Mikrobiologie Vorlesung Teil 2 PDF: Trübung & Hefezellzyklus

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 2 TRÜBUNG & HEFE-ZELLZYKLUS Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland 1 Topic of the day Saccharomyces cerevisia...

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 2 TRÜBUNG & HEFE-ZELLZYKLUS Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland 1 Topic of the day Saccharomyces cerevisiae Trübung-Flockulierung Wachstum Zellzyklus Altern - Seneszenz 2 Bestimmung der Zellzahl in einer Lösung Eine Mikrobenzelle können wir nicht sehen, Aber viele verursachen eine Trübung. 3 Bestimmung der Zellzahl in einer Lösung Zellzahl und Trübung Verschiedene Hefezellzahlen verursachen in klaren Flüssigkeiten folgende Trübungsmuster: ▪ 1,000/ml – Kristallklar ▪ 100,000/ml – geradeso erkennbare Trübung ▪ 1,000,000/ml – geringe Trübung/Haze = Schleier ▪ 10,000,000/ml – hohe Trübung 4 Bestimmung der Trübung Bei einzelligen Organismen ist die optische Dichte proportional zur Zellzahl 5 Bestimmung der Trübung ▪ Zellen verschiedener Hefearten sind unterschiedlich groß. ▪ Deshalb entspricht dieselbe OD bei ihnen dann verschiedenen Zellzahlen. ▪ Messung erfordert das Erstellen einer Standardkurve. ▪ Hier eine Tabelle für Saccharomyces cerevisiae. 6  Zählen aller Zellen: Gesamtzellzahl 12*25 =300 300*50 =15000 = 1,5*104 7 1,5*104 * 1000 = 1,5*104 * 1* 103= 1,5 * 107 https://www.pearson.ch/download/media/9783868942606_SP.pdf Bestimmung der Lebendkeimzahl KBE = Kolonie-Bildende Einheiten CFU = colony forming units 8 https://www.pearson.ch/download/media/9783868942606_SP.pdf Mikrobielle Trübung Hefe oder Bakterienwachstum nach der Abfüllung... Bombage durch Nachgärung in Flaschen 9  Flockulierung bei Hefen Flockulierung sorgt dafür, dass sich Hefezellen am Ende der Fermentation verklumpen und am Boden absetzen (untergärig) oder an der Oberfläche ansammeln (obergärig) 10 Staubhefe vs Bruchhefe d1 Bruchhefe Staubhefe 11 Zelltrennungsdefekte ≠ Flockulierung 12  Flockulierung bei Hefen: Am Ende der Fermentation Als Schwarmbildung, um als Kolonie widrige Umweltbedingungen zu überleben 0:00:00 0:00:05 0:00:10 0:00:15 0:00:30 EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA wird verwendet um zweiwertige Metallionen zu binden 13 Inhibierung der Flockulierung ▪ EDTA ▪ Temperaturkontrolle: Senken der Temperatur kann die Flockulierung bei Lagerbier-Hefen beeinträchtigen ▪ pH-Kontrolle sehr stammabhängig ▪ Wahl der Hefe: Staubhefe vs Bruchhefe ▪ Zugabe von Mannoproteinen inhibiert die Flockulierung ▪ Bei hohen Zuckergehalten findet keine Flockulierung statt - Glucoserepression 14  Flockulierung bei Hefen 15 https://scheffer-krantechnik.de/de/produkte/spezialkrananlagen/greiferkrane  Flockulierung bei Hefen 16 http://dx.doi.org/10.1094/TQ-53-1-0302-04 Flockulierungsgene: FLO-gene ψ FLO9 FLO1 ψ ψ FLO5 ψ TEL1L TEL1R TEL8L TEL8R YIR039C/ FLO11 YPS6 YIR042C FLO10 TEL9L TEL9R TEL11L TEL11R 17 Bernardi et al., 2018 Flockulierungsgene: FLO-gene ▪ Das Signalpeptid dient dem Transport des Proteins aus der Zelle. ▪ Die N-terminale Domäne enthält eine Zuckerbindestelle. ▪ Mit dieser Domäne können Flockulierungsproteine Zuckermoleküle auf der Zelloberfläche anderer Zellen binden >>> das führt zur Agglutinierung der Zellen, also zur Flockenbildung. ▪ Zuckermoleküle sind Glukose oder Mannose. 