Lagerbierhefe: Ursprung, Züchtung und Evolution - PDF

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 13 ORIGIN AND BREEDING OF LAGER YEAST URSPRUNG UND ZÜCHTUNG DER PILSNER-BIERHEFEN Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland...

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 13 ORIGIN AND BREEDING OF LAGER YEAST URSPRUNG UND ZÜCHTUNG DER PILSNER-BIERHEFEN Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland 1 Topic of the day LAGER YEAST: ▪ Hansen 1883 - Saccharomyces carlsbergensis ▪ Genomsequenzierung von S. carlsbergensis ▪ Hybrid-Bildung bei Saccharomyces ▪ Weinhefen 2 Woher kommt die Lagerbier-Hefe? ▪ Brauer wussten lange nichts über die Hefe. Bier wurde quasi spontan fermentiert. ▪ Das war seit Anbeginn aller Zeiten so – etwa seit 10.000 Jahren und endete mit den Klosterbrauereien im 8. Jahrhundert. ▪ Spontangärungen kann man heute immer noch finden, z.B. bei der Herstellung des Lambic Beers... ▪ Seit ~800 verstanden die Bruaer, dass etwas besonderes in ihrem Satz (beer slurry) war, obwohl Hefe selbst unerkannt blieb bis die Wissenschaft des 19. Jahrhunderts Licht in den Fermentationsprozess brachte. ▪ Aber in den alten Zeiten gab es bereits einen Berufsstand, der sich um die Lieferung eines guten Ansatzes zum Brauen kümmerte: den Hefner oder Häfner. ▪ Sein Job war es, die Hefe zu Ernten und für die nächste Fermentation aufzubereiten. ▪ Der Beruf des Hefners wurde im 19. Jahrhundert überflüssig – von der Wissenschaft wegrationalisiert. 3 Woher kommt die Lagerbier-Hefe? ▪ Die Bedeutung der Spaten-Brauerei ▪ Die wichtigste Brauerei in Deutschland für die Entwicklung der Herstellung von untergärigem Bier war Spaten. ▪ Spaten begann als Brauhaus 1397 in der Münchner Altstadt, benannt nach George Spaeth, der in 1622 der Besitzer wurde. ▪ Die wichtigste Familie war die Familie Sedlmayr. Gabriel Sedlmayr I übernahm die Brauerei 1807. 4 Gabriel Sedlmayr Gabriel Sedlmayr der Jüngere - 1839 26.02.1811 - 01.10.1891 Sedlmayr übers Belgische Bier ▪ In Belgien, genauer in Leuven, wollte ihnen das Bier nicht so recht schme- cken: ▪ Gabriel Sedlmayr der Jüngere: ▪ „allwo der pieterman, ein starkes ziemlich braunes Bier von süßsäuerlichem Geschmack und das etwas leichtere helle weiße Löwenbier gebraut wur- den, jedes aber dick, wie man sich nur dickes denken kann, … der sog. Bittermann, eine Gattung Bier, die man auch nur dort machen zu können wähnt https://belgiancraftbeers.com/de/Produkt/Pate/ ▪ … ist das non plus ultra des schlechten Bieres. ▪ Und das ist beiläufig ein Bild der gepriesenen Belgischen Biere.“ ▪ Der Peeterman ist das historische Bier der Leuvener, der Pietermannen. Das ungefilterte Bier mit 6% Alkohol zeichnet sich unter anderem durch seine Frische und seinen leicht sauren Charakter durch den Weizen aus. 5 Evolution von Saccharomyces carlsbergensis clade Saccharomyces eubayanus 1 WGD Saccharomyces cerevisiae Naumovia castellii 3 Vanderwaltozyma polyspora 6 Lachancea thermotolerans Lachancea waltii 10 Hybrid Lachancea kluyveri Ashbya gossypii 12 Eremothecium cymbalariae Alloploid/ Aneuploid ▪ Tetraploid: ▪ Die Hybridstruktur und Aneuploidie von Lagerhefen führt zu Irregularitäten in der Meiose. Non-GMO Yeast ▪ Die Folge sind schlechte Breeding Sporulationsfrequenzen und geringe Lebensfähigkeit der Sporen. 