Mikrobiologie Vorlesung: S. cerevisiae & Lebenszyklus PDF

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 5 S. cerevisiae Lebenszyklus, Knospungsmuster, Paarungstypwechsel Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland...

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 5 S. cerevisiae Lebenszyklus, Knospungsmuster, Paarungstypwechsel Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland 1 Topics of the day Hefe-Genetik Hefe Lebenszyklus 2 The awesome power of yeast genetics Zygotenbildung Pheromone a a a a a/a Shmoo a a Mitotische a/a Mitotische Teilungen a a Teilungen 2n a a 1n 1n diploide a a a a a/a a/a a-Zelle a-Zelle a/a-Zelle a/a a/a a a a/a Meiose a a Ascus mit a 4 Ascosporen Gekeimte Ascosporen a Wikipedia 3 S. cerevisiae Lebenszyklus 1. Es gibt a-Zellen, a-Zellen und a/a-Zellen a a a/a 2. Alle drei Zelltypen können sich durch Knospung vermehren 3. Unterschiede der Zelltypen: Haploide Zellen: a-Zellen, a-Zellen und Sporen Diploide Zellen: a/a-Zellen 4. Der Zelltyp wird durch den MAT-Lokus bestimmt. CHR III HML MAT HMR 4 Geschlechter-Determinierung bei Säugern SRY: Sex-determining Region Y 5 Geschlechter-Determinierung bei Säugern ▪ Die Geschlechtsbestimmung erfolgt zum Zeitpunkt der Empfängnis, wenn der Embryo von der Mutter und dem Vater entweder zwei X-Chromosomen (weiblicher Embryo) oder ein X- Chromosom von der Mutter und ein Y-Chromosom vom Vater (männlicher Embryo) erhält. ▪ Wenn der sich entwickelnde Embryo ein Y-Chromosom hat, enthält dieses Chromosom die geschlechtsbestimmende Region des Y-Chromosoms (SRY-Gen), die früh in der Entwicklung in bestimmten Geweben, insbesondere den undifferenzierten Gonaden, exprimiert wird. ▪ SRY kodiert für den Hoden-bestimmenden Faktor, der die Gonaden in einem frühen Entwicklungsstadium (ab der 7. Woche) in einen Hoden differenziert. ▪ In Abwesenheit von SRY (und dem Y-Chromosom) bei Frauen differenzieren sich die Gonaden in Eierstöcke. ▪ Später beginnen die Hoden, Testosteron und Dihydrotestosteron (DHT) abzusondern, die den Körper und das Gehirn in einen männlichen Phänotyp differenzieren. ▪ SRY kodiert für einen Transkriptionsfaktor ▪ Der Default-Pathway führt zur Bildung eines weiblichen Individuums 6 S. cerevisiae Lebenszyklus 1. Es gibt a-Zellen, a-Zellen und a/a-Zellen a a a/a 2. Alle drei Zelltypen können sich durch Knospung vermehren 3. Unterschiede der Zelltypen: Haploide Zellen: a-Zellen, a-Zellen und Sporen Diploide Zellen: a/a-Zellen 4. Der Zelltyp wird durch den MAT-Lokus bestimmt. CHR III HML MAT HMR 5. Zelltypen entstehen durch Masterregulatoren des MAT-Lokus Eine a-Zelle trägt MATa Eine a-Zelle besitzt MATa Eine diploide Zelle besitzt sowohl MATa als auch MATa. 7 S. cerevisiae Lebenszyklus 6. Im MAT-Lokus finden sich zelltypspezifische Regulatorgene: a1 im MATa a1 und a2 in MATa. 7. Die Gene im MAT-Lokus werden exprimiert/transkribiert, während die Gene in den HML und HMR Loci reprimiert (‚gesilenced‘) sind. 8 S. cerevisiae Lebenszyklus 8.) Was macht eine a Zelle zur a Zelle, Was macht eine a Zelle zur a Zelle? Der Paarungstyp-Locus (Mating type/MAT-locus) in sonst isogenen, d.h. genetisch identischen, Stämmen bestimmt die Zellidentität einer Hefezelle. Eine Zelle ist eine a Zelle, wenn sie im MAT-Locus die Information MATa trägt (bzw. in S. cerevisiae, wenn kein MATa vorhanden ist; sprich: man kann MATa deletieren und diese Zelle ist immer noch phänotypisch eine a-Zelle) Eine Zelle ist eine a Zelle, wenn sie im MAT-Locus die Information MATa trägt. Diploide Zellen tragen beide MAT-Loci: sie sind MATa/MATa 9 Regulation der Zellidentität durch die Paarungstyploci in Saccharomyces cerevisiae MATa a ▪ Eine Zelle, die MATa im aktiven MAT-Lokus trägt, ist eine a-Zelle und paart sich als a-Zelle. ▪ Das a1 Protein schaltet in dieser Zelle die a-spezifischen Gene (asg) an. ▪ Das a2 Protein schaltet in dieser Zelle die a-spezifischen Gene (asg) ab. ▪ Der Repressor of Meiosis, kodiert durch RME1, asg verhindert den Eintritt in die Meiose. Damit kann eine a-Zelle sich paaren, aber nicht sporulieren. 