Biología Molecular y Citogenética: Cultivos Celulares (PDF)

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Los cultivos celulares. Técnicas de obtención 8  / 1. Introducción y contextualización práctica 3 / 2. ¿Cómo podemos obtener cromosomas?...

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Los cultivos celulares. Técnicas de obtención 8  / 1. Introducción y contextualización práctica 3 / 2. ¿Cómo podemos obtener cromosomas? 4 / 3. Tipos de cultivos celulares 4 3.1. Cultivos celulares primarios: tipo 5 3.2. Cultivos celulares primarios: muestras 5 / 4. Caso práctico 1: “Diagnóstico citogenético posnatal” 6 / 5. Tipos de técnicas de cultivo celular: técnicas de subcultivo 7 / 6. Procedimientos de conservación de células 7 / 7. Técnicas de sacrificio y recogida celular: disgregación celular 8 / 8. Determinación del número y viabilidad celular 9 8.1. Recuento celular en cámara y contadores electrónicos 9 / 9. Métodos de tinción 10 / 10. Contaminación de cultivos celulares 10 / 11. Caso práctico 2: “Contaminación de los cultivos celulares” 11 / 12. Resumen y resolución del caso práctico de la unidad 11 / 13. Bibliografía 12 © MEDAC 978-84-18864-26-1 Reservados todos los derechos. Queda rigurosamente prohibida, sin la autorización escrita de los titulares del copyright, bajo las sanciones establecidas en las leyes, la reproducción, transmisión y distribución total o parcial de esta obra por cualquier medio o procedimiento, incluidos la reprografía y el tratamiento informático.  Conocer qué son los cultivos celulares. Distinguir entre los diferentes tipos de cultivos celulares. Conocer las características y manejo de cada uno de los diferentes tipos de cultivos celulares. / 1. Introducción y contextualización práctica Realizar cultivos celulares implica preparar el material de estudio para su posterior procesado. Se trata de una parte trascendental en el análisis citogenético que debe realizarse con la mayor seguridad y precisión posible, ya que cualquier error que se genere en las muestras en esta parte del estudio arruinará todo el proceso. Una vez se haya completado con éxito el cultivo celular, se procederá a realizar las diferentes técnicas de análisis cromosómicos para el estudio de anomalías numéricas o estructurales que manifiesten patologías en los diferentes cribados y diagnósticos. A continuación, vamos a plantear un caso práctico a través del cual podremos aproximarnos de forma práctica a la teoría de este tema. Escucha el siguiente audio, donde planteamos la contextualización práctica. Encontrarás su resolución en el apartado «Resumen y resolución del caso Fig. 1. Placas con medios enriquecidos para práctico de la unidad». cultivo celular Audio intro. Contaminación de cultivo celular https://bit.ly/2VX0J89  TEMA 8. LOS CULTIVOS CELULARES. TÉCNICAS DE Biología molecular y citogenética /4 / 2. ¿Cómo podemos obtener cromosomas? Por supuesto, los cromosomas los obtendremos de las células eucariotas. En un laboratorio de análisis clínico o de anatomía patológica de un hospital se estudian muestras humanas, las cuales se prepararán en el laboratorio de citogenética para poder estudiar sus cromosomas. Como ya vimos en unidades anteriores, el ADN se encuentra en el núcleo, formando la cromatina, una compleja asociación de proteínas y ácidos nucleicos que tiene en el núcleo celular una forma dispersada. Al tener forma dispersada, es imposible estudiar estos cromosomas, por lo que tenemos que procurar que las células los condensen y nos los presenten en un formato mucho más compacto y manejable. Es el caso de los cromosomas metafásicos (en la segunda fase mitótica). Para ello, inducimos la mitosis de las células con un mitógeno para, después, detener su ciclo celular con colchicina (entre otros) e hincharlas con una solución hipotónica de cloruro potásico. De esta manera, creamos el momento ideal del ciclo celular para observar los cromosomas y, como las células también están hinchadas, podemos verlos mejor. Fig. 2. Cromosomas en metafaser Sabías que... Para obtener cromosomas, debemos tomar una muestra