Tema 3: Cultivos Celulares PDF

Tema 3 Cultivos celulares Contenidos 1. Introducción 2. Biología de las células en cultivo 3. Factores que intervienen en el cultivo 4. Procedimientos de cultivo celular 5. Contaminaciones 1. Introducción ⚫ Def.: el cultivo celular es el conjunto de procedimientos que hacen posibl...

Tema 3 Cultivos celulares Contenidos 1. Introducción 2. Biología de las células en cultivo 3. Factores que intervienen en el cultivo 4. Procedimientos de cultivo celular 5. Contaminaciones 1. Introducción ⚫ Def.: el cultivo celular es el conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células vivas in vitro. ⚫ Para realizar cultivos celulares, se necesita un laboratorio de cultivos con los siguientes equipos: ◦ Campanas de flujo laminar ◦ Incubadores de CO2 ◦ Microscopio invertido ◦ Depósito de N líquido (-200ºC) ◦ Neveras (4ºC) y congeladores (-20ºC y -80ºC). ◦ Equipo de esterilización (autoclave, sistema de filtración, luz UV) ◦ Otros: contadores, pHmetro, placa calefactora, pipeta automática…  m encubadora a in 37º de tener p una humedad de 80 para b arriba m in misterfrosti, fl utilizado para cngelar hasta -80  1.micropipetas,diferentes volumenes de 0.5 a 10,etc cada micropipeta tienen diferentes -bomba de va dor medidas 2. pipeta multicanal tiene una pun tico desechable erar, para que auto clavar, ra de 37º se llena agua c a alta presion la para esterilizar 1. Introducción 1.1.Tipos de cultivos celulares ⚫ Existen tres tipos de cultivo: 1. Cultivo de órganos (o fragmentos de órganos) 2. Cultivo de tejidos 3. Cultivo de células l 1. Introducción 1.1.Tipos de cultivos celulares 1. Cultivo de órganos (o fragmentos de órganos) Se originan a partir de un fragmento de un órgano, de tal modo que los tejidos retienen parte de las características histológicas del tejido in vivo o todas sus características. Aplicación: estudio de interacciones y relaciones intercelulares, respuestas globales a estímulos, estudios regenerativos, etc. El fragmento de órgano se mantiene en la interfase entre el medio de cultivo y una atmósfera controlada. 1. Introducción 1.1.Tipos de cultivos celulares 2. Cultivo de explantes (fragmentos de tejido) En este caso, los fragmentos de tejido se adhieren a una superficie y se les añade el medio de cultivo apropiado. 1. Introducción 1.1.Tipos de cultivos celulares 3. Cultivo de células Se introduce la suspensión de células en un recipiente con medio de cultivo y se incuban en las condiciones óptimas para que proliferen (crezcan y se multipliquen). Es el cultivo más habitual y tiene múltiples aplicaciones: Investigación básica: estudio del metabolismo celular o interacciones celulares. Investigación aplicada: producción de anticuerpos, vacunas, fármacos, estudios de toxicidad, estudios con células madre para terapia celular, ingeniería y producción de tejidos y órganos invitro… ⚫ Hay dos tipos de cultivos celulares, dependiendo de su procedencia: ◦ Cultivo celular primario: se obtiene directamente a partir de un tejido, disgregando sus células. Normalmente, hay varios tipos de células. Ejemplo: Cultivo de vellosidades coriónicas ◦ Cultivo celular secundario: se obtiene a partir de un cultivo primario o de otro secundario, mediante un subcultivo o “pase”. Normalmente hay un único tipo de células. 2. Biología de las células en cultivo 2.1. La curva de crecimiento Una vez hemos añadido el medio de cultivo apropiado a las células, se introducen en un frasco de cultivo y se incuban en condiciones óptimas. El crecimiento de células sigue una dinámica concreta → Curva de crecimiento (nº de células vs tiempo en días): Fases de la curva sigmoide: 2 1. Fase de latencia 2. Fase exponencial 3 3. Fase estacionaria 1 1. Fase de latencia (primeras 24h): las células se acostumbran al medio y no se produce crecimiento → El nº de células se mantiene constante o incluso puede disminuir. 1. Fase exponencial (6-7 días): una vez acostumbradas al medio, las células crecen y se dividen → El nº de células aumenta de manera exponencial hasta llegar a un máximo. 1. Fase estacionaria: el medio no admite más células, por lo que no pueden seguir creciendo y dividiéndose (pero se mantienen vivas) → El nº de células se mantiene constante. 