UD4. Cultivo Celular, Técnicas de Diagnóstico (IES Leonardo Da Vinci)

UD4. Técnicas de diagnóstico mediante el uso de cultivos celulares. Módulo de Aplicaciones de Cultivos Celulares Curso de Especialista en Cultivos Celulares IES Leonardo Da Vinci Prof: Verónica Rivero Hernández 1 4.1¿Por qué se emplean técnicas de diag...

UD4. Técnicas de diagnóstico mediante el uso de cultivos celulares. Módulo de Aplicaciones de Cultivos Celulares Curso de Especialista en Cultivos Celulares IES Leonardo Da Vinci Prof: Verónica Rivero Hernández 1 4.1¿Por qué se emplean técnicas de diagnóstico? 4.2 Enfermedades genéticas detectables mediante diagnóstico genético 4.3 Tipos de mutaciones. 4.4 Herencia de enfermedades genéticas: 4.5 Citogenética. 4.5.1 Técnicas de bandeo cromasómico para el diagnóstico genético 4.5.2 Técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH). 4.5.3 Técnica de Bandeo multicolor de alta resolución o High resolution multicolour banding (MCB) 4.5.4 Técnica de Multicolor-FISH (M-FISH) o Spectral Karyotyping (SKY) 4.5.4 Técnica de Hibridación Genómica Comparativa (CGH) 4.5.6 Técnica de Amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples (MLPAL 4.5.7 Técnica de PCR Cuantitativa Fluorescente (QF-PCR) 4.6 Otras técnicas para el diagnóstico genético: Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia 2  Unidad 4. Técnicas de diagnóstico mediante el uso de cultivos celulares Primera parte 4.1 ¿Por qué se emplean técnicas de diagnóstico? 4.2 Enfermedades genéticas detectables mediante diagnóstico genético 4.3 Tipos de mutaciones 4.4 Herencia de enfermedades genéticas 3  4.1 ¿Por qué se emplean técnicas de diagnóstico? Diagnóstico Proceso en el que se identifica una enfermedad, afección o lesión por sus signos y síntomas mediante antecedentes de salud, examen físico y pruebas de diagnóstico clínico. Las técnicas de diagnóstico clínico son procedimientos y métodos para identificarlos signos. Permiten evaluar de forma objetiva enfermedades, condiciones médicas y el estado de salud general de un paciente para realizar diagnósticos precisos como planificar tratamientos efectivos. 4  4.1 ¿Por qué se emplean técnicas de diagnóstico? Técnicas de Diagnóstico Clínico Tipo de Técnica Descripción Ejemplos Análisis de muestras biológicas para evaluar Hemograma completo, Análisis Pruebas de composición química, infecciones y función bioquímicos (glucosa, colesterol, enzimas), Laboratorio orgánica. Pruebas de microbiología Obtención de imágenes internas mediante Diagnóstico por diferentes energías (radiación, ultrasonido, Radiografía, TAC, RMN, Ecografía Imagen RM). Pruebas Evalúan el funcionamiento de órganos o ECG, EEG, Prueba de función pulmonar, Funcionales sistemas específicos. Pruebas de esfuerzo Visualización directa de órganos internos Gastroscopia, Colonoscopia, Broncoscopia, Endoscopia mediante un tubo flexible con cámara. etc Análisis de ADN, ARN o proteínas para Secuenciación de ADN, PCR, Pruebas Genéticas identificar mutaciones y predisposiciones transcriptómica, proteómica, y Moleculares genéticas. metabolómica, Biopsia líquida 5  4.1 ¿Por qué se emplean técnicas de diagnóstico? Diagnóstico Genético En una prueba genética se analiza una muestra de sangre, de piel, de cabello o de otro tejido de una persona a fin de estudiar su ADN, sus cromosomas o proteínas y detectar si existe alguna modificación o mutación asociada a alguna enfermedad genética. Razón para el Diagnóstico Genético Descripción Diagnóstico de Enfermedades Hereditarias Confirmar sospechas clínicas y hacer un diagnóstico definitivo. Identificación de portadores de mutaciones genéticas, especialmente en parejas que desean Detección de Portadores tener hijos. Detección de enfermedades genéticas en el feto mediante análisis de ADN fetal o pruebas Diagnóstico Prenatal invasivas. Diagnóstico Preimplantacional Selección de embriones sin mutaciones específicas en fertilización in vitro. Diagnóstico Presintomático y de Identificación de mutaciones en personas asintomáticas o con riesgo de desarrollar Predisposición enfermedades genéticas complejas. Medicina Personalizada Adaptación de tratamientos según la genética individual. Investigación y Desarrollo Científico Avance en la comprensión de enfermedades y su relación genética. 6  4.2 Enfermedades genéticas detectables mediante diagnóstico genético Una enfermedad hereditaria es aquella que se transmite a través del material genético de padres (o madres) a sus hijos. Puede no manifestarse desde el nacimiento Una enfermedad congénita es aquella que está presente desde el nacimiento del bebé y puede ser transmitida por los progenitores o no. Muchas de estas enfermedades tienen una base genética, pero otras pueden ser debidas a factores ambientales, como la exposición de la madre a ciertos fármacos, sustancias tóxicas o infecciones durante el embarazo. Se calcula que hay 4000 enfermedades congénitas de diferente gravedad. A veces una misma enfermedad puede ser congénita y hereditaria, pero no todas las enfermedades congénitas son hereditarias y viceversa. No todas las enfermedades que son hereditarias se manifiestan en el momento del nacimiento, con lo cual no serían congénitas. No todas las enfermedades que se manifiestan desde el nacimiento son transmitidas por los progenitores a su descendencia, de manera que no sería correcto decir que son hereditarias 7  4.1 ¿Por qué se emplean técnicas de diagnóstico? 1974 Diagnóstico Genético Prenatal 8  Diagnóstico Genético Prenatal 2006 Newborn screening: Toward a uniform screening panel and system 29 enfermedades Indispensables en un cribado neonatal. 9  4.3 Tipos de mutaciones Según el origen: Mutaciones espontáneas. Esto se refiere a la evolución biológica. Por lo regular, son el resultado de procesos biológicos o químicos. Suelen ser el resultado de procesos enzimáticos que se dan durante la replicación del ADN. Mutaciones inducidas. Son causadas por factores externos. Por ejemplo, la radiación, los químicos mutagénicos, entre otros. Mutaciones somáticas y germinales. Afectan al ADN de las células reproductivas, es decir, a los gametos. Las germinales afectan a las células que forman parte del cuerpo, o sea, los autosomas, pero no son heredadas por los descendientes. 10  4.3 Tipos de mutaciones Código Genético REPLICACIÓN 11  4.3 Tipos de mutaciones Según la cantidad de cambios que se realizaron en el material genético, genéticas, cromosómicas y genómicas. 