10 Regulation der Zellidentität durch die Paarungstyploci in Saccharomyces cerevisiae MATa a ▪ Eine Zelle, die MATa im aktiven MAT-Lokus trägt, ist eine a-Zelle und paart sich als a-Zelle. ▪ MATa kodiert für ein Protein, a1, das jedoch nicht benötigt wird, um a-spezifischen Gene (asg) anzuschalten. ▪ Asg sind demnach in S. cerevisiae konstitutiv an. ▪ Die a-spezifischen Gene sind nicht aktiv, da a1 fehlt. asg ▪ Der Repressor of Meiosis, kodidert durch RME1, verhindert den Eintritt in die Meiose. Damit kann eine a-Zelle sich paaren, aber nicht sporulieren. 11 Regulation der Zellidentität durch die Paarungstyploci in Saccharomyces cerevisiae a/a a/a ▪ Eine MATa/a Zelle, hat beide MAT-Loci, da sie 2 Kopien von CHRIII besitzt, die von den Eltern stammen. ▪ In MATa/a Zellen wird das heterodimer aus a1 und a2 gebildet. ▪ Der a1/a2 Repressor schaltet a1 ab. Damit werden die asg nicht aktiviert. Ebenso werden haploid-spezifische Gene (hsg) reprimiert. ▪ Der a2 Repressor schaltet die a-spezifischen Gene ab. hsg ▪ Dadurch kann sich eine MATa/a Zelle nicht paaren. ▪ RME1 ist ein hsg. Damit ist in diploiden Zellen der Weg frei zur Sporulation unter entsprechenden Umweltbedingungen RME1 Repressor of Meiosis 12 HO Homothallismus Die Logik Zelltyp-spezifischer Regulation und deren Entwicklung in Saccharomyces cerevisiae ▪ In Candida albicans finden wir eine a-Zellen ursprüngliche Logik: ▪ a-spezifische Gene werden durch a2 angeschaltet ▪ a-spezifische Gene werden durch a1 a-Zellen angeschaltet ▪ In diploiden Zellen schaltet das Heterodimer aus a1/a2 sowohl a- als auch a-spezifische Gene aus. a/a-Zellen 13  Die Logic Zelltyp-spezifischer Regulation und deren Entwicklung in Saccharomyces cerevisiae Evolutionsschritte in S. cerevisiae: ▪ Das a2 Gen ging verloren. ▪ Die von a2 regulierten Gene wurden in a- Zellen konstitutiv exprimiert ▪ Die a-spezifischen Gene wurden von a2 reprimiert. Der Zweck bleibt derselbe! MAT-Loci in S. cerevisiae und in Candida albicans regulieren die Zelltyp-Identität. 14 The awesome power of yeast genetics 9. Was geschieht bei der Knospung? 10. Mating type switching – Paarungstypwechsel – wofür eigentlich? 11. Paarung von Hefezellen 12. Sporulation von Hefezellen 13. Wie werden Organelle vererbt 15 The awesome power of yeast genetics 9. Was geschieht bei der Knospung? Zygotenbildung Pheromone a a a a a/a Shmoo a a Mitotische a/a Teilungen a Mitotische Teilungen a 2n a a diploide 1n 1n a/a a a a a/a-Zelle a/a a-Zelle a a-Zelle a/a a/a a a a/a Meiose a a Ascus mit a 4 Ascosporen Gekeimte Ascosporen a 16 S. cerevisiae Lebenszyklus 17 Saccharomyces cerevisiae Knospungsmuster bei Saccharomyces cerevisiae 18  Knospungsmuster bei Saccharomyces cerevisiae Knospungsnarben/ bud scars entsprechen den Septen filamentöser Pilze 19 A,B: Saccharomyces cerevisiae; C,D: Candida albicans; E,F: Ashbya gossypii Septierung in Ashbya gossypii 20  Knospungsmuster bei Saccharomyces cerevisiae ▪ Haploide Hefezellen: Axiales Knospungsmuster – axial budding pattern ▪ Diploide Hefezellen: Bipolares Knospungsmuster – bipolar budding pattern Axial Bipolar A B 1n = haploid 2n = diploid 21 Bud scars/Knospennarben wurden mit Calcofluor White angefärbt und mittels Fluoreszenz-Mikroskopie aufgenommen Knospungsmuster bei Saccharomyces cerevisiae 22 Knospungsmuster bei Saccharomyces cerevisiae Haploide Saccharomyces cerevisiae: axial budding 23 Knospungsmuster bei Saccharomyces cerevisiae Diploide Saccharomyces cerevisiae: bipolar budding 24  Knospungsmuster bei Saccharomyces cerevisiae Axl1 wird