6 Die Suche nach dem 2. Elternteil 7 Libkind et al. 2011 ▪ Domestication of plants and animals promoted humanity’s transition from nomadic to sedentary lifestyles, demographic expansion, and the emergence of civilizations. ▪ In contrast to the well-documented successes of crop and livestock breeding, processes of microbe domestication remain obscure, despite the importance of microbes to the production of food, beverages, andbiofuels. ▪ Lagerbeer, first brewed in the 15th century, employs an allotetraploid hybrid yeast, Saccharomyces pastorianus (syn. Saccharomyces carlsbergensis), a domesticated species created by the fusion of a Saccharomyces cerevisiae ale-yeast with an unknown cryotolerant Saccharomyces species. ▪ We report the isolation of that species and designate it Saccharomyces eubayanus sp. nov. because of its resemblance to Saccharomyces bayanus (a complex hybrid of S. eubayanus, Saccharomyces uvarum, and S. cerevisiae found only in the brewing environment). ▪ Individuals from populations of S. eubayanus and its sister species, S. uvarum, exist in apparent sympatry in Nothofagus (Southern beech) forests in Patagonia, but are isolated genetically through intrinsic postzygotic barriers, and ecologically through host-preference. ▪ The draft genome sequence of S. eubayanus is 99.5% identical to the non-S. cerevisiae portion of the S. pastorianus genome sequenceand suggests specific changes in sugar and sulfite metabolism that were crucial for domestication in the lager-brewing environment. ▪ This study shows that combining microbial ecology with comparative genomics facilitates the discovery and preservation of wild genetic stocks of domesticated microbes to trace their history, identify genetic changes, and 8 suggest paths to further industrial improvement. Eine neue Hefeart wurde gefunden...aber... Das kann nicht ein Elternteil der Lagerbier-Hefen gewesen sein ▪ Lager-Bier, zuerst im Mittelalter, im 15 Jhrd. gebraut....Kolumbus....1492... ▪ Es kann nicht sein, dass diese Hefe aus Patagonien den Weg nach Europa gefunden hat, um dort bei der Herstellung des Lagerbiers mitzuwirken. 9 Die Marco Polo Hefe ▪ Recently, a Patagonian origin hypothesis of lager yeast has been proposed based on the discovery of a new cryotolerant Saccharomyces species from Patagonian native forests of Argentina. ▪ This yeast, named S. eubayanus, exhibited the closest known match (99.56%) to the non-ale portion of lager yeast and, thus, was believed to be its progenitor. ▪ However, we now show that this yeast species is likely native to the Tibetan Plateau. ▪ One of the Tibetan populations of the species exhibits closer affinity with lager yeast than the Patagonian population as inferred from population genetics and genome sequence analyses. ▪ We thus provide strong evidence for a Far East Asian origin hypothesis of lager yeast, which apparently corresponds better with geography and world trade history. 10 Marco Polo Marco Polo: 1254 – 08.01.1324 Interessanterweise hinterließ Polo fast alles seiner Frau und seinen drei Töchtern und brach damit mit dem Brauch, dass Männer ohne Söhne ihren Besitz einem männlichen Mitglied der Großfamilie überließen. Pietro Tartaro freigelassen. 