18 Flo-proteine 19 Saccharomycopsis fermentans: FAS Gene FAS: FLO/ALS-like Sequence Saccharomycopsis fermentans YLR121C/ YGR260W/ YPR201W YPS3 FAS1 FAS2 TNA1 FAS3 FAS4 TEL1L 1.127kb 1.131kb 55 kb YLR121C/ FAS5 YPS3 FAS6 FAS7 TEL1R 49 kb YLR121C/ YGR260W/ YNR074C YIR042C FAS17 YPR201W YJL212C YPS3 FAS18 TNA1 TEL4L 55 kb YLR121C/ YKL215C FAS19 FAS20 FAS21 YPS3 FAS22 TEL4R 57 kb 20 Bernardi et al., 2018 Flockulierung bei Hefen 21 FLO-Gene werden transkriptionell reguliert durch Flo8 22 FLO8 in Laborstämmen 23 BY4741 und andere Laborhefen, tragen eine Mutation im FLO8 Gen. Deshalb flockulieren diese Stämme nicht. Das vereinfacht die Arbeit mit diesen Hefestämmen. Topic of the day Saccharomyces cerevisiae Trübung-Flockulierung Wachstum Zellzyklus Altern - Seneszenz 24  Hefe in verschiedenen Formen Trickenhefe: 5 % Wassergehalt Frischhefe: 70 % Wassergehalt Aktive Trockenhefe Instant Trockenhefe 25 Eingeführt von Fleischmann während des 2. Weltkriegs klipfel.ch/Klipfel-Hefe-AG/Die-Hefe/Die-Hefearten/  Hefe: Frischhefe warum eigentlich 42 Gramm? 500 g Block Hefe: Vom Bäcker so geteilt, dass man von einem Stück Hefe 1 kg Mehl verarbeiten kann. Dazu wurde der Block in 12 Stücke geteilt: 500:12= 41,67 g 26 Trockenhefepäckchen: 7 g. https://www.brigitte.de/leben/wohnen/haushalt/hefe-mythos-gelueftet--darum-wiegt-ein-wuerfel-hefe-genau-42-gramm-10914730.html  Hefe-Mikrobiologie ▪ Um eine Vorstellung von dieser Größenordnung zu bekommen: ▪ Eine Hefezelle ist 4 µm breit und 6 µm lang. ▪ Zeitungspapier: 20 Hefezellen übereinander sind so dick wie 1 Seite. ▪ Alle Zellen von einem 1 kg Hefeblock aneinandergereiht liefern eine 42.000 km lange Kette – einmal um die Erde. ▪ Für Bier-Fermentation: 15-50 Millionen Zellen/ml ▪ Für Wein-Fermentation: 2 Millionen Zellen/ml 27 Hefegeschichte: https://www.youtube.com/watch?v=2_Z5bKpoFxA klipfel.ch/Klipfel-Hefe-AG/Die-Hefe/Was-ist-Hefe-/ Hefe-Mikrobiologie Mikroorganismen: Wachstum und Zelltrennung bei Hefen : 28 Der Zellzyklus 29 Der Zellzyklus Nucleus START Cytokinese Beginn der DNA-Synthese G1 Bud emergence/Knospung Verdoppelung des Spindelpol- körpers M S Mitose G2 G1: Gap1 S: Synthese G2: Gap2 M: Mitose Spindelelongation und 30 Kernwanderung  Der Zellzyklus G1: Nucleus Wachstum z.B. der Tochterzelle, selbst groß genug zu werden, um in einen Cytokinese START neuen Zellzyklus einzutreten. mRNA und Proteine werden angesammelt. Beginn der DNA-Synthese G1 Bud S: emergence/ M S Knospung Verdoppelung des Spindelpolkörpers (SPB), Entstehung der Mitose Knospe/Tochterzelle; Replikation der DNA G2 G1: Gap1 S: Synthese G2: G2: Gap2 Spindelelongation und M: Mitose Wachstum der Tochterzelle; Überprüfen