benötigt, um das axiale Knospenmuster zu erzeugen. Wird AXL1 in diploiden Zellen exprimiert, knospen diese Zellen nach dem axialen Muster. Bud3 und Bud4 werden für die Lokalisierung von Axl1 am bud neck benötigt. Bud8, Bud9 sind am distalen und proximalen Pol lokalisiert. Bud3, Bud4, Bud8, Bud9, Axl1, Axl2/Bud10 Rax1, Rax2 AXL1 ist ein haploi- spezifisches Gen, d.h. es wird nur in 1n Bud5 Zellen exprimiert GDP GEF GTP Bud1 Bud1 GAP Bud2 Bem1 Cdc24 GEF GDP GTP Cdc42 Cdc42 GAP Die Wiederverwendung alter effector proteins Bem2/Bem3 Knospungsstellen wird durch Bni1, Cla4, Ste20, Las17 RGA1, RAX1 und RAX2 25 unterbunden. Saccharomyces cerevisiae: Zellen mit Gedächtnis Die Wiederverwendung alter Knospungsstellen wird durch RGA1, RAX1 und RAX2 unterbunden. RGA1: GTPase-activating protein for polarity-regulator Cdc42p (RhoGAP); required for proper bud site selection; transiently localizes to previous cell division sites (bud scars; cytokinesis remnants), interacting with Nis1p and Nba1p, to prevent Cdc42p repolarization; 26 Saccharomyces cerevisiae: Zellen mit Gedächtnis TEM transverse (top view) and longitudinal (side view) sections of nba1D cells with four 27 collars at the bud-neck region, as indicative of recurrent rebudding at the same location. Saccharomyces cerevisiae: Zellen mit Gedächtnis (B) Survival probability curves of wild-type (WT, n = 47), nba1D (n = 36), rga1D (n 28 = 25), and nba1D rga1D (n = 21) cells. The median survival is indicated. All mutants display a significantly reduced longevity compared to WT (p < 0.001  Microbe of the day Hanseniaspora uvarum - Kloeckera appiculata ▪ ist die am häufigsten vorkommende natürliche Hefe auf Trauben und Früchten: 50-90% ▪ ist eine apiculate Hefe; (1.5-5.0)x(2.5-11.5)µm ▪ Hanseniaspora erzeugt sehr große Mengen an Essigsäure (2x) und Ethylacetat (5x im Vergleich zu S. cerevisiae) – Lösungsmittelgeruch, nail polish ▪ Angärhefe: kommt häufig im Most vor und trägt so am Anfang der Gärung zum Bukett bei ▪ Ist diploid – Sporenbildung? ▪ Die Gattung teilt sich in zwei Gruppen auf: die schnell evolvierende Linie (FEL) die vor ca 87 Mio. Jahren entstand und eine langsamere Entwicklungslinie (52 mya). 29 Fermentation 2021, 7, 162. https://doi.org/10.3390/fermentation7030162 doi.org/10.3390/fermentation9020109 doi.org/10.3390/ ijms24031859 Hanseniaspora uvarum ▪ Produziert mehrere extrazelluläre enzymatische Aktivitäten von önologischer Relevanz (Pektinase, Chitinase, Protease, β-Glucosidase). ▪ H. uvarum wird als Schaderreger im Most angesehen. ▪ In letzter Zeit wurde eine Reihe von Co-Fermentierungsversuchen unternommen, um interessantere Aromen im Wein darzustellen. ▪ Produziert recht viel flüchtige Säure (> 600 mg/L). 30 Hanseniaspora uvarum – apikulate Hefe mit terminaler Knospung Figure 2. A phylogenetic tree of members of the genus Hanseniaspora. Using maximum-likelihood analysis of the internal transcribed sequences of one representative of each Hanseniaspora species divides the genus into two large clades, a fast-evolving fruit clade and a slow-evolving fermentation clade. MEGA 11 software was used to draw the tree. 31 Hanseniaspora uvarum – apikulate Hefe mit terminaler Knospung 32  CDC42: Establishment of cell polarity Lokalisierung von Cdc42 während des Knospungsprozesses. Positional landmarks / spatial cues (= Bud proteine; rot) rekrutieren Cdc42 (blau) an den Ort, an dem die nächste Knospe gebildet wird. 33 https://link.springer.com/article/10.1007/s42967-022-00240-y  CDC42: Establishment of cell polarity Zellpolarität bei Saccharomyces cerevisiae. ▪ Bei S. cerevisiae wird Cdc42 in der späten G1-Phase an einer einzelnen Stelle polarisiert. ▪ An dieser Stelle bildet sich ab der S-Phase eine Knospe. ▪ Cdc42 wird in der Tochterzelle in G2 depolarisiert und konzentriert sich am bud neck (Knospungshals) während der Zytokinese. 