11 https://postausitalien.com/2019/11/26/marco-polo-und-der-erste-bestseller-der-geschichte/ https://puzzlefactory.pl/de/puzzle/spielen/leute/300799-marco-polo https://www.meisterdrucke.de/kunstdrucke/Italian-School/41708/Das-Testament-von-Marco-Polo,-geschrieben-1324.html 12 Der Ursprung der Lagerbier-Hefe Max Wachstums- temperatur Saccharomyces cerevisiae 41-42° Saccharomyces paradoxus 37-38° Saccharomyces mikatae 37-38° Lager Yeast Saccharomyces jurei 36-37° Hybrid Saccharomyces arboricola 34-35° Saccharomyces kudriavzevii 33-34° Saccharomyces eubayanus 34-35° Saccharomyces uvarum 34-35° 13 Die Lagerbier-Hefe oder viele ?? Louis Pasteur 1876 Die Bierkrankheit wird durch Mikroorganismen, speziell durch Bakterien verursacht Louis Pasteur 1822 – 1895 14 Die Lagerbier-Hefe oder viele ?? 1876 De danske Gjødningssvampe. Louis Pasteur vs Emil Chr. Hansen Emil Chr. Hansen 1842- 1909 Carlsberg Laboratorium Hansen: Die Bierkrankheit wird durch Hefen verursacht 15 https://www.beerbooks.com/cgi/ps4.cgi?action=enter&thispage=1299&order_id=!ORDERID!&affid=1009 https://openlibrary.org/books/OL24165461M/%C3%89tudes_sur_la_bi%C3%A8re Die Lagerbier-Hefe oder viele ?? 16 https://www.wissenschaft-aktuell.de/extra_rubriken/Was_Sie_schon_immer_ueber_Mikroben_wissen_wollten.html Das Carlsberg Laboratorium 1908 1870 1888 Emil Chr. Hansen, 1879-1909 Er etablierte die Hefereinkultur Carlsberg Unterhefe No1 – Saccharomyces carlsbergensis 1883 Carlsberg Laboratorium 17 Saccharomyces carlsbergensis Emil Chr. Hansen 1842- 1909 Carlsberg Laboratorium 18 Wie haben Hefe-Reinkulturen die Fermentation verbessert? Frage an perplexity.ai Kontrolle und Konsistenz Hefe-Reinkulturen ermöglichen eine präzise Kontrolle über den Fermentationsprozess. Indem man mit einer kleinen Menge einer spezifischen Hefereinkultur - dem Inokulum - beginnt, kann man den gesamten Prozess besser steuern. Konsistente Produktqualität: Die Verwendung derselben Hefereinkultur gewährleistet gleichbleibende Eigenschaften des Endprodukts. Vorhersehbarkeit: Der Fermentationsverlauf wird besser planbar und reproduzierbar. 19 Wie haben Hefe-Reinkulturen die Fermentation verbessert? Effizienz und Ausbeute Reinkulturen haben die Effizienz der Fermentation deutlich gesteigert Optimierte Nährstoffverwertung: Reinkulturen können gezielt auf die effiziente Nutzung bestimmter Nährstoffe gezüchtet werden. Höhere Biomasse-Ausbeute: Durch aerobe Fermentation und optimierte Bedingungen wird eine maximale Vermehrung der Hefezellen erreicht 20 https://pixabay.com/de/illustrations/fragezeichen-frage-antwort-1019820/ Wie haben Hefe-Reinkulturen die Fermentation verbessert? Vermeidung von Kontaminationen Der Einsatz von Reinkulturen reduziert das Risiko von unerwünschten Mikroorganismen: Sterilität: Die ersten Vermehrungsstufen erfolgen unter sterilen Bedingungen, was Fremdorganismen ausschließt. Schnelles Wachstum: Hohe Konzentrationen der Reinkultur unterdrücken das Wachstum etwaiger Kontaminanten 21 Wie haben Hefe-Reinkulturen die Fermentation verbessert? Anpassungsfähigkeit Reinkulturen können für spezifische Anwendungen optimiert werden: Maßgeschneiderte Eigenschaften: Hefestämme können für bestimmte Produkte oder Prozesse selektiert und gezüchtet werden. Verbesserte Produktqualität: Die Auswahl geeigneter Stämme ermöglicht eine höhere Reinheit und Qualität des Endprodukts. Durch diese Verbesserungen haben Hefe-Reinkulturen die industrielle Fermentation revolutioniert und zu einer deutlichen Steigerung von Qualität, Effizienz und Kontrolle in verschiedenen Bereichen wie der Backhefe-Produktion, Brauerei und Biotechnologie geführt. 