Sie, ob die DNA-Replikation Kernwanderung abgeschlossen ist. Vorbereitung auf die Teilung, Organellenvererbung M: Verlängerung der Spindel, Ausrichtung der Spindel in der Mutter-Knospen- Achse, Bewegung der Chromosomen zu den entgegengesetzten Polen des Kerns. Die Kernmembran bleibt intakt (anders als bei menschlicher Zellen). Bewegung des Tochterkerns in die Knospe hinein. Sobald sich in der Tochterzelle ein Zellkern befindet, findet die Zytokinese statt, also die Zelltrennung. 31  Der Zellzyklus Asymmetrische G1: Gap 1 S: Synthese Phase Zellteilung G2: Gap 2 M: Mitose Lee Hartwell DNA-Replikation Tim Hunt Paul Nurse 32 Nobel Prize 2001  Centriol in Säugerzellen https://www.youtube.com/watch?app=desktop&v=Fn2Vokt6taQ 33 https://www.psi.ch/de/news/medienmitteilungen/dem-raetsel-der-centriolen-bildung-auf-der-spur Centriol in Säugerzellen https://www.youtube.com/watch?app=desktop&v=Fn2Vokt6taQ 34 35  Geschlossene Mitose – Kernbewegungen bis zur Mitose Kernmembran ▪ Geschlossene Mitose in Hefe: Die Kernmembran bleibt intakt SPB + cytoplasmatische und nukleäre Mikrotubuli http://jcb.rupress.org/content/139/4/985 36  Der Spindelpolkörper Scale, 200 nm, beachten Sie die Größenunterschiede zwischen äußerer und innerer Plaque 37 https://doi.org/10.1101/442574  Der Spindelpolkörper 38 Der alte SPB wird in die Tochterzelle abgegeben, der neue SPB verbleibt in der Mutterzelle doi:10.1186/1747-1028-1-12  Der Spindelpolkörper Das Entfernen der Spc110p coiled coil Domäne (schwarze Box im Diagramm) führt dazu, dass die Enden der Spindelmikro- tubuli näher an die zentrale Plaque isolierter SPBs rücken: Der Pfeil zeigt die sich verengende Lücke. Beachten Sie, dass die Position der Enden der vom SPB initiierten Mikrotubuli durch ihre versiegelten Enden klar definiert ist. 39 Maßstabsbalken, 0,1 mm. Lessons from yeast: the spindle pole body and the centrosome, Volume: 369, Issue: 1650, DOI: (10.1098/rstb.2013.0456) Kernwanderung: Zeitraffermikroskopie Candida albicans Zellen mit Histone H4-GFP, das im Kern lokalisiert 40 Das Altern Seneszenz 41  Altern Hefezellen auch? Bei jeder Zellteilung entsteht eine Knospungsnarbe auf der Zelloberfläche der Mutterzelle. Irgendwann kann eine Zelle sich nicht mehr teilen – und keine neue Knospungsstelle anlegen. Das tritt nach 30 - 40 Teilungen ein. Dann endet die 42 replikative Lebensspanne einer Hefezelle – die dann letztendlich stirbt. https://www.klipfel.ch/Klipfel-Hefe-AG/die-Hefe/Geschichte/ http://pringlelab.stanford.edu/pictures.html https://www.google.com/imgres?imgurl=https%3A%2F%2Fwww.nasa.gov%2Fmission_pages%2Fstation%2Fresearch%2Fexperiments%2FYeast-GAP3.jpg&imgrefurl=http%3A%2F%2Fwww.nasa.gov%2Fmission_pages%2Fstation%2Fresearch%2Fexperiments%2F306.html&docid=m5yZGJ- B1i5KKM&tbnid=KClBC4UHSeOkxM%3A&vet=10ahUKEwiEgMrZ2sDkAhWD4YUKHR6oBesQMwhFKAUwBQ..i&w=611&h=515&bih=642&biw=1422&q=bud%20scar%20yeast&ved=0ahUKEwiEgMrZ2sDkAhWD4YUKHR6oBesQMwhFKAUwBQ&iact=mrc&uact=8 Seneszenz ▪ Replikative Senszenz: die endliche