y llevarla al laboratorio. En este caso, sangre periférica extraída mediante venopunción. / 3. Tipos de cultivos celulares Hay diferentes tipos de cultivos celulares, entre los cuales los cultivos celulares primarios son los más empleados en el laboratorio. Cultivo celular primario Son células disgregadas, es decir, que se han separado o bien unas de otras, o bien del tejido donde estaban contenidas, gracias a procesos mecánicos o enzimáticos, pero sin perder la capacidad de crecer y desarrollarse. Quedan en suspensión y, cuando han crecido lo suficiente y necesitan más espacio (momento que se conoce como confluencia), debemos transferirlas a un nuevo medio, proceso denominado subcultivo o pase. Explantes primarios Son muestras de órganos que se colocan en placa de Petri u otros soportes y se bañan en medio de cultivo. Las células de la periferia del tejido crecen sin problema porque reciben todos los nutrientes necesarios, pudiendo entonces migrar y expandirse, pero no así el resto, que están aisladas del medio de cultivo. Órganos Es similar al explante primario, con el mismo inconveniente del crecimiento celular. La ventaja es que conserva la arquitectura celular del tejido in vivo, pero para cada estudio habitualmente es necesario realizar un nuevo explante.  TEMA 8. LOS CULTIVOS CELULARES. TÉCNICAS DE /5 MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional Cultivos histotípicos y organotípicos Son cultivos que pretenden imitar a los tejidos (histotípicos) de un único tipo celular cuando consiguen una gran densidad celular, o a los órganos (organotípicos) cuando consiguen diferentes tipos celulares que se relacionan entre ellos, imitando a la estructura y función del órgano original. Fig. 3. Diferentes tipos de cultivos celulares. 3.1. Cultivos celulares primarios: tipo Como hemos explicado anteriormente, los cultivos celulares primarios son los más empleados en citogenética. Del mismo modo que existen diferentes cultivos celulares, dentro de los primarios también encontramos distintos tipos, que son: Cultivo en monocapa Las células se disponen sobre el soporte sólido que las contiene. De hecho, es primordial que estén bien adheridas a este medio para proliferar. Se emplea en la mayoría de cultivos salvo en las células sanguíneas. Cultivo en suspensión Al contrario que el anterior, las células se encuentran dispersas en un medio líquido. Empleado en células sanguíneas, tumorales y células madre. Según el tipo de célula estudiada, se precisará un tipo de medio de cultivo u otro. Estos deben llevar factores de crecimiento, antibióticos, nutrientes y estimuladores de la mitosis, es decir, sustancias para provocar su crecimiento y desarrollo. Fig. 4. Diferentes tipos de cultivo celular primario. 3.2. Cultivos celulares primarios: muestras Del mismo modo que los cultivos se pueden disponer de diversas formas, tal como hemos estudiado, también tendremos diferencias importantes en las muestras cuyos cultivos realizaremos. Las tres más empleadas en citogenética son: Sangre periférica Para obtener linfocitos. Consiste en el análisis de células somáticas del cuerpo, es decir, en estudiar el cariotipo de las células que componen nuestro organismo. Una de sus desventajas es que necesitan el empleo de agentes mitógenos pero, a cambio, se realizan en 2-3 días, es decir, a corto plazo.  TEMA 8. LOS CULTIVOS CELULARES. TÉCNICAS DE Biología molecular y citogenética /6 Líquido amniótico En este caso no se precisan mitógenos pero, por el contrario, requieren 2-3 semanas, de modo que son a largo plazo. Biopsia corial Su finalidad es el diagnóstico prenatal precoz mediante el análisis de una muestra procedente de las vellosidades coriónicas, ya que se pueden detectar anomalías antes que en las muestras de líquido amniótico, aunque estas muestras son más limitadas que las otras dos estudiadas, permiten tener mayor margen de maniobra en caso de la necesidad de un aborto. Fig. 5. Diferentes técnicas de tomas de muestras para estudio citogenético. Imagen izquierda: venopunción para toma de sangre periférica. Imagen central: amniocentesis para obtención de líquido amniótico. Imagen derecha: biopsia corial / 4. Caso práctico 1: “Diagnóstico citogenético posnatal” Planteamiento: aunque en los países desarrollados los cribajes prenatales de aneuploidías (alteraciones en el número de cromosomas) están a la orden del día, no siempre se cumplen por parte de todas las gestantes. En múltiples ocasiones, son personas que vienen del extranjero y no han seguido estos protocolos de screening. Otras veces, son personas en riesgo de exclusión social, con situaciones socioeconómicas desfavorables o, simplemente, personas que no muestran interés en estas revisiones obstétricas. En el caso que se plantea, un pediatra detecta que uno de los niños que ha nacido en su guardia presenta algunos rasgos morfológicos que muestran una predisposición a una alteración cromosómica. Nos informan que, por el Fig 6. Bebé con rasgos de Síndrome de Down. motivo que sea, la gestante no ha cumplido con su programa de screening de malformaciones y aneuploidías. Nudo: ¿qué crees que procederá en esta situación? Desenlace: primero hay que confirmar si hay alteración cromosómica. Para ello, se realizará un diagnóstico postnatal. En él, se estudian los cromosomas de pacientes que ya han nacido, independientemente de su edad (aunque son estudios que se realizan habitualmente en gente joven). Hay que realizar una extracción y cultivo de sangre periférica para, posteriormente, realizar el procesamiento necesario y valorar sus cromosomas. Una vez llevado a cabo el procedimiento que nos concierne en este caso, se diagnostica una trisomía del 21 en el niño. Fig 7. Cariotipo de dicho bebé.  TEMA 8. LOS CULTIVOS CELULARES. TÉCNICAS DE /7 MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional / 5. Tipos de técnicas de cultivo celular: técnicas de subcultivo Una vez realizamos un cultivo celular primario, sus células comienzan a proliferar. Llega un momento en el que el soporte en el que se encuentran (el medio de cultivo), se les queda pequeño. Entonces el crecimiento se detiene, ya que las células están en estrecho contacto y no pueden acceder a los recursos del medio de los que precisan. Este momento se denomina confluencia. Al igual que ocurre con las plantas cuando sus raíces ocupan toda la tierra disponible, hay que «trasplantar» estas células, lo que se realiza reubicándolas en un nuevo medio de cultivo, proceso conocido como pase o subcultivo. Para ello, si las células están formando una monocapa, se disgregan y se trasladan a un nuevo soporte con medio de cultivo. En cambio, si se encuentran en suspensión, basta con diluirlas en un nuevo medio de cultivo. De esta manera, permitimos que puedan seguir creciendo. A cada uno de estos nuevos traslados se les conoce como línea celular. Con ellas obtenemos una mayor cantidad de células, aunque es frecuente que predomine la línea celular dominante y que el cultivo sea más cada vez homogéneo en lo que se refiere a sus tipos celulares. Por otra parte, los cultivos seguirán creciendo hasta que se alcance la senescencia, que es el momento en que las células no pueden dividirse más por acortamiento de sus telómeros. Cultivo celular Crecimiento Subcultivo Confluencia Fig. 8. Esquema del proceso de cultivo y subcultivo celulares. Audio 1. Subcultivos https://bit.ly/2KBlxN7 / 6. Procedimientos de conservación de células Una vez tengamos material que no vamos a utilizar en el momento o que, sencillamente, deba almacenarse (como en el caso de las alícuotas), debemos proceder a su conservación. El método más empleado es la criopreservación. Habitualmente, los cultivos celulares se mantienen a – 80º C para conservarse por periodos mayores a 24 horas o a – 20º C si se quieren conservar por menos tiempo. Para preservar las muestras durante largos periodos de tiempo, se congelarán en nitrógeno líquido a -196º C. Para ello, se sustituye el medio de cultivo por un medio de suero que lleva dimetilsulfóxido (DMSO), un crioprotector para las células. Además, es importante que exista una densidad celular concreta para realizar la criopreservación, concretamente de 1·106 células/ml.  