22  ▪ Als Nachfolger von Professor Hermann Müller (Thurgau) wurde er 1891 bis 1903 Leiter der Pflanzenphysiologischen Versuchsstation in Geisenheim. ▪ 1903 wurde er dort zum Professor und Vorstand der Pflanzenpysiologischen Versuchsstation ernannt. ▪ Wortmanns Forschungsschwerpunkt in Geisenheim war die Gärungsphysiologie. ▪ Er erkannte frühzeitig den praktischen Wert einer wissenschaftlich fundierten Gärungskunde. ▪ Er gründete 1894 am Standort Geisenheim die erste Hefereinzuchtstation. ▪ Diese Station leitete er bis zum Jahre 1924. 23 1856-1926 Evolution von Saccharomyces carlsbergensis 1845 1880s 2014 24 Das Carlsberg Laboratorium: Lager Yeast Saccharomyces carlsbergensis – Unterhefe No1 1845 1880s 2014 Saccharomyces carlsbergensis 1883 (CBS1513: deposited 1947) Carlsberg Laboratorium 25 Genomik von Lagerhefen Chromosomenumlagerungen S. cerevisiae Chromosomenverlust S. eubayanus Saccharomyces carlsbergensis 26 Ploidie von Lagerhefen 140 BY4741 – 1n 120 BY4743 – 2n 100 CBS 1513 Cell counts 80 Weihenstephan 60 40 20 0 100 200 300 400 500 600 DNA content Group I: S. carlsbergensis (CBS 1513) ~ 3n Group II: Weihenstephan ~ 4n 27 Hybride: besser als die Elternstämme Hybrid vigor ist die Steigerung bestimmter Charakteristika wie Wachstumsrate, Größe, Fertilität, Ertrag etc. eines Hybrides im Vergleich zu seinen Eltern. Hybrid vigor wird oft auch als Heterosis bezeichnet. Die genauen Ursachen sind unbekannt, aber die Neukombination von Genen ermöglicht es. 28 https://www.scienceabc.com/nature/what-is-hybrid-vigor-definition-examples-and-a-brief-explanation.html Hybride haben postzygotische Fertilitätsprobleme >>> Sterilität 29 https://evaprofecmc.jimdo.com/unit-3-the-origin-and-evolution-of-life/4-formation-of-new-species/ Hybride haben postzygotische Fertilitätsprobleme >>> Sterilität 30 https://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/32-chromosomes/chromosome-number.html  Chromosomenzahländerungen Beflügeln die Speziation = Artbildung n 48 48 48 46 48 48 31 https://www.quora.com/Was-there-a-point-in-evolution-where-a-primate-had-a-human-as-a-child https://slidetodoc.com/bio-115-ecology-and-evolution-human-evolution-haploid-2/ Genomik von Lagerhefen Chromosomenumlagerungen S. cerevisiae Chromosomenverlust S. eubayanus Saccharomyces carlsbergensis 32 Genomik von Lagerhefen CHR I CHR II CHR III CHR IV CHR V CHR VI CHR VII CHR VIII Sc-type subgenome CHR IX Se-type subgenome Se II-IV translocation CHR X Se VIII-XV translocation CHR XI Sc V-XI translocation CHR XII CHR XIII CHR XIV Unterhefe 1 CHR XV WS34/70 Σ 47 CHR Σ 66 CHR CHR XVI 33 Genomik von Lagerhefen CHR I CHR II CHR III CHR IV CHR V CHR VI CHR VII CHR VIII Sc-type subgenome CHR IX Se-type subgenome Se II-IV translocation CHR X Se VIII-XV translocation CHR XI Sc V-XI translocation CHR XII CHR XIII CHR XIV Unterhefe 1 CHR XV WS34/70 Σ 47 CHR Σ 66 CHR CHR XVI 34 Genomik von Lagerhefen CHR I CHR II CHR III CHR IV CHR V