replikative Kapazität von sich mitotisch teilenden Zellen. ▪ Chronologische Seneszenz: endet mit dem Zelltod 43 Seneszenz beim Menschen 44 Seneszenz 45  Seneszenz 46 https://www.youtube.com/watch?v=0zRYr24Vhso  Das Hayflick-Limit ▪ Das Hayflick-Limit (1961) gibt an, wie oft sich eine normale menschliche Zellpopulation teilt, bis die Zellteilung aufhört ▪ Death by Design ▪ Hayflick zeigte zum ersten Mal, dass es sterbliche (normale) und unsterbliche (bösartige) Säugetierzellen gab. ▪ Auf molekularer Ebene bedeutet dies, dass sich die Telomere bei jeder neuen Zellteilung bis zu einer kritischen Länge verkürzen und die Zellen dann in eine Seneszenzphase eintreten. ▪ Embryonale Stammzellen exprimieren Telomerase, wodurch sie sich die Telomere verlängern und so weitere Teilungen möglich werden >>> bei 85-90% der Krebsarten ist die Telomerase aktiv. ▪ Bei Erwachsenen wird Telomerase nur in Zellen stark exprimiert, die sich regelmäßig teilen müssen, insbesondere in männlichen Samenzellen, aber auch in aktivierten Lymphozyten und bestimmten adulten Stammzellen, während andere somatische Zellen sie nicht exprimieren. ▪ In diesen Zellen nimmt die Telomerlänge während der Zellalterung allmählich ab. 47 https://raminphoto.wordpress.com/2013/07/03/leonard-hayflick-for-nature/  Fun fact ▪ 1963 gelang die Entwicklung des ersten Impfstoffes auf Basis der WI-38- Zelllinie, ein Polioimpfstoff, es folgten nach und nach Impfstoffe gegen Masern, Mumps, Röteln, Tollwut, Windpocken und Hepatitis A. ▪ Man schätzt, dass durch die Impfstoffentwicklung auf Basis der WI-38- Zelllinie bis 2015 weltweit ca. 4,5 Milliarden Menschen vor einer gefährlichen Infektion geschützt wurden. Ohne die Impfungen wären weltweit ca. 10,3 Millionen frühzeitig gestorben. WI-38 cells that he derived from aborted fetal lungs. The cells have been used to produce vaccines in use worldwide. 48 Wistar Institute for Anatomy and Biology in Philadelphia, Pennsylvania  Vererbte früher einsetzende Seneszenz Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Exposition gegenüber Tabakrauch während der Schwangerschaft, selbst bei SHS-Werten, die Verkürzung der Telomere bei Kindern beschleunigen und so die biologische Alterung bereits in jungen Jahren induzieren kann. leukocyte telomere length (LTL) Telomerlänge: Unterschied Mann – Frau 49 secondhand smoke (SHS) Telomeraseaktivität in den Hoden https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.135028 Das Werner Syndrom: Progeria adultorum Werner Syndrom: Eine autosomal rezessive Krankheit. 50  Das Werner Syndrom ▪ Helikasen sind eine Gruppe von Enzymen, deren Aufgabe die Modulation der Struktur von Nukleinsäuren ist. ▪ Sie trennen Basenpaare zwischen zwei RNA- bzw. DNA-Strängen und lösen Sekundärstrukturen von Nukleinsäuren auf. ▪ Damit sind sie wichtig für zelluläre Prozesse, wie die Replikation und Transkription. 