12  Tipos de mutaciones genéticas 4.3 Tipos de mutaciones Tipo de Mutación Descripción Subtipo y Detalles - Transiciones: Cambio de una purina por otra purina o Resumen de una pirimidina por otra pirimidina. - Transversiones: Cambio de una purina por una Alteración de una sola Mutaciones pirimidina o viceversa. base nitrogenada en Puntuales - Silenciosa: No altera el la secuencia de ADN. - De sentido erróneo: Cambia un aminoácido en la proteína. - Sin sentido: Genera un codón de parada prematuro. - Inserción: Adición de una o más bases, que puede Adición o pérdida de causar un cambio en el marco de lectura (frameshift). Mutaciones por una o más bases en la - Deleción: Pérdida de una o más bases, generando un Inserción y secuencia de ADN, frameshift. Deleción pudiendo afectar el - Efecto en Proteínas, normalmente causando una marco de lectura. proteína no funcional o truncada. Expansión anómala Mutaciones de de secuencias cortas - Ejemplos: Expansión de trinucleótidos en enfermedades Expansión de repetidas de como el síndrome del X frágil (repetición de CGG) y la Repeticiones nucleótidos en ciertos enfermedad de Huntington (repetición de CAG). genes. Mutaciones en el ADN Alteran genes críticos para el metabolismo energético, Mutaciones de las mitocondrias, causando enfermedades mitocondriales que afectan Mitocondriales heredado de la principalmente tejidos con alta demanda de energía, 13 madre. como el sistema nervioso y muscular.  4.3 Tipos de mutaciones Tipos de mutaciones cromosómicas Consisten en alteraciones de la secuencia de genes de un cromosoma. Se distinguen cuatro tipos: Deleción: Pérdida de un fragmento de cromosoma. Duplicación: Repetición de un fragmento de cromosoma. Inversión: Cambio de sentido de un fragmento de cromosoma. Translocación: Cambio de posición de un segmento de cromosoma. 14  4.3 Tipos de mutaciones Tipos de mutaciones genómicas Provocan un cambio en la dotación cromosómica, de modo que hay un número distinto de cromosomas en las células. No hay un cambio en el material genético, sino una separación anormal de los cromosomas. Euploidia. Alteración de los cromosomas que afecta a juegos de cromosomas completos. Se producen por la no separación de los cromosomas homólogos durante la meiosis. Aneuploidía. Uno o varios cromosomas resultan afectados, pero no el genoma. Monosomías: Las monosomías se producen cuando falta un cromosoma de una pareja de homólogos (2n-1). Son raras porque tienen efectos letales para sus portadores. La única monosomía viable en los humanos es la del cromosoma X, el síndrome de Turner. Trisomías: Una trisomía es la existencia de un cromosoma extra en un organismo diploide. En lugar de un par homólogo de cromosomas, tiene un triplete (2n + 1 cromosomas). Puede afectar tanto a autosomas como a cromosomas sexuales, siendo más frecuentes y menos graves en estos últimos 15 Resumen Tipo de Mutación Descripción Subtipo y Detalles - Deleciones cromosómicas: Pérdida de un segmento cromosómico grande. Cambios en la estructura - Duplicaciones: Copias adicionales de una región cromosómica. Mutaciones de cromosomas, - Inversiones: Reversión de un segmento dentro del cromosoma. Cromosómicas afectando grandes - Translocaciones: Intercambio de segmentos entre cromosomas no homólogos, segmentos de ADN. que pueden ser equilibradas o no equilibradas. - Euploidia. Alteración de los cromosomas que afecta a juegos de cromosomas completos. Se producen por la no separación de los cromosomas homólogos durante la meiosis. - Aneuploidía. Uno o varios cromosomas resultan afectados, pero no el genoma. Monosomías: Las monosomías se producen cuando falta un cromosoma de una pareja de homólogos (2n-1). Son raras porque tienen efectos letales para sus portadores. La única monosomía viable en los humanos es la del Mutaciones Anomalías en el número cromosoma X, el síndrome de Turner. Genómicas de cromosomas Trisomías: Una trisomía es la existencia de un cromosoma extra en un organismo diploide. En lugar de un par homólogo de cromosomas, tiene un triplete (2n + 1 cromosomas). Puede afectar tanto a autosomas como a cromosomas sexuales, siendo más frecuentes y menos graves en estos últimos 16 17  4.4. Herencia de enfermedades genéticas Herencia Mendeliana La herencia mendeliana se refiere a los patrones de herencia que son característicos de los organismos que se reproducen sexualmente. Gregor Mendel con guisantes, se enfocó en la descripción de dos tipos fundamentales de genes y sus respectivas combinaciones: los genes dominantes y los genes recesivos Hablamos de características discretas o discontinuas, ya que los fenotipos no se sobreponen y podemos clasificarlos 18  Resumen 4.4. Herencia de enfermedades genéticas Tipo de Herencia Descripción Características Principales Ejemplos de Enfermedades - 40% de probabilidad de heredar la Herencia Autosómica La enfermedad se expresa con una sola copia Enfermedad de Huntington, síndrome enfermedad de un progenitor afectado. Dominante mutada del gen. de Marfan, acondroplasia. - Afecta a hombres y mujeres por igual. Se requiere heredar dos copias mutadas del gen - Los portadores no presentan síntomas. Herencia Autosómica Fibrosis quística, anemia de células (una de cada progenitor) para que se exprese la - 24% de probabilidad de que un hijo Recesiva falciformes, fenilcetonuria. enfermedad. herede la enfermedad. - 40% de probabilidad de heredar la La mutación en el cromosoma X puede afectar Herencia Ligada al enfermedad de una madre afectada. Síndrome de Rett, raquitismo tanto a hombres como mujeres, pero los efectos Cromosoma X (Dominante) - Los hombres afectados solo transmiten a hipofosfatémico ligado al X. son más notables en mujeres. sus hijas. - Mujeres portadoras (una sola copia Herencia Ligada al La enfermedad se expresa principalmente en mutada) no tienen síntomas. Hemofilia, distrofia muscular de Cromosoma X (Recesiva) varones, ya que solo tienen un cromosoma X. - Los hombres afectados transmiten a sus Duchenne, daltonismo. hijas. Enfermedades causadas por mutaciones en el Herencia Ligada al - Afecta solo a hombres. Algunas formas de infertilidad cromosoma Y, heredadas exclusivamente de Cromosoma Y - Se transmite de padre a hijo varón. masculina. padre a hijo. - Todos los hijos de una madre afectada La mutación en el ADN mitocondrial se hereda Neuropatía óptica hereditaria de Herencia Mitocondrial heredarán la enfermedad. exclusivamente de la madre. Leber (LHON), síndrome MELAS. - Los hijos varones no la transmiten. - No sigue un patrón mendeliano estricto. La enfermedad se debe a la interacción de varios Diabetes tipo 2, enfermedades Herencia Multifactorial - El riesgo aumenta con factores genéticos genes y factores ambientales. cardiovasculares, algunos cánceres. 19 y ambientales.  