CHR VI CHR VII CHR VIII Sc-type subgenome CHR IX Se-type subgenome Se II-IV translocation CHR X Se VIII-XV translocation CHR XI Sc V-XI translocation CHR XII CHR XIII CHR XIV Unterhefe 1 CHR XV WS34/70 Σ 47 CHR Σ 66 CHR CHR XVI 35 Genomik von Lagerhefen Genome Sequence of Saccharomyces carlsbergensis, the World’s First Pure Culture Lager Yeast Andrea Walther, Ana Hesselbart, and Jürgen Wendland Ploidie: ▪ Lager Yeasts: 2014 Saaz: 3n - triploid Frohberg: 4n - tetraploid ▪ Wine Yeasts: 2n –diploid ▪ Ale/Stout Yeasts: 2n - diploid Molecular Yeast Breeding Carlsberg Laboratorium 36 Yeast Breeding 37 Yeast Breeding ▪ Improving ale or lager yeasts by conventional breeding is a non-trivial task. ▪ Domestication of lager yeasts, which are hybrids between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces eubayanus, has led to evolved strains with severely reduced or abolished sexual reproduction capabilities, due to, e.g. postzygotic barriers. ▪ On the other hand, S. cerevisiae ale yeasts, particularly Kveik ale yeast strains, were shown to produce abundant viable spores (~ 60%; Dippel et al. Microorganisms 10(10):1922, 2022). ▪ This led us to investigate the usefulness of Kveik yeasts for conventional yeast breeding. ▪ Surprisingly, we could isolate heterothallic colonies from germinated spores of different Kveik strains. ▪ These strains presented stable mating types in confrontation assays with pheromone- sensitive tester strains. ▪ Heterothallism was due to inactivating mutations in their HO genes. ▪ These led to amino acid exchanges in the Ho protein, revealing a known G223D mutation and also a novel G217R mutation, both of which abolished mating type switching. 38 Yeast Breeding ▪ We generated stable MATa or MATα lines of four different Kveik yeasts, named Odin, Thor, Freya and Vör. ▪ Analyses of bud scar positions in these strains revealed both axial and bipolar budding patterns. ▪ However, the ability of Freya and Vör to form viable meiotic offspring with haploid tester strains demonstrated that these strains are haploid. ▪ Fermentation analyses indicated that all four yeast strains were able to ferment maltose and maltotriose. ▪ Odin was found to share not only mutations in the HO gene, but also inactivating mutations in the PAD1 and FDC1 genes with lager yeasts, which makes this strain POF-, i.e. not able to generate phenolic off-flavours, a key feature of lager yeasts. ▪ These haploid ale yeast-derived strains may open novel avenues also for generating novel lager yeast strains by breeding or mutation and selection utilizing the power of yeast genetics, thus lifting a block that domestication of lager yeasts has brought about. 39 Yeast Breeding ▪ On the other hand, S. cerevisiae ale yeasts, particularly Kveik ale yeast strains, were shown to produce abundant viable spores (~ 60%; Dippel et al. Microorganisms 10(10):1922, 2022). 