Aplicaciones Industriales de Cultivos Celulares (PDF)

**TEMA 6A APLICACIONES INDUSTRIALES DE CULTIVOS CELULARES** **AMPLIFICACIÓN Y EXPRESIÓN DE ADN RECOMBINANTE** **¿Qué es el ADN recombinante?** - Es una molécula de ADN que ha sido creada artificialmente al combinar fragmentos de ADN de diferentes orígenes. - Permite introducir nuevas car...

**TEMA 6A APLICACIONES INDUSTRIALES DE CULTIVOS CELULARES** **AMPLIFICACIÓN Y EXPRESIÓN DE ADN RECOMBINANTE** **¿Qué es el ADN recombinante?** - Es una molécula de ADN que ha sido creada artificialmente al combinar fragmentos de ADN de diferentes orígenes. - Permite introducir nuevas características o estudiar la función de genes específicos en un organismo diferente. **¿Proceso para generar el ADN recombinante?** 1. Aislamiento del gen de interés (inserto) 2. Inserción en un vector (de clonación o de expresión) 3. Uso de enzimas de restricción y ligasa para formar la molécula de ADN recombinante 4. Introducción en la célula huésped **Células que pueden utilizarse como hospedadoras del ADN exógeno** - Microorganismos: bacterias y levaduras - Plantas superiores: - Células o tejidos en cultivo, individuos adultos completos - Usos: - Desarrollo de alimentos transgénicos - Plantas factoría - Biorremediación: retornar un medio ambiente alterado por contaminantes a su condición natural mediante el uso de microorganismos, hongos, plantas o las enzimas derivadas de ellos - Cultivos celulares derivados de tejidos animales: - Para genes de organismos superiores incluida la investigación en humanos - Los cultivos primarios suelen ser más difíciles de transfectar que las líneas continuas - Embriones animales o células madre pluripotentes: - Para el desarrollo de animales transgénicos con múltiples aplicaciones, por ejemplo, en investigación científica en biomedicina - Transfección de células madre adultas para terapia génica ex vivo **Sistemas de transfección (gene delivery)** que se utilizan más frecuentemente para introducir ADN exógeno en células en cultivo son: - Métodos químicos: - Fosfato cálcico - Mezcla del ADN recombinante en un tampón fosfato (HBS) y CaCl2 que permite la formación de un precipitado que favorece su entrada en el interior celular (probablemente por endocitosis) - Rendimiento normalmente bajo - No se puede utilizar con todos los tipos celulares - Pej: 293T, HeLa - Policationes o Polímeros catiónicos - Distintas formulaciones de policationes que interaccionan con el ADN (polianión) y facilitan la entrada al interior celular por endocitosis - Pueden ser tóxicos para las células: rendimiento limitado - Fusiones celulares o Liposomas - ADN recombinante en el interior de liposomas (vesículas lipídicas artificiales) que se fusionan con la membrana celular - La mayoría de las células eucarióticas están cargadas negativamente en su superficie: los liposomas cargados positivamente interactúan con las células. Las células absorben los complejos de ADN recombinante-liposoma y parte del ADN transfectado entra en el núcleo - Reactivos basados en lípidos catiónicos - Aprovechan las propiedades de los liposomas y los policationes para favorecer la introducción de los ácidos nucleicos en el interior celular - Se forman los complejos lipoplejos - Reactivos más conocidos: JetPEI®, Lipofectamine®, Fugene® - Tienen una baja toxicidad celular - Fusión de protoplastos - Fusión de células animales o vegetales con bacterias que contienen plásmidos recombinantes mediante PEG (polietilenglicol, policatión) - 1\. Transferir el ADN recombinante a una célula bacteriana - 2\. Disolver la pared celular con lisozima: protoplasto - 3\. Fusionar el protoplasto con una célula de mamífero gracias a agentes de fusión, como el polietilenglicol (PEG) - 4\. Selección de las células fusionadas mediante métodos adecuados: por ejemplo, selección por antibióticos - **Métodos mecánicos:** - Electroporación o electropermeabilización - Aplicar un campo eléctrico a una célula viva durante un breve período de tiempo (mseg) para crear poros microscópicos en la membrana plasmática llamados electroporos por los que entra el DNA - Se puede aplicar a bacterias, plantas (protoplastos) y células animales - En órganos y tejidos se pueden utilizar pinzas con electrodos para generar el campo eléctrico - Desventaja: a mayor eficiencia de transfección, menor viabilidad del cultivo - Nucleofección - Transfección por electroporación que permite introducir DNA o RNA directamente en el núcleo de células muy difíciles de transfectar: células primarias (pej células madre) - Desventajas: baja viabilidad y persistencia en cultivo, precio elevado - Se precisan soluciones y condiciones específicas para cada tipo celular - Nucleofector: inventado por Amaxa. - Microinyección - Introducción directa del ADN recombinante en la célula huésped - Para células vegetales y animales - Sujeción de la célula mediante succión suave a un capilar de vidrio. Mediante un micromanipulador se introduce una aguja en el núcleo de la célula huésped para inocular ADN o células madre embrionarias - Desventajas: - Personal cualificado - No es adecuada para procedimientos en los que se requieren grandes cantidades de recombinantes - Biolística - Disparo a gran velocidad de partículas diminutas (generalmente de oro o tungsteno) recubiertas del material genético que se desea introducir al núcleo de la célula (animal o vegetal) - En plantas, la transfección con Agrobacterium tumefaciens es menos invasiva y causa menos daño físico a las células vegetales en comparación con la biolística - Los disparos se producen mediante presión de helio o mediante descarga eléctrica de alto voltaje - **Métodos biológicos:** - Transferencia génica mediante virus - El gen se empaqueta en el genoma de un virus que es producido para infectar la célula huésped: ausencia de factores de virulencia - Se puede utilizar para células: - Procariotas: bacteriófagos - Eucariotas: - Células animales: adenovirus, lentivirus, retrovirus - Células vegetales: Caulimo y Gemini virus - Se suelen infectar embriones o células pluripotentes cultivadas in vitro o incluso individuos adultos: los embriones o las células madre se exponen al virus y son transferidos a blastocitos o directamente a madres adoptivas que podrán generar individuos transgénicos - Limitaciones: - Reducido tamaño del inserto que se puede encapsidar - Riesgo residual derivado del uso de patógenos **Métodos de selección de células recombinantes (transfectadas)** - Sólo una parte de las células sometidas a transfección resultarán transformadas por el ADN recombinante - Tipos de transfección: - Transfección transitoria: el ADN exógeno no se integra en el ADN genómico de la célula huésped, es decir, el ADN exógeno se pierde gradualmente conforme las células se dividen - Transfección estable: el ADN exógeno se integra en el ADN genómico y se transmite a la descendencia celular - Para discriminar las células que han adquirido el gen transferido se utilizan: - Marcadores de selección: - Antibióticos: crecimiento selectivo de clones recombinantes - Producción de un producto adicional fácilmente detectable y cuantificable - Genes indicadores (reporter) incluidos en el ADN recombinante - Marcadores más utilizados en células animales: - 1\. Genes que proporcionan resistencia a antibióticos - 2\. Complementación de auxotrofías: Consiste en introducir una copia funcional del gen que falta o que está defectuoso en el organismo auxótrofo - Organismos auxótrofos: tienen defectos en su capacidad para sintetizar ciertos compuestos esenciales (como aminoácidos, nucleótidos o vitaminas) debido a mutaciones en genes específicos. Como resultado, requieren que ese compuesto sea suministrado en su medio de crecimiento para sobrevivir. - Organismos protótrofos: pueden sintetizar todos los compuestos esenciales necesarios para su crecimiento. - 3\. Timidina quinasa (TK): Para realizar la selección, se emplean fármacos específicos, como el ganciclovir o aciclovir (análogos de nucleósidos). En presencia de timidina quinasa, estos fármacos son convertidos en formas tóxicas - 4\. Genes de reacción colorimétrica, fluorimétrica o bioluminiscencia (genes reporter): - Operón LacZ: induce la síntesis de la β-galactosidasa, que es capaz de transformar análogos de la lactosa, como el X-gal, en productos azules. - Si el gen de interés se inserta en un sitio que interfiere con la lectura del gen lacZ, las colonias resultantes no producirán β-galactosidasa y, por lo tanto, no se volverán azules. - Gen de la luciferasa: degrada la luciferina en presencia de