TEMA 8. LOS CULTIVOS CELULARES. TÉCNICAS DE Biología molecular y citogenética /8 Por supuesto, cada muestra que se criopreserva debe ir bien etiquetada, de tal manera que sea fácilmente identificable. Si es un subcultivo, debemos indicar el número de subcultivo al que corresponde, la fecha en que se ha conservado y otros detalles que se considere necesario aportar en relación a las técnicas realizadas. Posteriormente, es importante que la descongelación se realice siguiendo Fig. 9. Tanque de criopreservación con protocolos estrictos para que no suponga un riesgo para las células del cultivo. nitrógeno líquido / 7. Técnicas de sacrificio y recogida celular: disgregación celular Se trata de separar las células entre ellas y también de la matriz del tejido al que están unidas. Las células sanguíneas y de líquidos biológicos ya se encuentran dispersas y no precisan disgregación, pero el resto de muestras normalmente contienen células inmersas en tejido conjuntivo o unidas entre ellas, por eso es necesario procesarlas de esta manera. Esta técnica se puede realizar por medio de tres métodos diferentes, y lo más habitual es que se combinen varios de ellos. Estos son: Métodos mecánicos Sencillamente, se destruyen y raspan los tejidos para que se liberen las diferentes células de la matriz que las contiene. No es el método más eficiente. Métodos químicos Su objetivo es evitar el correcto funcionamiento de las moléculas de adhesión celular (integrinas y cadherinas), que necesitan cationes (iones positivos) para ser efectivas. Las muestras se tratan con quelantes como el EDTA («secuestran» los cationes para que las moléculas de adhesión sean afuncionales). Métodos enzimáticos Muy empleado y efectivo. Emplea enzimas proteolíticas (que digieren proteínas) que deshacen las proteínas que mantienen las células adheridas a la matriz celular. Por supuesto, según el tejido, se emplearán unas enzimas u otras. Es muy común llevar a cabo el proceso de tripsinización que emplea la enzima tripsina. Fig. 10. Esquema de las principales uniones intercelulares.  TEMA 8. LOS CULTIVOS CELULARES. TÉCNICAS DE /9 MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional / 8. Determinación del número y viabilidad celular Es fundamental averiguar si las células son o no viables, es decir, comprobar qué células están vivas y cuáles muertas. El procedimiento es muy sencillo: basta con realizar una tinción vital. Consiste en un proceso donde el colorante tiñe las células que están muertas y deja intactas las que están vivas, que se verán blancas o incoloras. El azul tripán es un colorante muy empleado en este proceso. Posteriormente, se cuenta el número de células viables y no viables por unidad de volumen, habitualmente por mL, en un hemocitómetro, entre los cuales el más empleado es la cámara de Neubauer. Este instrumento es similar a un portaobjetos, pero está graduado para contar las células en cuadrículas de mm2, poder averiguar la densidad citológica por mm2 y después trasladar los resultados a su equivalente en unidad de volumen. Existen otras técnicas para determinar el número de células, pero esta es la que más se utiliza entre los instrumentos manuales. Estudiaremos esta técnica en el siguiente apartado de la unidad. Fig. 11. Tinción con azul tripán donde se Por otra parte, cabe destacar que existe también una gran variedad de observan células teñidas (no viables) y células aparatos electrónicos para el contaje celular. incoloras (viables) 8.1. Recuento celular en cámara y contadores electrónicos El recuento celular que hemos visto en el apartado anterior puede realizarse de dos maneras: en contadores electrónicos, que realizan el recuento atendiendo a diferentes propiedades físico-químicas de las células, tales como su densidad, su resistencia al paso de una corriente eléctrica o su absorbancia en espectrofotometría; o manual en hemocitómetros, como la ya mencionada cámara de Neubauer. La cámara de Neubauer funciona de la siguiente manera: el recuento puede hacerse en el cuadrado central o en los cuatro