40 Yeast Breeding 41 Yeast Breeding 42 Yeast Breeding ▪ Surprisingly, we could isolate heterothallic colonies from germinated spores of different Kveik strains. ▪ These strains presented stable mating types in confrontation assays with pheromone-sensitive tester strains. MATa, MATa, bar1 bar1 a α a α α a α a MATa, MATa, sst2 sst2 43 Yeast Breeding A B 1-2D 1-8A 1-17A 2-25D 2-3B 2-10A 3-8c α α a a C D 2-15A 4-11D α α a a 44 E Yeast Breeding Mating-type PCR mit drei Primern: Fw – a: wenn ein MATa Locus vorhanden ist Fw- a: wenn ein MATa Locus vorhanden ist. E Odin Thor Freya Vör a 2D 8A 17A 3B 10A 15A 25D 8C 11 D MATa MATa Fw GYBC GYBC GYBC GYBC GYBC GYBC GYBC GYBC GYBC 244 246 249 252 254 256 259 263 274 a Fw 45 Yeast Breeding ▪ Heterothallism was due to inactivating mutations in their HO genes. ▪ These led to amino acid exchanges in the Ho protein, revealing a known G223D mutation and also a novel G217R mutation, both of which abolished mating type switching. A 1 T189A G223S L405S H475L 586 S HO - YDL227C CTT GGT CTG TGG TTA GGT GAC AGT 46 Yeast Breeding ▪ Heterothallism was due to inactivating mutations in their HO genes. ▪ These led to amino acid exchanges in the Ho protein, revealing a known G223D mutation and also a novel G217R mutation, both of which abolished mating type switching. 47 Yeast Breeding: Odin close to lager yeast S.c. equivalent 48 Yeast Breeding ▪ We generated stable MATa or MATα lines of four different Kveik yeasts, named Odin, Thor, Freya and Vör. ▪ Analyses of bud scar positions in these strains revealed both axial and bipolar budding patterns. A B C 1n – axial 2n – bipolar budding pattern budding pattern Odin 17A Thor 25D D E F 49 Thor 10A Freya 8C Vör 11D Yeast Breeding ▪ However, the ability of Freya and Vör to form viable meiotic offspring with haploid tester strains demonstrated that these strains are haploid. A C 1 BY4741 (B006) Freya 8C, MATa kanMX, leu2 X G418 sensitive, LEU2 2 3 4 MATa/MATa, 5 kanMX, LEU2 B D BY4742 (B013) Vör 11D, MATa 1 kanMX, leu2 X G418 sensitive, LEU2 2 3 4 MATa/MATa,.1.2.3.4 kanMX, LEU2 50 Yeast Breeding 51 Yeast Breeding ▪ Fermentation analyses indicated that all four yeast strains were able to ferment maltose and maltotriose. ▪ Odin was found to share not only mutations in the HO gene, but also inactivating mutations in the PAD1 and FDC1 genes with lager yeasts, which makes this strain POF-, i.e. not able to generate phenolic off-flavours, a key feature of lager yeasts. 52 Wie war das mit POF-? Pad1 bindet FMN (Flavin-Mono- Ferulic acid decarboxylase Nukelotid) und ist Ein Cofactor, der für die Aktivität von Fdc1p benötigt wird 53 Pad1/Fdc1 54 Yeast Breeding ▪ Fermentation analyses indicated that all four yeast strains were able to ferment maltose and maltotriose. ▪ Odin was found to share not only mutations in the HO gene, but also inactivating mutations in the PAD1 and FDC1 genes with lager yeasts, which makes this strain POF-, i.e. not able to generate phenolic off-flavours, a key feature of lager yeasts. 55 Yeast Breeding 56 Klausurfragen: ▪ Emil Christian Hansen isolierte die erste Reinkultur-Lagerhefe. Wann? Welche? Warum war das wichtig (vorher – nachher Vergleich)? Welche Auswirkungen hatte seine Forschung auf die Fermentations-industrie? Und welche auf die Milch- und Weinindustrie? ▪ Hybridisierung führte zur Bildung von Pilsbierhefen / lager yeasts. Welcher Vorteil lag in dieser Hybridisierung? Wie könnte man dies für die Bildung neuer Weinhefen ausnutzen? ▪ Wie entsteht das phenolic off-flavor bei POF+ Hefen? ▪ Welche Vorteile liefern haploide, heterothallische Bier/Wein-Hefen für die Züchtung? 57  58 58 Enjoy your beer