2. Biología de las células en cultivo 2.2. Formas de crecimiento Las células pueden crecer de dos formas distintas: 1. Crecimiento en monocapa ◦ Para células que necesitan adherirse a una superficie sólida para crecer → La mayoría. Adhesión, proliferación y formación de colonias, inhibición por contacto… cuando mueren 2. Crecimiento en suspensión ◦ Para células que no necesitan adherirse → Células sanguíneas, células madre… Adaptación, proliferación en suspensión, inhibición por densidad… En suspensión Monocapa 2. Biología de las células en cultivo 2.2. Formas de crecimiento Las células pueden crecer de dos formas distintas: 1. Crecimiento en monocapa ◦ Para células que necesitan adherirse a una superficie sólida para crecer → La mayoría 2. Crecimiento en suspensión ◦ Para células que no necesitan adherirse → Células sanguíneas, células madre… En los dos casos, llega un momento en el que se inhibe el crecimiento (fase estacionaria). Para reanudar su crecimiento, realizamos un subcultivo o pase → Coger parte de las células y pasarlas a un nuevo frasco con medio. El pase se realiza al final de la fase exponencial. https://www.youtube.com/watch?v=A3F7HR2iBV8 2. Biología de las células en cultivo 2.3. Comportamiento tras varios pases Tras realizar sucesivos pases, el cultivo celular primario da origen a una línea celular. LÍNEA CELULAR: colonia de células obtenidas tras varios subcultivos o pases a partir de un cultivo primario. Dos tipos de líneas celulares: 1. Líneas celulares primarias: aquellas líneas obtenidas a partir de un cultivo primario y que se mantienen mediante pases durante un tiempo limitado. 2. Líneas celulares continuas: se obtienen a partir de un cultivo primario y se mantienen mediante pases durante un tiempo ilimitado. 2. Biología de las células en cultivo 2.3. Comportamiento tras varios pases Tras realizar sucesivos pases, el cultivo celular primario da origen a una línea celular. 1. LÍNEAS CELULARES PRIMARIAS: aquellas líneas obtenidas a partir de un cultivo primario y que se mantienen mediante pases durante un tiempo limitado. ◦ Tras realizar los 2 o 3 primeros pases, la población se estabiliza (características morfológicas y fisiológicas estables). ◦ Tras un nº determinado de pases (20-100 según el tipo celular), la población entra en senescencia. ⚫ Senescencia: fase en la que las células van perdiendo su capacidad de dividirse y acaban muriendo. ◦ La senescencia ocurre porque los telómeros se acortan y se acumulan anomalías genéticas. ◦ Es posible conservar líneas primarias congelándolas antes de llegar a la senescencia. ◦ Es muy importante anotar el nº de pases que realizamos. 2. Biología de las células en cultivo 2.3. Comportamiento tras varios pases 2. LÍNEAS CELULARES CONTINUAS: se obtienen a partir de un cultivo primario y se mantienen mediante pases durante un tiempo ilimitado (evitan la senescencia). ◦ Tras realizar varios pases, pierden los mecanismos de control de la división celular de forma espontánea o inducida. ◦ Tienen características de células cancerosas: inmortales, pérdida de inhibición por contacto, indiferenciadas… ◦ Ej.: Henrietta Lacks y las células HeLa. 3. Factores que intervienen en el cultivo Es necesario controlar estos factores para que el cultivo se desarrolle adecuadamente: 1. Soporte físico (material, tipo de recipiente, tratamiento de las superficies) 1.1. Tipos de recipientes 1.2. Tratamientos de la superficie del recipiente 1.3. Material 1. Composición y propiedades del medio de cultivo 2.1. Composición del medio de cultivo 2.2. Características fisicoquímicas. 1. Atmósfera gaseosa 1. Condiciones de incubación 4. Procedimientos de cultivo celular ⚫ Los procedimientos que se realizan en los laboratorios de cultivos se pueden clasificar en 6 grupos, según su orden cronológico: 1. Disgregación celular 2. Recuento y viabilidad celular 3. Inicio del cultivo (siembra) 4. Mantenimiento del cultivo 5. Conservación de células 6. Descongelación de células  1. Disgregación celular ⚫ Def.: procedimiento para obtener una suspensión del tipo celular que nos interesa. Para realizar la disgregación existen dos tipos de métodos: https://www.youtube.com/watch?v=QuhvXJKRwWE Métodos mecánicos: consisten en cortar o triturar fragmentos de tejido en una placa con medio, y luego filtrarlos para eliminar restos. Métodos enzimáticos: consisten Tras la disgregación, obtenemos una en tratar el fragmento con enzimas mezcla de varios tipos celulares proteolíticas → Digestión de la matriz extracelular, y posterior Selección de células liberación de las células. 