34 doi:10.1146/annurev-cellbio-100616-060856. Zelluläre Schalter: G-Proteine Gpa1 Sst2 35  G-Proteine: Zelluläre Schalter Bud5 GEF GDP GTP Bud1 Bud1 GAP Bud2 Cdc24 GEF GDP GTP Cdc42 Cdc42 GAP Bem2/Bem3 GEF= Guanin-nucleotide Exchange Factor Effektor-Proteine >>> Aktinzytoskelett GAP= GTPase Activating Protein Deletionen von CDC24 oder CDC42 sind lethal. 36  The Ras oncogene In 20%-30% aller menschlichen Tumore treten Punktmutation im ras Gen auf; in Pankreaskarzinomen bis zu 90%. ▪ Die Punktmutationen der ras-Gene führen allesamt zum Verlust der GTPase-Aktivität von Ras, die auch in Gegenwart von GTPase aktivierenden Proteinen (GAP) nicht mehr angeregt werden kann. ▪ Damit ist der Wechsel von der GTP-gebundenen Form zur GDP-Form blockiert. ▪ Dies führt zu einer konstitutiven Aktivität von aktivem Ras und damit zu einem permanenten wachsstumsstimulierenden Signal in der Zelle. EGF: Epidermal growth factor EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor 37 DOI: 10.1016/j.gendis.2014.10.002 https://www.animierte-gifs.net/cat-radfahren-1125.htm  G-Proteine: post-translationale Modifikation 38 https://www.jbc.org/article/S0021-9258(18)40732-6/fulltext The awesome power of yeast genetics 10. Mating type switching – Paarungstypwechsel – wofür eigentlich? 39 Mating type switching - Paarungstypwechsel In der Natur sind Saccharomyces Zellen durchweg diploid. S. cerevisiae evolvierte einen spezielen Weg, die Einsamkeit zu überwinden: den Paarungstyp-Wechsel! 40 Mating type switch und axiales Knospungsmuster Das axiale Knospungsmuster hilft haploiden Zellen, besser zu diploidisieren. 41 Mating type switch und axiales Knospungsmuster ▪ Eine haploide Spore keimt und bildet eine Zelle. Hier eine a- Zelle. ▪ Nach der ersten Zellteilung kann nur die Mutterzelle ihren Paarungstyp und damit die Zellidentität wechseln. ▪ Mutter und Tochter teilen sich u.U. erneut. ▪ Dadurch liegt – begünstigt durch das axiale Knopsungsmuster von haploiden Zellen – ein Array von 4 Zellen so vor, dass Zellen verschiedenen Paarungstyps miteinander paaren und zwei diploide Zellen bilden können. ▪ Diesen Prozess bezeichnet man auch als Pseudohomothallismus, ein Spezialweg zur Selbstfertilität. 42 Mating type switch - Paarungstypwechsel ▪ Der MAT-Lokus weist drei Regionen auf: X, Y, Z. ▪ Die Abschnitte X und Z sind identisch bei MATa und MATa. ▪ Die Zelltypidentität liegt also allein im Y-Bereich: Ya und Ya. ▪ Für einen Paarungstypwechsel müssen die Y-Bereiche ausgetauscht werden. 43  Mating type switch – Paarungstypwechsel: nur in Mutterzellen Paarungstypwechsel bei S. cerevisiae. (A) Der Zelltyp in S. cerevisiae wird bestimmt durch den MAT-Locus. In a-Zellen sitzt dort MATa, in a-Zellen MATa. Der MAT-Locus befindet sich auf CHRIII. An den Telomerenden von CHRIII befinden sich stille Kassetten von beiden Paarungstypen, HMLa auf der linken Seite und HMRa auf der rechten Seite. (B) Der Paarungstypwechsel wird durch die Ho Endonuklease initiiert. Ho schneidet die DNA an einer bestimmten Stelle an der Grenze der Y-Z- Region und erzeugt einen Doppelstrangbruch (DSB). Dies löst eine Genkonversion aus, bei der mit hoher Genauigkeit die DNA-Sequenz des anderen MAT-Lokus des stillen Lokus als Vorlage für die DSB-Reparatur verwendet wird. Dadurch wird ein Paarungstypwechsel vollzogen. 44 doi:10.3390/fermentation6020057 Ho kodiert für eine Endonuklease – eine ‚Genschere‘, die einen DSB verursacht ▪ Der Paarungstypwechsel wird durch einen Doppelstrangbruch – DSB- eingeleitet. ▪ Ho ist eine Endonuclease, die an der Grenze der Y und Z Region schneidet. ▪ Ho schneidet nur im aktiven MAT Lokus. ▪ Proteine binden in den HML und HMR Loci und blockieren die Ho- Schnittstelle. 