cuadrados de las esquinas. Hay que tener en cuenta que la muestra, una vez puesto el cubreobjetos, queda hundida a 0’1 mm; si a esto le sumamos que cada uno de los 5 cuadrados mencionados tiene unas dimensiones de 1 mm x 1 mm, nos deja un volumen en cada cuadrado de 0’1 mm3, que equivale a 0’1 microlitros o 10-4 mL. Si empleamos el cuadrado central, solo tendremos que contar todas las células que tengamos y multiplicarlo por 10.000 (para pasar el número de células de 0,1 microlitro a 1 mL). Si contamos los cuatro cuadrados de las esquinas, entonces podemos hallar la densidad celular dividiendo el número de células contadas en los cuatro cuadrados entre 4 y, a continuación, multiplicándolo de nuevo por 10.000, ya que son cuatro áreas donde hemos contado, cada una de las cuales tiene 0,1 microlitro de volumen, siendo 1 mililitro 10.000 veces mayor. Por último, si la densidad celular de la muestra es muy elevada, se debe hacer una dilución y multiplicar el resultado anterior por el factor de dilución. Fig. 12. Cámara de recuento celular tipo Neubauer. Enlaces de interés... En el siguiente video podrás ver cómo se realiza el recuento de células en cámara de Neubauer. https://www.youtube.com/ watch?v=G0wmfyn3hqA  TEMA 8. LOS CULTIVOS CELULARES. TÉCNICAS DE Biología molecular y citogenética / 10 / 9. Métodos de tinción La tinción es una de las técnicas más empleadas en los laboratorios. Esta pone de manifiesto estructuras celulares que se adhieren a un colorante. De esta manera, las células, que de otra forma son incoloras, toman el color de aquellas sustancias que son afines a las estructuras correspondientes. Los colorantes, según su afinidad, los podemos clasificar en: Ácidos: con apetencia por estructuras básicas, como proteínas del citoplasma. Un ejemplo de este tipo es la eosina. Básicos: con apetencia por estructuras ácidas, como el ADN del núcleo. Un ejemplo de este tipo es la hematoxilina. Neutros: tiñen estructuras tanto básicas como ácidas. Un ejemplo de este tipo es el azul de metileno. Indiferentes o hidrofóbicos: del mismo modo que los anteriores se unían por interacciones electrostáticas, estos sencillamente se disuelven en los tejidos como, por ejemplo, en las grasas. Es el caso del Sudán III. Existen otras tinciones que se emplean para teñir estructuras o tejidos concretos, como puede ser la tinción de PAS para mucopolisacáridos o las tinciones con nitrato de plata para tejidos específicos como el sistema nervioso. En el laboratorio de biología molecular y citogenética un colorante muy empleado es el azul tripán, que hemos estudiado en el apartado 8, para valorar la viabilidad celular. En este caso, el colorante penetra en las células muertas, cuya membrana Fig. 13. Corte histológico de cerebro teñido con permite su paso y las colorea, dejando a las vivas incoloras. nitrato de plata / 10. Contaminación de cultivos celulares Ya hemos hablado de la importancia que tienen las medidas de higiene en los laboratorios de citogenética y cultivos celulares. Esto se debe a que los cultivos son muy fácilmente contaminables, lo cual nos puede obligar a descartarlos y a tener que realizarlos de nuevo. Así, es responsabilidad de los trabajadores del laboratorio asegurar que el riesgo de contaminación sea mínimo, para evitar perder tiempo y material de trabajo. Los contaminantes más característicos son: Bacterias: se detectan muy bien al microscopio, ya que se aprecian cocos, bacilos, etc. y, además, generan otros cambios como turbidez o alteraciones del pH. Levaduras: también son muy fáciles de ver al microscopio, donde las podemos distinguir por tener forma ovalada o redonda; producen turbidez y alteran el pH, alcalinizándolo. Mohos: se detectan muy bien al microscopio o, incluso, a simple vista. Fig. 14. Cultivos celulares contaminados por Forman estructuras filiformes, es decir, con forma de filamentos alargados. bacterias  TEMA 8. LOS CULTIVOS CELULARES. TÉCNICAS DE / 11 MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional Micoplasma: no son fáciles de detectar, no generan cambios de pH, ni turbidez, aunque se