1. Disgregación celular 1. Separar los distintos tipos celulares de un cultivo primario 1. Selección de células: se puede llevar a cabo de dos maneras: ◦ Propiedades específicas: distinta adhesión a sustratos/materiales. ◦ Métodos inmunológicos: uso de anticuerpos que reconocen un tipo concreto de células. CELL SORTING  2. Recuento y viabilidad celular ⚫ Una vez tenemos la suspensión celular, es necesario saber cuántas células hemos obtenido → densidad celular (Nº de células/ml de suspensión). ⚫ Para un recuento, es necesario tener en cuenta el colorante https://www.youtube.com/watch?v=JSscBzEPC5c vital: ◦ El colorante permite distinguir células vivas y muertas. ◦ El colorante más habitual → Tripan azul (Trypan blue): Células muertas: son de color azul, porque el tripan atraviesa la membrana (está rota). Células vivas: son de color blanco, el tripan no puede atravesar la membrana. 2. Recuento y viabilidad celular ⚫ Contaje o recuento: consiste en contar las células viables (blancas) y no viables (azules). ⚫ Se realiza en una cámara de recuento o hemocitómetro → Cámara de Neubauer ¡Hoy en día existen contadores automáticos! https://www.youtube.com/watch?v=pP0xERLUhyc 3. Inicio del cultivo (siembra) ⚫ Antes de sembrar las células, tenemos que tener en cuenta: ◦ Tipo de recipiente que vamos a usar. ◦ Número de células que tenemos en la suspensión. ◦ Número de células que vamos a sembrar. ◦ Medio de cultivo y condiciones que vamos a establecer. ⚫ Procedimiento: 1. Tras contar y realizar los cálculos transferir el volumen de suspensión que tenga el nº de células deseado a un falcon al que hemos añadido previamente medio de cultivo necesario para atemperar. 2. Coger el volumen adecuado de células con medio y sembrarlo sobre el recipiente de cultivo elegido. 3. Incubar el recipiente en un incubador de CO2 en condiciones óptimas 37ºC. 4. Mantenimiento del cultivo ⚫ Tres procedimientos principales: 1. Control periódico microscópico: Cada 1-3 días se observan los cultivos sobre el microscopio invertido. Se observan cambios en la apariencia y crecimiento celular. 2. Cambio de medio: Se realiza para renovar los nutrientes y retirar productos de desecho generados por el metabolismo. Cada 2-3 días o siempre que se observe un cambio de color en el medio por variaciones de PH. MONOCAPA: Se aspiran con pipeta y se cambian 2/3 del volumen del medio para conservar sustancias beneficiosas secretadas por las células. SUSPENSIÓN: se recogen en un falcon de 15 ml el medio con las células, se centrifuga ( 5 min 1500 rpm), se elimina el sobrenadante y se resuspende el pellet en medio freso. 3. Preparación del medio: Coger botella de medio de cultivo ( DMEM,RPMI…) de 500ml Añadir FBS descomplementado (con calor) 10% Añadir antibióticos Pen/Strep 1 /1000 4. Mantenimiento del cultivo 3. Subcultivo o pase: Se realiza cuando los cultivos llegan al final de la fase exponencial aproximadamente 70-80% de confluencia Cultivo Cultivo Cultivo NO CONFLUENTE SUBCONFLUENTE CONFLUENTE 4. Mantenimiento del cultivo 3. Subcultivo o pase: Se realiza cuando los cultivos llegan al final de la fase exponencial https://www.youtube.com/watch?v=A3F7HR2iBV8 ⚫ Procedimiento células en suspensión: 1. Coger una alícuota de células y contaje de células viables y cálculo del factor de dilución necesario para que la densidad celular sea la adecuada para reiniciar el crecimiento. 2. Transferir el volumen de suspensión que tenga el nº de células deseado a una botella o recipiente elegido al que hemos añadido previamente medio de cultivo. 3. Incubar el recipiente en un incubador en condiciones óptimas 37 ºC y 5% CO2. 4. Mantenimiento del cultivo 3. Subcultivo o pase: Como la mayoría de células crecen en monocapa, hay que despegarlas con tripsina. Pase: 1. Aspirar el medio. 2. Lavar con PBS (normalmente dos lavados) 3. Añadir tripsina 3 ml e incubar 37ºC 2-3 min → Para despegar las células.CUIDADO 4. Observar en el microscopio si se han despegado. 5. Inactivar la tripsina con medio cultivo 10 ml. 6. Pasar el contenido del recipiente de cultivo a un falcon 15 ml. 7. Centrifugar (1500 rpm, 5 min) 8. Eliminar sobrenadante y resuspender el pellet células en medio de cultivo. 