ATP, emitiendo luz amarillo-verdosa. - Gen GUS: el gen reportero codifica la enzima β-glucuronidasa bacteriana, que cataliza la escisión de los β-glucurónidos, como el X-Gluc, lo que permite obtener un producto azul. - Gen GFP (Green Fluorescent Protein) **OTRAS APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS** **Generación de animales transgénicos** - Transfección de ESC (embryonic stem cells): - Procedimiento: - 1\. Cultivo y modificación de ESCs - 2\. Selección de células modificadas - 3\. Inyección en blastocistos - 4\. Implantación en hembras receptoras - 5\. Cruzamiento para obtener animales transgénicos puros - Microinyección de núcleos somáticos y transferencia nuclear en ovocitos o transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) - Procedimiento: - 1\. Modificación genética de células somáticas - 2\. Obtención del ovocito receptor - 3\. Transferencia nuclear - 4\. Estimulación para el desarrollo embrionario - 5\. Implantación en una hembra receptora - 6\. Nacimiento y análisis del animal transgénico Ver tabla página 6 **Fertilización o fecundación in vitro** - Unión del óvulo con el espermatozoide en el laboratorio para generar embriones y poder transferir al útero materno - Se utiliza tanto en animales como en seres humanos para aumentar las posibilidades de embarazo (reproducción asistida): en humanos se realizó por primera vez con éxito en 1978 - Dos opciones: - Co-cultivo de espermatozoides con los óvulos para producir una fertilización convencional - Introducción de espermatozoides directamente en el citoplasma del óvulo mediante microinyección - inyección intracitoplasmática de espermatozoides (Intracytoplasmic sperm injection, ICSI): cuando la fertilidad masculina está gravemente comprometida - Herramienta imprescindible para la obtención de células madre embrionarias para investigación **Clones híbridos** Hibridación somática: - Fusión entre células de diferentes orígenes, donde los núcleos se fusionan manteniendo al menos parte de los cromosomas de ambas células: pueden mostrar características de cualquiera de los parentales o de ambos - Método más clásico de fusión: PEG para favorecer la fusión de las membranas celulares y nucleares de los dos tipos de células - Baja eficiencia de fusión: medios selectivos en los que solo crecen las células que comparten los dos fenotipos parentales - Heterocarionte es una célula multinucleada que contiene núcleos genéticamente diferentes - Otros híbridos se forman por la fusión de células de dos especies distintas, pej, ratón y humano (células humanizadas) - Caso más común de clones híbridos son los hibridomas: originados a partir de la fusión de dos células distintas: - 1\. Una célula cancerígena - 2\. La célula de interés - Los más utilizados son las que proceden de la fusión de células de mieloma (célula de un tipo de cáncer de medula ósea que se divide indefinidamente) con células linfocíticas (linfocitos B procedentes de bazo, que producen un anticuerpo deseado contra un antígeno determinado). La célula híbrida combina las capacidades de ambas células. - Los hibridomas que producen el anticuerpo correcto se clonan mediante técnicas como el aislamiento de células individuales en placas de cultivo, para asegurar que cada clon sea una línea celular pura que produce un único tipo de anticuerpo: anticuerpo monoclonal. - El hibridoma resultante puede producir anticuerpos rápidamente y en grandes cantidades: se suelen utilizar para producción a gran escala en biorreactores Hibridación somática: selección en medio HAT - Medio HAT para seleccionar los hibridomas formados después de la fusión: medio que presenta hipoxantina-aminopterina-timidina - Durante el proceso de fusión, hay tres tipos de células: - 1\. Células del bazo no fusionadas (linfocitos B): - Expresan HGPRT (hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa) - Los linfocitos B mueren porque tienen una vida limitada y no pueden dividirse indefinidamente - 2\. Células de mielomas no fusionadas: - Aminopterina bloquea la vía de síntesis de nucleótidos de ADN de novo, lo que hace que las células dependan de la vía de rescate de nucleótidos para sobrevivir - Deficiente en la enzima HGPRT (hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa), que se encarga de reciclar nucleótidos