4.4. Herencia de enfermedades genéticas  Dominancia incompleta,  Codominancia,  Poligenia, Herencia NO Mendeliana  Alelos múltiples  Alelos letales  Epistasis,  Genes represores Todos ellos influenciados en su expresión por factores ambientales  Genes reguladores  Genes complementarios Existen rasgos que exhiben una amplia gama de expresiones del fenotipo, en forma de series degradadas. Expresividad variable: Para algunos rasgos, es posible que individuos con el mismo genotipo presenten fenotipos diferentes, incluso para características controladas por un único gen. En el caso de individuos con alguna patología genética, cada uno puede tener síntomas únicos, más graves o más leves. Penetrancia incompleta: se refiere a organismos con un genotipo idéntico, pero que pueden desarrollar o no la condición asociada a dicho genotipo. En el caso de la patología genética, los individuos pueden tener los síntomas o nunca desarrollar el trastorno 20  4.4. Herencia de enfermedades genéticas Herencia NO Mendeliana Dominancia incompleta La dominancia incompleta es un tipo de herencia en la cual se observa un fenotipo intermedio en la descendencia. Ningún gen domina por completo al otro, y en su lugar, ambos se expresan simultáneamente, dando lugar a una mezcla de características. Codominancia En este estado heterocigoto no hay gen recesivo y dominante, sino que ambos genes se comportan como dominantes el individuo expresa ambos genotipos parentales. 21  4.4. Herencia de enfermedades genéticas Herencia NO Mendeliana Alelos múltiples Una característica hereditaria es regulada por más de dos alelos. Cuando se manifiestan más de tres fenotipos, dependiendo del número de alelos presentes en la población. Por esta razón sólo se pueden estudiar en poblaciones en donde el número de individuos permite la manifestación de estas características (como los grupos sanguíneos en la población humana). Karl Landsteiner descubrió que los eritrocitos (glóbulos rojos de la sangre), tienen antígenos específicos en su membrana celular y creo el sistema ABO 22  4.4. Herencia de enfermedades genéticas Herencia NO Mendeliana Gen Poligenia Características determinadas por múltiples genes, como la altura y el color de la piel y de ojos en humanos. Gen Pleiotropía: Cuando un gen afecta a múltiples características. El trastorno genético llamado síndrome de Marfan es causado por una mutación en un gen, sin embargo afecta muchos aspectos del crecimiento y desarrollo, que incluyen la altura, la visión y la función cardíaca. 23  4.4. Herencia de enfermedades genéticas Herencia NO Mendeliana Alelos letales recesivos: alelos que impiden la supervivencia cuando son homocigotos. relación de 2:1 y no 3:1 Alelos letales dominantes: Alelos que impiden la supervivencia cuando son heterocigotos. Si un alelo letal dominante permite a una persona sobrevivir hasta la edad reproductiva, podría transmitirlo a sus hijos. Este es el caso en la enfermedad de Huntington. 24  4.4. Herencia de enfermedades genéticas Herencia NO Mendeliana Epistasis: Es una circunstancia en la que la expresión de un gen se ve afectada por la expresión de uno o más genes heredados de forma independiente. Por ejemplo, en el color del pelaje de los perros labradores, un gen puede determinar si el pelaje es negro o marrón, pero otro gen puede enmascarar este efecto y hacer que el pelaje sea amarillo. Genes represores: Estos genes actúan para inhibir la expresión de otros genes. Funcionan como un mecanismo de control para asegurar que ciertos genes se activen solo cuando sean necesarios. Los genes represores son cruciales en procesos como el desarrollo y la diferenciación celular. Genes reguladores: Son genes que controlan la expresión de otros genes. Pueden activar o desactivar genes específicos en respuesta a señales internas o externas. Los genes reguladores juegan un papel fundamental en la regulación de procesos biológicos complejos, como el ciclo celular y la respuesta al estrés. Genes complementarios. Alelos recesivos de dos diferentes genes pueden dar el mismo fenotipo. Ambos genes necesitan trabajar juntos para expresar el rasgo. 25  4.4. Tipos de enfermedades genéticas Haploinsuficiencia: La haploinsuficiencia se produce cuando la pérdida de una copia funcional de un gen resulta en una falta de expresión adecuada del gen. Ejemplos de enfermedades causadas por la haploinsuficiencia incluyen el síndrome de Turner, la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica, el Síndrome de Dravet 26  4.4. Tipos de enfermedades genéticas El mosaicismo y el quimerismo Son condiciones por las cuales una misma persona presenta células con diferente composición genética. Los individuos afectados por estas condiciones se denominan mosaicos y quimeras, respectivamente, y al analizar sus tejidos encontraremos dos o más poblaciones celulares distintas. En la inmensa mayoría de los casos si hay alteraciones cromosómicas son numéricas. Los mosaicos estructurales son muy poco frecuentes. El grado en el cual un individuo resulta afectado clínicamente depende habitualmente del porcentaje de células anormales. 27  4.4. Tipos de enfermedades genéticas Elementos genéticos transponibles Los elementos genéticos transponibles son secuencias de ADN que tienen la propiedad de cambiar de posición dentro del genoma, por tal causa también reciben el nombre de elementos genéticos móviles. Algunos transposones muestran una preferencia por una determinada región (zona de 2000 a 3000 pares de bases), pero dentro de ella parecen insertarse al azar. Por tanto, cuando cambian de posición y abandonan el lugar en el que estaban, en ese sitio, se produce un deleción o pérdida de bases. Si el elemento transponible estaba insertado en el interior de un gen, puede que se recupere la función de dicho gen. https://www.csic.es/es/actualidad-del-csic/la-forma-en-que-unos-genes-saltan-regiones-seguras- del-genoma-podria-mejorar-la-terapia-genica-contra-el-cancer-y-otras-enfermedades 28  Tipo de Enfermedad Descripción Ejemplos Genética - Fibrosis quística (CFTR) - Enfermedad de Huntington (expansión repetida en el gen HTT) Causadas por mutaciones en un solo gen. - Anemia de células falciformes (HBB) Enfermedades Suelen heredarse de forma autosómica dominante, - Distrofia muscular de Duchenne (DMD) Monogénicas autosómica recesiva o ligada al cromosoma X - Síndrome de Marfan (FBN1) - Hemofilia A y B (F8 y F9) - Metabólicas: Fenilcetonuria (PAH), Galactosemia (GALT) - Síndrome de Down (Trisomía 21) Anomalías en el número o estructura de cromosomas. - Síndrome de Turner (44,X) Enfermedades Pueden ser detectadas por estudios de cariotipo o - Síndrome de Klinefelter (47,XXY) Cromosómicas técnicas como la hibridación fluorescente in situ (FISH) - Síndrome de Edwards (Trisomía 18) o la hibridación genómica comparativa (CGH). - Síndrome de Patau (Trisomía 13) Causadas por interacción de múltiples genes y factores - Diabetes tipo 1 y 2 Enfermedades Genéticas ambientales. - Cánceres hereditarios (BRCA1, BRCA2 