virus no es citopático, no se detectarán cambios macroscópicos ni microscópicos en el cultivo. Los virus con un efecto citopático marcado son aquellos que crecen a una baja tasa o en unas pocas células. Los cultivos de células humanas pueden contener virus de la hepatitis B y C, 44  2. Cultivos celulares herpesvirus (VEB, Citomegalovirus, virus del herpes simplex 1 y 2), o virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Algunas líneas celu- lares contienen virus endógenos y secretan partículas o expresan antígenos virales en su superficie. Estas líneas no se consideran contaminadas. 45  2. Cultivos celulares Autoevaluación 1. ¿Qué Ley define el cultivo celular? a. La Constitución Española en su Artículo 2, párrafo primero. b. El RD 664/1997, de 12 de mayo, en su Artículo segundo c. El RD 1277/2003, de 10 de octubre, en su Anexo II d. No se contempla tal definición en la legislación española. 2. ¿A qué se denomina explante? a. Fragmento de un tejido u órgano que se adhiere a una superficie. b. Suspensión de células disgregadas, por medios enzimáticos o mecánicos c. La formación de una línea celular a partir de un cul- tivo primario. d. Al crecimiento aberrante de células transformadas. 3. ¿Qué muestra es de elección en la citogenética pos- natal? a. Líquido cefalorraquídeo b. Líquido amniótico c. Sangre periférica d. Exudados 47 Biología molecular y citogenética 4. ¿Cuáles son las características de una cabina de bio- seguridad de tipo II? a. Contar con un flujo de aire vertical laminar b. Debe colocarse en una zona libre, dentro del labora- torio, apartada de puertas y ventanas. c. Suministra protección al personal, al cultivo y al medio ambiente. d. Todas son correctas 5. ¿Qué componentes son básicos en la formación de un medio de cultivo? a. Buffer que mantenga el pH > 8,4 b. Suero, carbohidratos, sales inorgánicas, aminoáci- dos esenciales, oligoelementos, proteínas y lípidos. c. Vitaminas, bromuro de etidio, carbohidratos, ami- noácidos esenciales, proteínas vegetales, agar-agar y suero. d. A) y c) son correctas. 6. ¿Qué métodos conoce de disgregación celular? a. Monocapa y suspensión b. Formación de colonias y tratamiento con enzimas proteolíticas c. Mecánicos y enzimáticos d. B) y c) son correctas 48  2. Cultivos celulares 7. ¿A qué corresponde la fase estacionaria? a. A las primeras 24 horas de cultivo b. A la duplicación del número de células c. Al cese de la división celular, permaneciendo cons- tante su número. d. Al cese de la división celular y la entrada en la senes- cencia 8. Etapas del crecimiento en suspensión a. Adhesión, proliferación e inhibición por contacto b. Adhesión, proliferación e inhibición dependiente de densidad c. Adaptación, proliferación e inhibición dependiente de densidad d. Adaptación, proliferación e inhibición por contacto 9. ¿Cuál es la operación de mantenimiento del cultivo más frecuente? a. El subcultivo b. El escalado (scaling-up) c. El control microscópico sistemático d. El cambio de medio. 10. ¿Cuál es el mejor método para almacenar las células en un laboratorio de Biología Molecular? a. La solución Tripsina/EDTA en PBS b. La congelación en nitrógeno en fase líquida c. La congelación en nitrógeno en fase de vapor d. Ninguna es correcta 49  2. Cultivos celulares Soluciones 1. b 2. a 3. c 4. d 5. b 6. c 7. c 8. c 9. d 10. c 51