45 Ho kodiert für eine Endonuklease – eine ‚Genschere‘, die einen DSB verursacht ▪ HO wird nur in Mutterzellen exprimiert ▪ Tochterzellen exprimieren einen HO- Repressor, ASH1 ▪ ASH1-mRNA wird von der Mutter in die Tochterzelle transportiert 46  Musterbildung – pattern formation ▪ Ein Einzeller mit Musterbildung? ▪ Mutter und Tochter sind genetisch identisch, ▪ aber trotzdem verschieden! ▪ Mutterzellen exprimieren HO ▪ Tochterzellen nicht, denn sie exprimieren ASH1 47 DOI: https://doi.org/10.1128/microbiolspec.mdna3-0013-2014 Musterbildung – pattern formation in higher eukaryotes 1918-2004 48 Topic of the day Der sexuelle Zyklus von Saccharomyces cerevisiae Die Pheromon-Signaltransduktionskaskade 49 Lebenszyklus von Saccharomyces cerevisiae 11. Paarung von Hefezellen Zygotenbildung Pheromone a a a a a/a Shmoo a a Mitotische a/a Mitotische Teilungen a a Teilungen 2n a a 1n 1n diploide a a a a a/a a/a a-Zelle a-Zelle a/a-Zelle a/a a/a a a a/a Meiose a a Ascus mit a 4 Ascosporen Gekeimte Ascosporen a 50  Paarung bei Saccharomyces cerevisiae: Einsatz von Pheromonen 51 https://yeastwonderfulworld.wordpress.com/2012/02/ Paarung bei Saccharomyces cerevisiae ▪ a-Zellen produzieren den a-Faktor und den a-Faktor Rezeptor ▪ a-Zellen produzieren a-Faktor den a-Faktor-Rezeptor 52 Der Shmoo 53 54 Der Shmoo The Shmoo first appeared in the strip in August 1948. According to Shmoo legend, the lovable creature laid eggs, gave milk and died of sheer esctasy when looked at with hunger. The Shmoo loved to be eaten and tasted like any food desired. Anything that delighted people delighted a Shmoo. Fry a Shmoo and it came out chicken. Broil it and it came out steak. Shmoo eyes made terrific suspender buttons. The hide of the Shmoo if cut thin made fine leather and if cut thick made the best lumber. Shmoo whiskers made splendid toothpicks. The Shmoo satisfied all the world's wants. You could never run out of Shmoon (plural of Shmoo) because they multiplied at such an incredible rate. The Shmoo believed that the only way to happiness was to bring happiness to others. Li'l Abner discovered Shmoos when he ventured into the forbidden Valley of the Shmoon, against the frantic protestations of Ol' Man Mose. "Shmoos," he warned, "is the greatest menace to hoomanity th' world has evah known." "Thass becuz they is so bad, huh?" asked Li'l Abner. "No, stupid," answered Mose, hurling one of life's profoundest paradoxes at Li'l Abner. "It's because they're so good!" Ironically, the lovable and selfless Shmoos ultimately brought misery to humankind because people with a limitless supply of self-sacrificing Shmoos stopped working and society broke down. Seen at first as a boon to humankind, they were ultimately hunted down and exterminated to preserve the status quo. (Thought extinct after the 1948 adventure, one Shmoo always seemed to escape to Dogpatch's Valley of the Shmoon to form a new colony and a later plot revival by Capp). Licensed Shmoo merchandise became a huge phenomenon in the late '40s and early '50s, spawning a wide variety of dolls, toys, glasses, wallpaper, belts, books, jewelry, balloons, clocks, ashtrays, 55 cannisters, salt & pepper shakers, dairy products, banks, belts and ear muffs. There was even an official Shmoo fishing lure! These are all highly collectible items today. Paarung bei Saccharomyces cerevisiae ▪ Elektronenmikroskopische Bilder von Zelladhäsion, Zellfusion und Kernfusion zweier Hefezellen ▪ Haploide Zellen unterschiedlichen Paarungstyps fusionieren ▪ Diese Zellen unterscheiden sich genetisch in der Expression unterschiedlicher Gene ▪ Wir können haploid spezifische Gene unterscheiden: solche, die für die Paarung von beiden Zelltypen benötigt werden (z.B. das G-Protein), sowie RME1, den Repressor of Meiosis. ▪ Daneben a-spezifische Gene, die für die Produktion des a-Faktors und