para cáncer de mama; MLH1, MSH2 Complejas o No siempre se puede predecir la enfermedad, pero para cáncer de colon hereditario no polipósico) Multifactoriales algunos factores de riesgo genético pueden evaluarse - Alzheimer de inicio temprano (APP, PSEN1, PSEN2) mediante pruebas genéticas de susceptibilidad - Cardiopatías hereditarias (MYH7, MYBPC3 en cardiomiopatía hipertrófica) - Neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) Mutaciones en el ADN mitocondrial que afectan el Enfermedades - Síndrome de MELAS (encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y metabolismo energético celular. Mitocondriales accidentes cerebrovasculares) Se heredan exclusivamente de la madre. - Síndrome de Leigh - Síndrome de DiGeorge (deleción 22q11.2) Anomalías Genéticas Anomalías submicroscópicas que no se detectan en el - Síndrome de Prader-Willi y Angelman (alteraciones en 14q11-q13) Estructurales y cariotipo convencional. - Síndrome de Williams-Beuren (deleción 7q11.23) Microdeleciones Detectables mediante CGH o FISH. - Síndrome de Smith-Magenis (deleción 17p11.2) Enfermedades Ligadas a - Síndrome del X frágil (expansión de repeticiones CGG en FMR1) Repetición de Expansiones de tripletes en genes específicos. - Ataxia espinocerebelosa (varios genes con expansión de tripletes) 29 Trinucleótidos - Distrofia miotónica (expansión en DMPK en tipo 1 o CNBP en tipo 2)  Resumen 4.4. Herencia NO MENDELIANA Tipo de Herencia Descripción Características Principales Ejemplos de Enfermedades 30  Unidad 4. Técnicas de diagnóstico mediante el uso de cultivos celulares Segunda parte 4.5 Citogenética. 4.5.1 Técnicas de bandeo cromosómico para el diagnóstico genético 4.5.2 Técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH). 4.5.3 Técnica de Bandeo multicolor de alta resolución o High resolution multicolour banding (MCB) 4.5.4 Técnica de Multicolor-FISH (M-FISH) o Spectral Karyotyping (SKY) 4.5.4 Técnica de Hibridación Genómica Comparativa (CGH) 4.5.6 Técnica de Amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples (MLPAL 4.5.7 Técnica de PCR Cuantitativa Fluorescente (QF-PCR) 4.6 Otras técnicas para el diagnóstico genético: Inmunohistoquímica e Inmunofluorescencia 31 4.5 Citogenética 32  4.5 Citogenética Meiosis: tipo de división celular en los gametos https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Meiosis https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Mitosis 33  4.5 Citogenética Los cromosomas son estructuras complejas ubicadas en el núcleo de las células, compuestos por DNA, histonas y otras proteínas, RNA y polisacáridos. Son básicamente los "paquetes" que contienen el DNA. La heterocromatina a su vez se divide en heterocromatina facultativa, es decir, que puede pasar de heterocromatina a eucromatina y viceversa, y en heterocromatina constitutiva, que está siempre condensada y corresponde al 10-20 % de la heterocromatina total del núcleo. 34  4.5 Citogenética Acceder al siguiente link para ver de forma exhaustiva los tipos de alteraciones cromosómicas https://biomodel.uah.es/citogene/horwitz/cytogen3.htm#IXg4c 35 4.5 Citogenética Cariotipo humano 36 4.5 Citogenética ¿Cuándo es necesario el estudio del cariotipo? 37  Historia de la citogenética  1842: Karl Wilhelm von Nägeli observó “citoblastos transitorios”, después llamados cromosomas.  1874: Eduard Strasburger identificó cromosomas en plantas. En 1979, Walther Flemming lo hizo en animales y acuñó los términos cromatina, profase, metafase, anafase y telofase.  1888: W. Waldeyer acuñó el término cromosoma.  1893: Oscar Hertwig publicó el primer texto de citogenética.  1902: Theodor Boveri y Walter Sutton descubrieron los cromosomas homólogos.  1904: Nettie Stevens identificó el cromosoma Y.  1937: Albert Blakeslee y A. G. Avery detuvieron la metafase con colchicina.  1968: Torbjörn Caspersson y colaboradores describieron las bandas Q. En 1971, Bernard Dutrillaux y Jerome Lejeune describieron las bandas R.  1971: se habló de bandas C en una conferencia sobre nomenclatura de cromosomas humanos.  1974: C. Goodpasture y S. E. Bloom describieron la tinción Ag-NOR.  1979: Jorge Yunis describió los métodos de alta resolución para bandas G.  1986-1988: Daniel Pinkel y Joe Gray desarrollaron la técnica FISH (fluorescent in situ hybridization).  1989: Hermann‐Josef Lüdecke microdisectó cromosomas.  1992: 1992Kallioniemi y col. Publicaron la técnica CGH (Técnica de Hibridación Genómica Comparativa)  1996: Evelyn Schröck y Thomas Ried describieron la técnica SKY o tipificación cariotípica espectral multicromática. 38  Descubrimientos en humanos  1914: Theodor Boveri sugirió que el cáncer podría deberse a cambios cromosómicos. En 1948, Charles E. Ford observó anomalías cromosómicas durante la leucemia.  1922: Theophilus Painter publicó que los humanos tienen 48 cromosomas.  1932: P. J. Waardenburg sugirió, sin probarlo, que el síndrome de Down podía ser el resultado de una aberración cromosómica.  1946: Tjio, Levan, Ford y Hamerton demostraron que las células somáticas humanas normales contienen 46 cromosomas y los gametos 23  1948: Charles E. Ford observó anomalías cromosómicas durante la leucemia.  1949: Jerome Lejeune demostró la presencia de un cromosoma somático adicional en pacientes con el síndrome de Down. También Charles E. Ford refirió que las mujeres con el síndrome de Turner carecen de uno de los dos cromosomas X, mientras que Patricia Jacobs y John Strong descubrieron la presencia de un cromosoma X adicional en los hombres con el síndrome de Klinefelter.  1960: J. A. Böök y Berta Santesson describieron la triploidía, Klaus Patau describió la trisomía 13, y John Edwards describió la trisomía 18.  1969: Herbert Lubs First descubrió el síndrome del cromosoma X frágil. Ese mismo año, comenzó a usarse la amniocentesis para el diagnóstico citogenético. 39  4.5 Citogenética La citogenética es una rama de la genética y la citología que se enfoca en el estudio de los cromosomas, su estructura, función y comportamiento durante la división celular. Este campo combina técnicas de biología molecular y microscopía. Algunos ejemplos de Aplicaciones médicas de la citogenética  Citogenética del cáncer. Las aberraciones cromosómicas y la aneuploidía son frecuentes en tumores. Las translocalizaciones cromosómicas pueden tener efectos carcinogénicos mediante la producción de proteínas de fusión. La citogénetica se emplea para monitorear el progreso de tratamientos contra el cáncer.  Sitios frágiles y fractura de cromosomas. Los sitios frágiles de los cromosomas pueden producir patologías como el síndrome del cromosoma X frágil. La exposición a agentes citotóxicos puede producir fractura de cromosomas. Los portadores de ciertas mutaciones autosómicas carecen de la capacidad de reparar el ADN dañado durante la fractura de cromosomas.  