pueden ver gránulos oscuros en los citoplasmas. Normalmente se detectan por fluorescencia o técnicas de biología molecular como PCR o marcaje con sonda de ADN ribosomal de micoplasma. Virus: también son muy difíciles de detectar sin tener que recurrir a técnicas de biología molecular, aunque pueden producir signos característicos en las Fig. 15. Cultivos celulares contaminados por células del cultivo, como las inclusiones dentro de núcleo celular. levaduras / 11. Caso práctico 2: “Contaminación de los cultivos celulares” Planteamiento: estamos trabajando en el laboratorio y vemos que, en la sala donde se realizan los cultivos, nuestros compañeros no siempre llevan puesta la mascarilla, a veces trabajan sin la bata y entran a la sala con la misma ropa que traían de la calle. Por la desconfianza que nos genera esto, cogemos algunos de los cultivos que están realizando y los observamos a microscopio. En uno de ellos encontramos la imagen adjunta a la derecha. Nudo: ¿qué ha podido pasar? ¿Qué medidas requiere esta situación ahora? Desenlace: lo que acabamos de ver es una contaminación del cultivo celular por hongos. Se detecta fácilmente porque presentan estructuras características en forma de hilos. Evidentemente, se ha producido un caso de contaminación por no seguir las medidas de seguridad e higiene establecidas. Ahora lo que corresponde es, simplemente, añadir antifúngicos como Fig. 16. Cultivos celulares observados al Anfotericina B o Nistatina e intentar «limpiar» el cultivo para no tener microscopio. La flecha amarilla señala unas que repetirlo. estructuras sospechosas / 12. Resumen y resolución del caso práctico de la unidad Los cultivos celulares pueden provenir de diferentes muestras, ya sean órganos, tejidos o suspensiones celulares, entre los cuales estos últimos son los más empleados. Para el diagnóstico prenatal emplearemos muestras de líquido amniótico o de una biopsia corial, mientras que para el postnatal podemos emplear sangre periférica. Los cultivos celulares primarios se pueden realizar en monocapa o en suspensión, y cuando ya no disponen del suficiente espacio para crecer, deben trasladarse a un nuevo cultivo, pasando a denominarse líneas celulares. Para la disgregación de las células, cuando están unidas entre ellas o a la matriz del tejido del cual provienen, se emplean métodos mecánicos, químicos o enzimáticos. Si no vamos a trabajar con los cultivos, deben refrigerarse a temperaturas de – 20º C a – 80º C, dependiendo del tiempo que necesitemos preservarlos. Para preservar las muestras durante largos periodos de tiempo, se congelarán en nitrógeno líquido a -196º C. Otro aspecto fundamental es evitar la contaminación de las muestras (que fácilmente pueden colonizarse por bacterias, hongos y virus), estudiar la viabilidad de los cultivos con la tinción azul tripán y hacer recuento de células viables en contadores electrónicos o hemocitómetros, como la cámara de Neubauer.  TEMA 8. LOS CULTIVOS CELULARES. TÉCNICAS DE Biología molecular y citogenética / 12 A continuación, podemos ver el esquema-resumen del tema. Cultivos celulares Tipos Crecimiento Conservación Recuento y viabilidad Contaminación Órganos Confluencia cuando - 20º C para 24 h Bacterias y hongos: Organotípicos e microscopio, turbidez histotípicos y cambios en el pH Cultivos celulares Monocapa Mycoplasma y primarios virus: técnicas de biología molecular y fluorescencia Suspensión (Mycoplasma) Fig. 17. Esquema resumen del tema Resolución del caso práctico de la unidad En este caso, nos encontramos con una contaminación del cultivo debida a una mala técnica aséptica. Estos gránulos en los citoplasmas sugieren una posible infección por Mycoplasma, por lo que deberemos confirmarlo mediante técnicas específicas, ya que no muestra signos tan evidentes como la turbidez o la alteración del pH. Por ello, realizaremos tinciones fluorescentes o técnicas de biología molecular, como la PCR, principalmente. / 13. Bibliografía Academia AMIR. (2019). Manual de Ginecología y Obstetricia. 12ª Edición. 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