des a-Faktor Rezeptors benötigt werden. ▪ Und a-spezifische Gene für die Produktion des a- Faktor und des a-Faktor Rezeptors. ▪ Diploid spezifische Gene sind z.B. IME1, den Inducer of Meiosis 56 Signaltransduktions-Kaskaden sind konserviert In Hefe: Ligand a-factor and a-factor a-factor Rezeptor (Ste2) Receptor a-factor Rezeptor (Ste3) G-protein, Ga and Gbg 3 G-protein, 3 Untereinheiten Gbg Ste11 MAP-kinase Ste7 Phosphorylierung Kaskade Fus3, Kss1 MAP-kinase Kaskade MAP kinase: Mitogen-Activated-Protein kinase Phosphorylierung Ste12 Transkriptionsfaktor Far1 Phosphorylierung Regulator Transkriptionsfaktor oder Effektorprotein 57 Die Pheromon-Signaltransduktionskascade von Saccharomyces cerevisiae Pheromone a-Faktor a-Faktor Rezeptoren Ste3 Ste2 G-Protein Ste4 a,b,g Gpa1 Ste18 Ste11 MAP-Kinase Ste5 Ste7 Kaskade Fus3/Kss1 Ste12 Far1 Regulatoren Zellfusion Zellzyklus- Shmoo- 58 Arrest Bildung Pheromone sind kleine Peptide: a-Faktor 1 MQPST--ATAAPKEKTSSEKKDNYIIKGVFWDPACVIA S.cerevisiae Mfa1 1 MQPITTASTQATQKDKSSEKKDNYIIKGLFWDPACVIA S.cerevisiae Mfa2 1 MQLTN-----NTNKDESTENKDNWIAKGYMWTPQCVIV A.gossypii ABL196c 1 MQQHSK----DGNQNGESENKDHWIIKGFVWNPQCVIA E.cymbalariae a-factor 59  Pheromone werden aus Vorstufen prozessiert Prekursor …KDNYIIKGVFWDPA Farnesylierung …KDNYIIKGVFWDPA C-terminale Spaltung …KDNYIIKGVFWDPA Methylierung …KDNYIIKGVFWDPA Spaltung: aktives Pheromon 60 YIIKGVFWDPA The Journal of Cell Biology, Volume 136, Number 2, January 27, 1997 251–269  Prozessierungsgene sind konserviert Internal proteolytic cleavage occurs, removing the last 18 coding amino acids18–20, to generate mature lamin A. Abnormal splicing produces a prelamin A that still retains the 61 CAAX box, but is missing the site for endoproteolytic cleavage. Biol Chem. 2009 Aug;390(8):761-73. doi: 10.1515/BC.2009.080. Progeria: Prozessierungsdefekt im Lamin A incidence of 1 per 8 million live births doi: 10.5582/irdr.2015.01003 62 ▪ Das Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom (HGPS) ist eine vorzeitige Altersstörung. ▪ Sie wird häufig durch eine Punktmutation im Lamin-A-Gen verursacht, die dazu führt, dass in der Nähe des C-Terminus ein Protein mit 50 Aminosäuren fehlt, das als LAD50 bezeichnet wird. ▪ Hier zeigen wir, dass HGPS mit signifikanten Veränderungen der Kernform verbunden ist, einschließlich Lobulation der Kernhülle, Verdickung der Kernschicht, Verlust von peripherem Heterochromatin und Ansammlung von Kernporen. ▪ Diese strukturellen Defekte verschlimmern sich mit zunehmendem Alter der HGPS-Zellen in der Kultur und ihr Schweregrad korreliert mit einem offensichtlichen Anstieg des LAD50. ▪ Die Einführung von LAD50 in normale Zellen durch Transfektion oder Proteininjektion führt zu denselben Veränderungen. ▪ Wir nehmen an, dass diese Veränderungen in der Kernstruktur auf einen konzentrationsabhängigen dominant-negativen Effekt von LAD50 zurückzuführen sind, der zur Störung lamin-bezogener Funktionen führt, die von der Aufrechterhaltung der Kernform bis zur Regulierung der Genexpression 63 und DNA-Replikation reichen.  A cure for Progeria? ▪ Aktuelle präklinische Studien haben recht vielversprechende Ergebnisse für Farnesyltransferase-Inhibitoren (FTIs) und andere potenzielle Medikamente zur Behandlung dieser Krankheit gezeigt. ▪ FTIs wurden ursprünglich als Zielmedikament für ein onkogenes RAS-Gen entwickelt und blockieren nachweislich das Enzym, das für den Farnesylierungsschritt auf Prelamin A bei HGPS-Kindern verantwortlich ist. ▪ Obwohl die pathologische Ursache nicht geheilt wird, verhindert die Hemmung dieses Schrittes die Ansammlung von Progerin am Kernrand und verhindert so ein weiteres Fortschreiten der Krankheit bei Kindern (2). ▪ In einer Studie wurde die Häufigkeit klinischer Schlaganfälle, Kopfschmerzen und anderer Komplikationen erheblich reduziert und die Lebenserwartung von Kindern verbessert (2). ▪ Im Jahr 2020 wurde Lonafarnib (FTI) das erste (und einzige) von der FDA zugelassene Medikament zur Behandlung von Progerie. 