Anomalías numéricas de los cromosomas. El conteo de cromosomas permite diagnosticar trisomías, como la que produce los síndromes de Down, de Edwards y de Patau. También permite diagnosticar los síndromes de Turner y Klinefelter.  En la leucemia mielógena crónica, los glóbulos blancos poseen un “cromosoma Philadelphia”. Este cromosoma anormal es el resultado de la translocalización de los cromosomas 9 y 22. 40 Fuente: https://www.lifeder.com/citogenetica/  4.5 Citogenética Obtención de preparaciones cromosómicas Se pueden usar distintos tejidos para obtener preparaciones de cromosomas; por ejemplo, sangre periférica, medula ósea, fluido amniótico y productos de la concepción. 41  4.5 Citogenética Obtención de preparaciones cromosómicas Aunque las técnicas específicas difieren según cuál sea el tejido, el método básico es: 1) Obtención de la muestra. Adquisición del tejido requerido, almacenándolo en el medio y en viales adecuados. 2) Cultivo. Con la excepción de muestras para algunas técnicas, en general se requiere un período de cultivo de entre un día y varias semanas antes del cosechado para sincronizar las células. 3) Adición de un inhibidor de la mitosis (Colchicina o Colcedid) que bloquea la formación del huso mitótico y detiene la división celular en la etapa de metafase. 4) Recogida de las células y preparación: 1) Solución hipotónica en las células, para que las células se expandan, de modo que los cromosomas se extiendan y puedan examinarse individualmente. 2) Fijación. Se emplea 3:1 metanol-ácido acético para eliminar el agua de las células, endureciendo las membranas y la cromatina para la tinción. 3) Preparación de láminas. Las células fijadas se extienden sobre láminas portaobjeto, tras lo cual son secadas. 42  4.4 Citogenética Obtención de preparaciones cromosómicas Aunque las técnicas específicas difieren según cuál sea el tejido, el método básico es: 5) Tinción de las preparaciones cromosómicas. 6) Tras el análisis al microscopio, se toman imágenes mediante fotografía o por digitalización de imagen computerizada. Al menos 14 o 20 células, con el fin de descartar cualquier mosaicismo clínicamente significativo con un análisis completo de al menos 4 de ellas. 7) Generar el cariotipo disponiendo Los cromosomas en pares de acuerdo con su tamaño y su patrón de bandas,. 8) Durante un análisis completo, cada cromosoma se compara críticamente banda por banda con su homólogo 43 Fuente: https://es.slideshare.net/slideshow/tecnicas-de-bandeo-cromosomico/49471084#9 44 Fuente: https://es.slideshare.net/slideshow/tecnicas-de-bandeo-cromosomico/49471084#9 45  Seguir el link para ver la práctica del studio citogenético https://www.youtube.com/watch?v=aUf0gwlOZL8 https://www.youtube.com/watch?v=y1YTHtIBkAk 46  4.4 Citogenética 4.5.1 Técnicas de bandeo cromosómico para el diagnóstico genético El bandeo de cromosomas consiste en técnicas de tinción que revelan patrones de diferenciación longitudinal (regiones claras y oscuras) que de otra manera no podrían verse. Estos patrones permiten comparar especies diferentes y estudiar cambios evolutivos y patológicos a nivel de cromosomas. Bandas cromosómicas 1. Bandas heterocromáticas: se presentan como bloques discretos. Corresponden a la heterocromatina, la cual contiene secuencias de ADN altamente repetitivas que representan genes convencionales y no se descondensan en la interfase. Bandeo G (Giemsa) 2. Bandas eucromáticas: consisten en una serie de segmentos alternados Bandeo R (Reverse, Giemsa) que resultan o no afectados por la tinción. Estas bandas difieren en Bandeo T (Telomérico), tamaño, formando patrones distintivos característicos de cada par de Bandeo C (Centromérico) cromosomas de una especie, lo que las hace muy útiles para identificar Bandeo Q (Quinacrina) translocalizaciones y rearreglos cromosómicos. Bandas Ag-NOR. 3. NORs: son aquellos segmentos de los cromosomas que contienen cientos o miles de genes del ARN ribosómico. Comúnmente se visualizan como constricciones. 4. Cinetocoros: son los sitios de unión del huso de microtúbulos a los cromosomas. 47  4.5 Citogenética 4.5.1 Técnicas de bandeo cromosómico para el diagnóstico genético Bandeo G (Giemsa)  Fue desarrollado en los años 70. El + usado ahora.  Las bandas G se caracterizan por se  Relativamente ricas en A y T,  replicar su ADN tardíamente durante el período de síntesis,  condensarse tempranamente durante la mitosis  reflejar el patrón cromomérico de los cromosomas meióticos.  Tratamiento previo con tripsina, una enzima que digiere parcialmente las proteínas asociadas al ADN.  Diagnóstico de anomalías cromosómicas, como las deleciones, duplicaciones, translocaciones y inversiones. 48  4.4 Citogenética 4.5.1 Técnicas de bandeo cromosómico para el diagnóstico genético Bandeo Q (Quinacrina)  Utiliza la quinacrina, un colorante fluorescente, para teñir las bandas G (ricas en AT)  Se emplea poco, pero su fiabilidad lo hace útil cuando el material es escaso o difícil de bandear. 49  4.4 Citogenética 4.5.1 Técnicas de bandeo cromosómico para el diagnóstico genético Bandeo C (Centromérico)  Utiliza tratamientos específicos con soluciones ácidas y alcalinas antes de la tinción con Giemsa (depurinización de la cromatina con tratamiento ácido (HCl), desnaturalización del DNA con tratamiento alcalino (BaOH)).  Método de coloración diferencial que tiñe la heterocromatina constitutiva localizada mayoritariamente en los centrómeros.  El bandeo C es útil para identificar variaciones en el número y estructura de los centrómeros, así como para detectar ciertas anomalías cromosómicas. http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext& Técnica "harlequín" pid=S1609-91172014000400003 Leer este artículo  Coloración diferencial de cromátides que permite observar intercambios de cromátides hermanas (SCE, Sister Chromatid Exchange); 50  4.4 Citogenética 4.5.1 Técnicas de bandeo cromosómico para el diagnóstico genético Bandeo R (Reverse)  Las regiones que aparecen oscuras en el bandeo G se tiñen claras en el bandeo R y viceversa. Las bandas R son ricas en CG.  Se logra mediante un tratamiento térmico o químico previo a la tinción con Giemsa con buffer fosfato de Sørensen a pH 6.8 y 60 ºC  Esta técnica es particularmente útil para identificar las regiones teloméricas de los cromosomas y otras regiones que son levemente teñidos cuando se usa el bandeo G. Las bandas T  Es una variante del bandeo R ya que las preparaciones son incubadas en el mismo buffer durante un período más prolongado.  Son subconjunto de bandas R con mayor concentración de pares GC. En todos los vertebrados, el ADN telomérico está formado por repeticiones del hexanucleótido TTAGGG 51  4.4 Citogenética 4.5.1 Técnicas de bandeo cromosómico para el diagnóstico genético Bandeo R y G de replicación.  