9. Recuento con la cámara de Neubauer + cálculos. 10. Preparar frascos nuevos con el medio de cultivo necesario. 11. Añadir las células deseadas. 12. Incubar a 37ºC 5% CO2 en el incubador. https://www.youtube.com/watch?v=A3F7HR2iBV8 6. Descongelación de células ⚫ Sacar las células de los congeladores de -80ºC o Nitrógeno líquido y descongelar ligeramente con las manos. ⚫ Pasar las células al baño termostático a 37ºC ⚫ El DMSO ( medio de congelación: Suero Fetal Bovino + DMSO 10%) es un agente crioprotector muy tóxico para las células, y por tanto hay que eliminarlo antes de sembrar las células en la placa. ⚫ Mezclar el medio congelación ( con las células) con medio cultivo atemperado 10 ml y centrifugar 1500 rpm 5 min. ⚫ Eliminar el sobrenadante y resuspender en medio de cultivo y sembrar. https://www.youtube.com/watch?v=jfIlxYLvFKo 5. Conservación de células ⚫ El método más habitual para conservar las células es la congelación. ⚫ Para congelar las células, se añade DMSO (dimetil sulfóxido), un agente crioprotector → ¡Tóxico! Una vez que se añade el DMSO, se congelan inmediatamente con N líquido y se conservan a -80 ºC indefinidamente. ESCRIBIR PROTOCOLO CONGELACIÓN 5. Contaminaciones ⚫ La presencia de microorganismos puede alterar el crecimiento del cultivo. ⚫ Tres grupos de contaminantes: ◦ Bacterias, levaduras y hongos: normalmente por malas prácticas de laboratorio. Es fundamental mantener las normas de limpieza y seguridad del laboratorio: uso de campanas, etanol, rayos UV, etc. ◦ Micoplasmas: provienen de las líneas celulares continuas (a veces las compramos ya contaminadas) o de suero animal. Se recomienda hacer un test de micoplasma al comprar la línea. ◦ Virus: es la contaminación más grave, y proviene normalmente de sueros animales. ⚫ Cuando se encuentra un cultivo contaminado, hay que separarlo inmediatamente del resto, eliminar el cultivo y esterilizarlo. 5. Contaminaciones ⚫ CUIDADOS A TENER EN CUENTA EN EL TRABAJO CON CULTIVOS CELULARES: Uso de antibióticos y antifúngicos en el medio de cultivo Trabajar en condiciones estrictas de asepsia y cabinas de seguridad biológica 2 Especial cuidado en manipulaciones fuera del ambiente estéril como en la observación del cultivo en el microscopio. Limpiar la superficie externa de todos los viales y recipientes que se introduzcan en la cabina de bioseguridad con etanol 70% Utilizar EPIS ( bata esteril sólo para cultivos, guantes y rociarlos con etanol cada manipulación). 6. Aplicaciones del cultivo celular En la investigación aplicada, las técnicas de cultivo celular utilizan en áreas tan diversas como: Virología: Cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas, etc. Biotecnología: producción industrial de fármacos en biorreactores (interferón, insulina, hormona de crecimiento, etc.) Inmunología. Producción de anticuerpos monoclonales, señalización, fenómenos de inflamación. Farmacología: Efecto de diversos fármacos, interacciones con el receptor, fenómenos de resistencia, etc. Ingeniería de tejidos. Producción de tejidos artificiales (piel, cartílagos) para el tratamiento de grandes quemados, injertos o autotransplantes, desdiferenciación y diferenciación inducida, etc. Toxicología: citotoxicidad, mutagénesis, carcinogénesis, etc 6. Aplicaciones del cultivo celular En la investigación básica, permiten estudiar fenómenos complejos como, por ejemplo: La actividad intracelular: transcripción de DNA, síntesis de proteínas, metabolismo energético, ciclo celular, diferenciación, apoptosis, etc. El flujo intracelular de biomoléculas: procesamiento del ARN, el movimiento del ARN desde el núcleo hacia el citoplasma, el movimiento de las proteínas hacia diversos orgánulos, el ensamblaje y desensamblaje de los microtúbulos, etc. Genómica y proteómica: análisis genético, infección, transformación celular, inmortalización, senescencia, expresión génica, rutas metabólicas, etc. Ecología celular: el estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular y de su diferenciación, el estudio de las necesidades nutricionales, la cinética de la población celular, etc. Las interacciones celulares: morfogénesis, proliferación celular, adhesión celular, interacciones con la matriz, invasión celular, etc.