64 2. Ullrich NJ, Kieran MW, Miller DT, Gordon LB, Cho YJ, Silvera VM, Giobbie-Hurder A, Neuberg D, Kleinman ME. Neurologic features of Hutchinson-Gilford progeria syndrome after lonafarnib treatment. Neurology. 2013; 81:427-430. Pheromone: a-Faktor Vorstufen werden ebenfalls prozessiert B 1 MKTTHILSLATLAACAPVQPA--PVQPTDL-AAAANVPEKAVLGFFQLYNVGDVELLPVDDGAHSGILFVNRTLADVDYS-S----- AAR163c 1 MKISLLFSVSALLGAVIAIPVNGSRPEVTIDDVRGNIPEDAVLGFLDLSDVEGLAVRPIQTEERTGLLFVNRQLAEKGTEAASSQGS AFL062w 1 MKFYNILSVASIASLV-FA-A--PVSVNDAKEIAATFPQEALLGFLDLTDAENIVILSLVDEEKSGIALVNKTIWATARSEQAAGIS Ecym-AAL062c 1 MKLSSLLPILAAATTA-IA-A--PVQTQGA-ESHLNIPQEAVLGFIDLGNGNDIQVTTILNGTQNGILLFNSTVANAAAAPSDSTLA Ecym-AAR163c 1 MKFISTFLTFILAAVS--------VTASSD-EDIAQVPAEAIIGYLDFGGDHDIAFLPFSNATASGLLFINTTIAEAAEKEQNTTLA YGL089c 1 MRFPSIFTAVLFAASSALA-A--PVNTTTE-DETAQIPAEAVIGYLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLD YPL187w 79 -----------------------EHVVQKWFRLSLHHGQSM AAR163c 88 PKLEKDIARVYKRLMEYGHRRIFPAIDL AFL062w 84 KRDADAWHWLRFDRGQPIHKRSADAVADAWHWLRFDRGQPIHKRSADAVADAWHWLRFDRGQPIHKRSADAVADAWHWLRFDRGQPIHK Ecym-AAL062c 83 KRDADAWHWLRFNRGEPMYKRSASADADAWHWLRFSKGEPLHRRNADADADAWHWLRFNRGEPMY Ecym-AAR163c 79 KR---------------------EAVADAWHWLNLRPGQPMYKR--EANADAWHWLQLKPGQPMY YGL089c 84 KREAEAWHWLQLKPGQPMYKR--EAEAEAWHWLQLKPGQPMYKR--EADAEAWHWLQLKPGQPMYKR--EADAEAWHWLQLKPGQPMY YPL187w C Ashbya gossypii WFRLSLHHGQSM Eremothecium cymbalariae WHWLRFDRGQPIH WHWLRFNRGEPMY Kex2: schneidet dibasische Peptide: KR WHWLRFSKGEPLH Ste13: schneidet am C-Term von XAXA- Saccharomyces cerevisiae WHWLQLKPGQPMY Wiederholungen WHWLNLRPGQPMY 65 Die Pheromonantwort in S. cerevisiae Pheromone a-Faktor a-Faktor Rezeptoren Ste3 Ste2 66 Hefe-Paarung: Die Pheromon-Signaltransduktionskascade ▪ Die DNA-Sequenzen, die für die Pheromonrezeptoren kodieren – STE2 und STE3, die die Paarungspheromone erkennen, wurden 1985 in Saccharomyces cerevisiae isoliert. ▪ Es waren die ersten klonierten Gene von Liganden- bindenden sieben Transmembrandomän- Rezeptoren. ▪ Diese Rezeptoren interagieren mit heterotrimeren G-Proteinen. 67  Die Pheromon-Signal-Transduktionskascade 68 Biochim Biophys Acta. 2007 June ; 1773(6): 707–717.  Die Pheromon-Signal-Transduktionskascade 69 British Journal of Pharmacology (2016) 173 2195–2207  Die Pheromonantwort führt zum Zellzyklusarrest Halo-assay: Ste2 Test auf Funktionalität eines Pheromonrezeptors. ▪ Rundfilter mit verschiedenen Konzentrationen von α- Faktor werden auf Platte mit Zellen des Teststammes aufgelegt. ▪ Stämme: Wildtyp; BY4741, STE2 Dste2 Und eine Deletionsmutante, Δste2. ▪ Platten werden 1-2 Tage inkubiert. ▪ Zellen, die durch das Pheromon im Zellzyklus blockiert sind, können keine Kolonien ausbilden. Nicht blockierte Zellen wachsen. ▪ Halo = Zone der Wachstumsinhibierung. Diese ist abhängig von der eingesetzten Pheromonkonzentration. Konzentration von a-Faktor 70 Biochem. Soc. Trans. (2010) 38, 1257–1264; doi:10.1042/BST0381257; Methods Enzymol. 2010;470:695-707. doi: 10.1016/S0076-6879(10)70029-X  Heterologe Analyse von Rezeptoren und Liganden Pheromone-Wachstumsarrest/Halo-Assay in Saccharomyces cerevisiae. ▪ Ein Rasen des S. cerevisiae Testerstammes: WYE106; Scste2:NAT1, AgSTE2 wurde ausplattiert und mit A. gossypii a-Faktor in vier verschiedenen Konzentrationen behandelt. ▪ Es zeigt sich, dass durch die Expression eines fremden Rezeptors, bei Aktivierung durch den dazu passenden Liganden, die S. cerevisiae Signaltransduktionskaskade aktiviert werden kann. 71 Wendland et al., 2011; FEMS Yeast Research 11 (5), 418-429 Geruchsrezeptoren 72 Geruchsrezeptoren 2004 73  