En los 70s , Hallazgo de que las bandas R replican antes que las bandas G.  El uso de bloqueo de la replicación en fase S y sustitución de la timidina por BUdR (bromodesoxiuridina). Incorporar timidina en la cadena de ADN durante las etapas tempranas de la replicación (previas al bloqueo) y BUdR durante las etapas posteriores.  La coloración final podía ser fluorescente (con Naranja de Acridina) o no fluorescente (con colorantes tipo Romanowski).  En los 80s se desarrollaron técnicas para invertir el orden de incorporación de BUdR y timidina obteniéndose bandeos G de replicación. 52  4.4 Citogenética 4.5.1 Técnicas de bandeo cromosómico para el diagnóstico genético Bandeo Ag-NOR  Se emplea para localizar región organizadora nucleolar (NOR) NORs mediante la tinción con plata.  Los genes NOR son genes de ARN ribosómico.  En el bandeo Ag-NOR los genes NOR inactivos pueden no resultar teñidos. Por ello, este bandeo se usa para estudiar cambios en la actividad de genes ribosómicos durante la gametogénesis y el desarrollo embrionario. 53  4.4 Citogenética 4.5.1 Técnicas de bandeo cromosómico para el diagnóstico genético Cariotipo de Alta Resolución  Tinción en Profase y Prometafase, una fase más prematura de la mitosis, los cromosomas son más largos y aparecen aprox. 700-1200 bandas.  El cariotiopo convencional se da en una fase posterior de la mitosis (metafase), los cromosomas están más condensados y aparecen aproximadamente 300-600 bandas.  Las células en profase y prometafase se obtienen a partir de un cultivo de linfocitos sincronizado mediante el agregado de los reactivos 4'- fluoro 2'-desoxiuridina (FrdU) y 4'-bromo- 2'-desoxiuridina (BrdU).  Cuanto mayor es el nivel de bandas, mejor es la resolución, lo que permite identificar anomalías cromosómicas más sutiles, así como sus puntos de rotura. Confirmar por FISH. 54  4.4 Citogenética 4.5.2 Técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH) Recursos El bandeo FISH permite visualizar cromosomas mediante sondas marcadas fluorescentemente en células en división o en interfase. Contribuye a la detección de secuencias de ADN específicas en cromosomas, células y tejidos. Por ello puede emplearse para detectar anomalías cromosómicas que involucran pequeños segmentos de ADN. https://www.youtube.com/watch?v=NB_gt1TY-CA 1.Preparación de la Muestra: Los cromosomas de una célula se fijan en un portaobjetos de vidrio. (cromosomas metafásicos o núcleos en interfase) 2.Desnaturalización del ADN. Se separan las dos hebras de ADN. 3.Sondas Fluorescentes:. Estas sondas son fragmentos de ADN que se unen específicamente a las secuencias objetivo en los cromosomas. 4.Hibridación: Las sondas se hibridan (unen) a las secuencias complementarias en los cromosomas y se vuelve a formar la https://www.youtube.com/watch?v=w8xdqWI-PQs doble hélice. 55  4.4 Citogenética 4.4.2 Técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH) FISH de metafase Uno de los cromosomas 4 de este paciente era anormal, pero era difícil determinar con la FISH en metafase con sonda La señal de la sonda marcada con "X cen" es un control interno localizado en el centrómero de X, que permite la identificación citogenética de rutina si tenía una pequeña diseñada para la parte deleción terminal en 4q o si era el resultado de terminal del cromosoma rápida del (o los) cromosoma(s) X. La señal "Xp22.3" de la sonda una reordenación más compleja. Puesto que está localizada en la región de la esteroide-sulfatasa, en Xp22.3. 4q. Corrobora el diagnóstico ambos cromosomas 4 muestran fluorescencia Hibridado para detectar la deficiencia de esteroide-sulfatasa, de deleción terminar 4q. en toda su longitud y no hay material causada por una microdeleción en el cromosoma X. fluorescente en ningún otro cromosoma, esto https://www.orpha.net/es/disease/detail/96144 sugiere que la anomalía es una deleción 56 terminal pequeña  4.4 Citogenética 4.5.2 Técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH) FISH de interfase  La FISH se puede usar sobre células en interfase Un buen ejemplo es el ensayo de aneuploidía, que se realiza sobre células del fluido amniótico cuando hay una fuerte  La ventaja principal de la FISH de interfase es indicación clínica de una de las trisomías más comunes. Se que se puede realizar muy rápidamente si es desnaturalizan los núcleos de la muestra, se hibridan con preciso, normalmente en 24 horas, porque no sondas específicas para los cromosomas 13, 18, 21, X e Y, y los requiere cultivo para la proliferación de las resultados están disponibles habitualmente en 24 horas. La células. prueba de aneuploidía suele incluir también una citogenética de rutina para confirmar los resultados o detectar cualquier  Para determinar el número de copias de uno o anomalía no detectada por la FISH de interfase varios cromosomas, así como para detectar algunas reorganizaciones específicas que son características de ciertos tipos de cáncer. 57  4.4 Citogenética FISH de interfase 4.5.2 Técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH) Éste es un ejemplo de 2 pruebas de aneuploidía, donde a los núcleos en interfase procedentes de células de fluido amniótico de 2 fetos se han añadido sondas de DNA diseñadas para los cromosomas 13, 18, 21, X e Y. El núcleo de la izquierda se ha El núcleo de la derecha se ha El núcleo de la derecha se ha hibridado con sondas para los hibridado con sondas para los El núcleo de la izquierda se ha hibridado con sondas para los hibridado con sondas para los cromosomas 13 (verde) y 21 cromosomas 18 (azul claro), X (verde) cromosomas 18 (azul claro), X (verde) (rojo). e Y (rojo). cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo). e Y (rojo). Puesto que hay dos señales correspondientes a las sondas Muestra claramente tres señales rojas para el 21. Puesto de 13, 18 y 21, y una sola señal de cromosomas X e Y, este que muestra dos señales X y ninguna Y. Es un feto feto es un varón y es normal con respecto a la prueba de femenino con trisomía 21 58 aneuploidía  4.4 Citogenética 4.5.3 Técnica de Bandeo multicolor de alta resolución o High resolution multicolour banding (MCB)  Es una variación de la técnica FISH que emplea múltiples colores para crear patrones de bandas únicos a lo largo de los cromosomas.  Hibridación In Situ: Las sondas se hibridan en preparaciones cromosómicas en metafase o interfase.  Creación de Patrones Multicolor: La combinación de colores fluorescentes genera un patrón de bandas único para cada segmento cromosómico, similar al patrón de bandeo G pero con mayor resolución.  