de purina - Cuando la ruta de novo está bloqueada, las células utilizan la vía de rescate como medio alternativo para poder replicarse: solo si están presentes la hipoxantina y la timidina - Los mielomas no pueden replicarse en cultivo con HAT porque no tienen HGPRT - 3\. Hibridomas: heredan HGPRT funcional de las células del bazo; por tanto, a pesar de que la ruta de novo está bloqueada, los hibridomas pueden usar la ruta de recuperación para replicarse. Por lo tanto, solo las células fusionadas sobreviven en medio HAT **Co-cultivos** - Durante el establecimiento de un cultivo celular se pierden las interacciones entre las células: influye en la pérdida de funcionalidad de muchos tipos celulares en cultivo - Para solventar este problema se recurre a los co-cultivos: múltiples tipos celulares se siembran en el mismo cultivo in vitro para mimetizar la organización y complejidad del microambiente in vivo - Uno de los tipos celulares actúa como nodriza y soporte (feeder or helper cells) de otros tipos celulares - Ejemplos: - Blastocitos + células de las trompas de Falopio o células de endometrio (Fertilización in vitro) - HUVEC primarias (células endoteliales humanas de cordón umbilical) + fibroblastos - Ver más en página 18 - En el sustrato o soporte del cultivo, micro- o nano-patrones definidos de superficie permiten generar una distribución topográfica específica de los distintos tipos celulares del co-cultivo y controlar los microflujos del medio de cultivo sobre el cultivo - La distinta topografía de los soportes puede afectar a la respuesta celular (cambios en adhesión, migración, expresión génica, proliferación, diferenciación de células madre) - Existen multitud de mecanismos para generar estos patrones definidos para co-cultivos: - - - - - - - - - - - - - - - **Cultivos 3D u organotípicos** - Cultivos histotípicos - Cultivos de un solo tipo celular - Alcanzan elevada densidad celular - Cultivos organotípicos - Formados por varios tipos celulares que interaccionan entre sí de la forma más parecida posible a la original (son co-cultivos 3D) - Incluyen el aislamiento y reagregación de células (diferenciadas y/o células madre) desde órganos (piel, cerebro, hígado, etc) o embriones que puedan llevar a la reconstrucción de estructuras 3D con algunas de las propiedades estructurales y funcionales del tejido original - Las matrices y scaffolds para tejidos organotípicos suelen realizarse con materiales biodegradables: - Ácido poliglicólico (PGA) - Ácido poliláctico (PLA) - Colágeno y gelatina - Impresión en 3D con materiales biocompatibles **Cultivos 3D u organotípicos- Organoides/Esferoides** - Estructuras multicelulares en 3D derivadas de células específicas de órganos con características similares a las de las células madre, que pueden autoorganizarse y dividirse de forma similar a la in vivo, simulando la arquitectura y la funcionalidad de los órganos nativos. - Ventajas: - Respetar las diferencias entre los pacientes - Asemejarse a los tejidos de origen → comportamientos fisiológicos más realistas - Se pueden establecer a partir de tejido normal, tumores primarios y metástasis - Permanecen genéticamente estables - Matrigel: Mezcla proteica gelatinosa secretada por las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Da el soporte necesario a los organoides, y simula la matriz extracelular (colágeno, laminina, heparán sulfato, entactina y factores de crecimiento). Existen diferentes tipos de Matrigel, por ejemplo, sin factores de crecimiento. - Limitaciones - Variabilidad lote a lote → Puede afectar a la reproducibilidad - Puede haber presencia de factores de crecimiento que interfieren en los resultados **Ingeniería tisular funcional o ingeniería de tejidos** - Usos: medicina regenerativa - Implantación de tejidos generados in vitro a partir de células del propio paciente (autólogas) o donantes (heterólogas) - Scaffolds naturales o artificiales (generación de cultivos organotípicos o ingeniería tisular funcional - Dos categorías: **Biología sintética** Tecnología disruptiva capaz de ofrecer nuevas soluciones a los desafíos globales de la salud, la agricultura, la fabricación y el medio ambiente. Aún por desarrollar (automatización e inteligencia artificial) debido al actual reducido beneficio/coste