51 Science, 2004 Progeria ▪ Das Krankheitsbild wurde erstmals 1886 von Jonathan Hutchinson und Hastings Gilford beschrieben. ▪ Auffälligstes Merkmal ist eine vorzeitige Vergreisung der betroffenen Kinder. ▪ Ursache: Falsche Prozessierung von Lamin A. 52 ▪ Mutation des Codons 608 GGC>GGT generiert neue Splice site...  Was passiert molekular beim Altern? Thomas Nyström 53 Jede Zelle hat dasselbe replikative Potenzial, Töchter alter Mütter ebenso wie Töchter junger Mütter  Was passiert molekular beim Altern? 54 Sgs1: RecQ family nucleolar DNA helicase Was passiert molekular beim Altern? 55 Was passiert molekular beim Altern? 56  Was passiert molekular beim Altern? ▪ The upstream activating factor (UAF) complex of the rRNA gene can also act as a transcriptional repressor at the SIR2 locus. ▪ Since the accumulation of ERCs (extrachromosomal rDNA circle) in the mother cell limits its RLS (replicative lifespan), sir2Δ and fob1Δ strains are short and long lived, respectively (8, 11). 57 ▪ Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase (Imai et al. 2000; Landry et al. 2000; Tanner et al. 2000) necessary for transcriptional silencing near telomeres (Aparicio et al. 1991), HM loci (Ivy et al. 1986; Rine and Herskowitz 1987), and rDNA (Bryk et al. 1997; Smith and Boeke 1997). ▪ Deletion of Sir2 increases both rDNA recombination (Gottlieb and Esposito 1989) and ERC formation while shortening life span by approximately 50% (Kaeberlein et al. 1999). 58 ▪ Conversely, overexpression of Sir2 increases life span by 30%–40%. Death by Design? NATURE· VOL 366. 2 DECEMBER 1993 59  Lebensverlängernde Maßnahmen? Kalorienrestriktion erhöht die gesunde Lebensdauer verschiedener Tiere Kalorienrestriktion (CR) ist die einzige nicht genetische Manipulation von Tieren, die die Lebenserwartung zuverlässig verlängert, indem sie sich auf die Alterungsrate auswirkt. CR-Tiere weisen auch eine verbesserte Anfälligkeit für eine Vielzahl pathologischer Erkrankungen auf, darunter Insulinresistenz, Typ-2-Diabetes und Krebs. 60 CR ist daher eine wichtige Intervention, die sowohl die Gesundheitsspanne als auch die Lebensdauer moduliert https://www.abdn.ac.uk/sbs/research/energetics/calorie-restriction-919.php  Fasten als lebensverlängernde Maßnahme 61 Nat Metab. 2021 October ; 3(10): 1327–1341. doi:10.1038/s42255-021-00466-9. Klausurfragen: ▪ In welche vier Phasen kann man den Zellzyklus unterteilen. Beschreiben Sie insbesondere Vorgänge, die in der S-Phase stattfinden (u.a. Spindelpolverdopplung, Ausbildung der Tochterzelle) sowie Prozesse, die zur Trennung von Mutter- und Tochterzelle bei Saccharomyces cerevisiae führen. ▪ Erklären Sie die Begriffe replikative und chronologische Lebensspanne. Nennen Sie molekulare Marker des Alterns und eine Strategie/Strategien zur Lebensverlängerung. ▪ Wie kann man die Gesamtzellzahl und die Lebendzellzahl einer Probe experimentell bestimmen? ▪ Zelle-Zell-Adhäsion bezeichnet man als Flockulierung. Wie machen wir uns Flockulierung bei Fermentationen zu Nutze? Wie funktioniert Flockulierung molekular? Welche Gene sind daran beteiligt? Wie kann man Flockulierung inhibieren? 62