Análisis de Imagen: microscopía de fluorescencia avanzada, y se analizan con software especializado que interpreta los patrones. 59  4.4 Citogenética 4.5.4 Técnica de Multicolor (M-FISH) o spectral karyotyping (SKY)  Es una adaptación del FISH  Permite la visualización de los 23 pares de cromosomas a la vez, teñidos con diferentes sondas fluorescentes utilizando combinacines de siete o menos fluorocromos diferentes.  Hibridación In Situ: Las sondas se hibridan en preparaciones cromosómicas en metafase o interfase.  Para detectar aberraciones cromosómicas complejas, como las que se observan en ciertos tumores y en la leucemia linfoblástica aguda. 60  4.4 Citogenética 4.5.4 Técnica de Hibridación Genómica Comparativa (CGH)  Hibridizar metafases normales con una mezcla de ADN genómico control marcado con un fluorocromo A y ADN genómico marcado con un fluorocromo B del individuo cuya patología se estudia.  Ambos ADNs genómicos deben encontrarse en iguales cantidades.  Mayor fluorocromo B en trisomías, Mayor fluorocromo A en deleciones. 61  4.4 Citogenética 4.5.4 Técnica de Hibridación Genómica Comparativa (CGH) Técnica de Array-CGH Aquí la hibridización de la mezcla de ADNs normal y patológico no se hace sobre cromosomas metafásicos sino sobre una placa que contiene varios miles de clones BAC específicos de distintas regiones cromosómicas ordenados de tal manera de abarcar todo el genoma o la región particular en estudio. Nota: Un cromosoma artificial bacteriano (BAC) es una molécula de ADN diseñada que se utiliza para clonar secuencias de ADN en células bacterianas (por ejemplo, E. coli). Los BAC se utilizan a menudo en relación con la secuenciación de ADN. 62  4.4 Citogenética 4.5.6 Técnica de Amplificación de sondas dependiente de ligandos multiples (MLPA)  Es un método de PCR múltiple para detectar alteraciones en la cantidad de ADN en regiones específicas del genoma.  Para identificar duplicaciones, deleciones, y variaciones en el número de copias (CNVs, por Copy Number Variations) en genes y regiones cromosómicas específicas. https://www.youtube.com/watch?v=S1blh0WDC8U El MLPA no puede detectar Reordenamientos cromosómicos equilibrados. Deleciones y duplicaciones teloméricas. Deleciones y duplicaciones que quedan fuera del alcance de las sondas de MLPA utilizadas. Mutaciones puntuales, inserciones y deleciones pequeñas. Repeticiones secuenciales o mutaciones en el ADN mitocondrial https://www.youtube.com/watch?v=gfLJxKuqleY 63  4.4 Citogenética 4.5.7 Técnica de PCR Cuantitativa Fluorescente (QF-PCR)  Uso de Marcadores STR (Short Tandem Repeats: específicas en los cromosomas objetivo, que son altamente polimórficas entre individuos.  Precisa: detecta el 70-80% de las aberraciones cromosómicas causantes de anomalías congénitas (99.8-99.9% en embarazos de bajo riesgo).  Sensible: menos de 1 ml de líquido amniótico (sin necesidad de cultivo celular previo), vellosidades corionicas o una gota de sangre fetal del cordón umbilical.  Rápida: Los resultados pueden estar disponibles en 24-48 horas.  Análisis de Variaciones Genéticas: Detección de deleciones, duplicaciones y mosaicismo cromosómico.  Pruebas Postnatales: Confirmación de aneuploidías detectadas mediante otras técnicas.  Embarazos múltiples. Tiene la capacidad de identificar la cigosidad, es decir, identificar si los dos fetos provienen de un mismo cigoto (monocigóticos, es decir, gemelos idénticos) o de diferentes (mellizos)  Identificación Forense y Pruebas de Paternidad: Los STR también se utilizan para establecer relaciones biológicas. 64 4.1¿Por qué se emplean técnicas de diagnóstico? 4.2 Enfermedades genéticas detectables mediante diagnóstico genético 4.3 Tipos de mutaciones. 4.4 Herencia de enfermedades genéticas: 4.4 Citogenética. 4.4.1 Técnicas de bandeo cromasómico para el diagnóstico genético 4.4.2 Técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH). 4.4.3 Técnica de Bandeo multicolor de alta resolución o High resolution multicolour banding (MCB) 4.4.4 Técnica de Multicolor (M-FISH) o spectral karvotyping (SKY) 4.4.4 Técnica de Hibridación Genómica Comparativa (CGH) 4.4.6 Técnica de Amplificación de sondas dependiente de ligandos multiples (MLPAL 4.4.7 Técnica de PCR Cuantitativa Fluorescente (QF-PCR) 4.6 Otras técnicas para el diagnóstico genético:Inmunohistoquimica e inmunofluorescencia 65  4.6 Otras técnicas para el diagnóstico genético: Inmunohistoquímica e Inmunofluorescencia El principio básico de la IHC/ICC diagnóstica es una reacción de unión antígeno-anticuerpo en la que se utiliza un anticuerpo marcado con una enzima o un colorante fluorescente para visualizar la localización y la distribución de un antígeno específico en tejidos, cortes de tejido o células. Marcadores inmunohistoquímicos comunes CD34  Tinción convencional no específica, hematoxilina y la Citoqueratina 7 (CK7) eosina (HyE), : La hematoxilina tiñe de violeta azulado Citoqueratina 20 (CK20) intenso los ribosomas, la cromatina (material genético) Desmín dentro del núcleo y otras estructuras. La eosina tiñe de rosa Receptor de estrógeno (ER) anaranjado o rosado el citoplasma, el colágeno, el tejido GATA-3 Ki-67 conjuntivo y otras estructuras que rodean y sostienen la MIB-1 célula. p16 p63  IHC directa e indirecta p43 p40  Inmunofluorescencia (IFA), incluso en tejido no fijados. No Receptor de progesterona (PR) es IHC. S100 medias-10 TTF-1 66  4.6 Otras técnicas para el diagnóstico genético: IHC-IF Protocolo detallado de IHC/IF 1) Preparación de la Muestra: Se fija el tejido en formalina y se incluye en parafina para su posterior corte en secciones delgadas. 2) Desparafinización y Rehidratación: Las secciones de tejido se desparafinizan y rehidratan para prepararlas para la tinción. 3) Bloqueo de Endógenos: Se bloquean las enzimas endógenas para evitar reacciones no específicas. 4) Aplicación de Anticuerpos Primarios: Se aplican anticuerpos específicos que se unen a los antígenos (proteínas) diana en el tejido. 5) Aplicación de Anticuerpos Secundarios: Estos anticuerpos se unen a los anticuerpos primarios y están conjugados con una enzima o fluorocromo para la detección1. 6) Detección y Visualización: La enzima conjugada con el anticuerpo secundario cataliza una reacción que produce un color visible bajo el microscopio, o el fluorocromo emite fluorescencia detectable. 67  4.6 Otras técnicas para el diagnóstico genético: IHC-IF  La detección con enzimas es a lo que se denomina inmunocitoquímica o inmunohistoquímica.  Actualmente es más frecuente usar el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC; Figura 3).  Los anticuerpos están marcados con una sustancia (cromógeno) que produce una reacción química y genera una señal visible, generalmente en forma de un color, cuando se encuentran con la proteína objetivo https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/4-inmuno.php 68  4.6 Otras técnicas para el diagnóstico genético: IHC-IF La inmunofluorescencia se basa en las La inmunofluorescencia utiliza anticuerpos marcados con propiedades de los fluorocromos. No es una fluorocromos en lugar de cromógenos. Estos fluorocromos inmunohistoquímica puesto que no se produce emiten luz cuando se exponen a una determinada longitud de ninguna reacción química. onda de luz, lo que permite una visualización más precisa y detallada. La inmunofluorescencia se utiliza a menudo para estudiar la distribución y la localización de proteínas específicas en las células y los tejidos. https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/4-inmuno.php 69  4.6 Otras técnicas para el diagnóstico genético: IHC Protocolo detallado de IHC 1) Preparación de muestras: se recolectan muestras de tejido, a menudo mediante biopsia o resección quirúrgica y luego se fija para preservar la arquitectura del tejido. La formalina es un fijador de uso común. El tejido se incluye en cera de parafina para facilitar el corte. 2) Seccionamiento: el bloque de tejido incluido en parafina se corta en secciones delgadas (generalmente de 4 a 4 micrómetros de espesor) utilizando un microtomo. Estas secciones se colocan en portaobjetos de microscopio para teñirlas. 3) Desparafinización y rehidratación: los portaobjetos se tratan para eliminar la parafina y rehidratar los tejidos, normalmente utilizando xileno (o alternativas) seguido de alcoholes graduados. 4) Recuperación de antígenos: muchos antígenos quedan enmascarados durante el proceso de fijación. La recuperación de antígenos implica tratar las secciones con calor o enzimas para exponer estos sitios antigénicos y hacerlos accesibles a los anticuerpos. 5) Bloqueo: los sitios de unión no específicos se bloquean utilizando una solución de proteína para evitar que el anticuerpo primario se una de manera no específica, lo que podría dar lugar a resultados falsos positivos. 70 https://www.mypathologyreport.ca/es/pathology-dictionary/immunohistochemistry/  4.6 Otras técnicas para el diagnóstico genético: IHC Protocolo detallado de IHC 6) Incubación de anticuerpos primarios/ secundarios: el portaobjetos se incuba con un anticuerpo primario que es específico del antígeno de interés. Este paso permite que el anticuerpo se una a su antígeno objetivo en el tejido. Después de eliminar por lavado cualquier anticuerpo primario no unido, se agrega un anticuerpo secundario para la IHC indirecta, es decir, en el caso de que el Ac primario no estuviese marcado. Este anticuerpo marcado (1º o 2º) está conjugado con una enzima (como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina) o un marcador fluorescente 7) Detección:. Luego, la presencia del anticuerpo marcado se visualiza mediante una reacción colorimétrica (en el caso de anticuerpos conjugados con enzimas) o fluorescencia (en el caso de anticuerpos marcados con fluorescencia). Para la detección colorimétrica, se agrega un sustrato que la enzima convierte en un producto coloreado visible en el sitio de la interacción antígeno-anticuerpo. 8) Contratinción: para mejorar la visualización de la arquitectura del tejido, normalmente se aplica una contratinción suave (p. ej., hematoxilina) al portaobjetos y se tiñe la célula. núcleos con un color contrastante. 9) Montaje y visualización: el portaobjetos se cubre con un cubreobjetos y el tejido teñido se examina bajo un microscopio óptico o fluorescente. La localización, intensidad y patrón de tinción proporcionan información sobre la presencia y distribución del antígeno dentro del tejido 71 https://www.mypathologyreport.ca/es/pathology-dictionary/immunohistochemistry/  RESUMEN Técnica Principio Básico Resolución Aplicaciones Principales Ventajas Limitaciones - Baja resolución. Uso de tinciones específicas - Permite observar todos los - No detecta para visualizar patrones de - Identificación de aneuploidías. cromosomas microdeleciones ni Técnicas de Bandeo bandas en cromosomas. - Grandes reordenamientos cromosómicos Baja (4-10 Mb). simultáneamente. variaciones menores. Cromosómico Convencional: < 400 bandas (translocaciones, deleciones, - Económico y ampliamente - El de AR puede evaluar Alta Resolución: 640-1000 duplicaciones). accesible. microarreglos bandas cromosómicos (>4-4 Mb). - Alta especificidad. - Puede usarse en metafase - Limitado a regiones Uso de sondas fluorescentes - Diagnóstico de deleciones, duplicaciones Moderada (40- o interfase (ensayo de específicas. FISH para detectar secuencias específicas. 100 kb). aneuploidía). - Requiere sondas diseñadas específicas en cromosomas. - Análisis de translocaciones en cáncer. - Cultivo celular para previamente. metafase - Alta resolución. Combinación de sondas FISH - Detección de anomalías estructurales - Permite distinguir - Costoso. MCB (High Resolution marcadas con múltiples complejas. regiones difíciles de - Requiere equipamiento Alta (10-40 kb). Multicolour Banding) colores para generar patrones - Estudios detallados en síndromes y interpretar. avanzado y análisis únicos en cromosomas. cáncer. - Útil para aberraciones computacional. complejas - Visualización clara de todos Versión avanzada de FISH que los cromosomas en colores - No detecta microdeleciones asigna un color único a cada - Identificación de reordenamientos únicos. o duplicaciones pequeñas. M-FISH o SKY cromosoma mediante Alta (10-40 kb). cromosómicos complejos y múltiples - Útil en análisis - Costoso y técnicamente múltiples sondas translocaciones. oncológicos. demandante. fluorescentes. - Útil para aberraciones complejas 72  RESUMEN Técnica Principio Básico Resolución Aplicaciones Principales Ventajas Limitaciones - Económico. Amplificación de sondas - Diagnóstico de deleciones y - Limitado a regiones - Analiza múltiples regiones específicas tras ligación para Alta (1 exón o duplicaciones genómicas. específicas. MLPA en una sola reacción. detectar variaciones en el menos). - Enfermedades específicas (p. ej., DMD, - No detecta translocaciones o - Fácil de ejecutar. número de copias. SMN1/SMN2). mutaciones puntuales. - Ideal para enf. específicas - Rápido (resultados en PCR con marcadores - Alcance limitado a - Diagnóstico rápido de aneuploidías horas). fluorescentes para cuantificar Alta (1 exón o cromosomas objetivo. QF-PCR comunes (13, 18, 21, X, Y). - Económico y simple de ADN amplificado en menos). - No detecta aberraciones - Útil en pruebas prenatales. realizar. cromosomas específicos. estructurales complejas. - Ideal para enf. específicas - Análisis global sin necesidad de secuencias Comparación de ADN del - No detecta reordenamientos objetivo. Hibridación Genómica paciente y referencia para Muy alta (