Rezeptorantagonists Wirkmechanismus: ▪ Wirkstoffe dieser Gruppe verdrängen Katecholamine von den Beta-Adrenozeptoren indem sie vornehmlich den Beta-1-Rezeptor, der sich bevorzugt in den Herzkranzgefäßen findet, blockieren. ▪ Im Herzen führt primär eine Aktivierung von β1- Adrenozeptoren und sekundär die Aktivierung des β2-Subtyps zu einer Steigerung der Herzkraft und Herzfrequenz Merck: Concor®, ein Betablocker, lieferte 2017 Umsätze von 444 Mio. € (Vorjahr: 431 Mio. €). Q1/2024: 140 Mio € Boehringer Ingelheim: Semintra® ist der erste zugelassene Angiotensinrezeptorblocker (ARB) zur Anwendung in der Veterinärmedizin. Es bietet eine sichere Lösung für Katzen. Die erstmalige Markteinführung von semintra® (4 mg/ml) erfolgte im Jahr 2013. 74 https://www.gelbe-liste.de/wirkstoffgruppen/betablocker 75  Rezeptoragonists ▪ Mirabegron (INN) ist ein rezeptpflichtiger Arzneistoff aus der Gruppe der β3- Sympathomimetika. ▪ Es ist in der EU seit 2012 zur Behandlung der überaktiven Blase zugelassen. ▪ Anwendung findet es in der symptomatischen Therapie von imperativem Harndrang, erhöhter Miktionsfrequenz und Dranginkontinenz. ▪ Mirabegron wirkt als β3-Adrenozeptor-Agonist. ▪ Durch eine sympathische Innervation der Harnblase kommt es zu einer Erhöhung der Blasenkapazität und eine Verminderung der Kontraktilität der Blasenmuskulatur. ▪ Tierstudien und Versuche an isolierten Blasenmuskelzellen zeigten eine Relaxation der glatten Blasenmuskulatur. ▪ In vivo wurde eine Zunahme des Miktionsvolumens festgestellt. 76 https://de.wikipedia.org/wiki/Mirabegron Die Pheromonantwort in S. cerevisiae Pheromone a-Faktor a-Faktor Rezeptoren Ste3 Ste2 G-Protein Ste4 a,b,g Gpa1 Ste18 77  Zelluläre Schalter: G-Proteine Gpa1 Sst2 Pheromone receptor acts as GEF Sst2: SuperSensiTive Deletion von GPA1 ist lethal. 78 Dies führt zu einer Überaktivierung der Signalkaskade und zu permanentem G1-Arrest. Das zeigt, dass die b,g-Untereinheit für die Signalweiterleitung verantwortlich ist  Zelluläre Schalter: G-Proteine Ste18 protein sequence: MTSVQNSPRL QQPQEQQQQQ QQLSLKIKQL KLKRINELNN KLRKELSRER ITASNACLTI INYTSNTKDY TLPELWGYPV AGSNHFIEGL KNAQKNSQMS NSNSVCCTLM * 79 https://www.cell.com/trends/genetics/references/S0168-9525(02)02723-3#relatedArticles Die Pheromonantwort in S. cerevisiae Pheromone a-Faktor a-Faktor Rezeptoren Ste3 Ste2 G-Protein Ste4 a,b,g Gpa1 Ste18 Ste11 MAP-Kinase Ste5 Ste7 Kaskade Fus3/Kss1 80 Zelluläre Schalter: Proteinphosphorylierung Schnell: zum Aktivieren und Deaktivieren der Signale. Effizient: Kein Umsetzen des Proteins erforderlich Effektiv: Phosphorylierung/Dephosphorylierung kann viele Aspekte der Funktion eines Proteins 81 regulieren: z.B.aktive/inaktive Zustände, Proteinlokalisierung, Protein-Protein-Wechselwirkungen Die Pheromonantwort in S. cerevisiae Pheromone a-Faktor a-Faktor Rezeptoren Ste3 Ste2 G-Protein Ste4 a,b,g Gpa1 Ste18 Ste11 MAP-Kinase Ste5 Ste7 Kaskade Fus3/Kss1 Ste12 Far1 Regulatoren Zellfusion Zellzyklus- Shmoo- Arrest Bildung 82 Die Pheromonantwort in S. cerevisiae Ste12 Far1 Regulatoren Zellfusion Zellzyklus- Shmoo- Arrest Bildung Ste12: ▪ Ist ein Transkriptionsfaktor. ▪ Hat eine sequenz-spezifische Bindesequenz. ▪ Mutanten sind steril, d.h. können nicht paaren. ▪ Wird von Fus3 phosphoryliert. 83 S. cerevisiae Ste12 Mating pheromone Ste12p erkennt das Pheromon-responsive Element (PRE), Ste2 Ste3 das die Konsensussequenz 5'-TGAAACA-3' enthält, und reguliert ca. 180 Gene, die an der Paarung beteiligt sind, Gα Gβ Gγ Ste20 z.B.: FAR1: Factor Arrest, CDK inhibitor, sequesters the Cdc24 in the nucleus Ste11 FIG1: Factor Induced Gene: facilitates Ca2+-influx FUS1: localized to the shmoo tip; required for cell fusion Ste5 Ste7 FUS3: MAP-kinase Fus3 Kss1 AGA1: a-Agglutinin – aga1/fig2 Mutanten sind steril FIG2: may be involved in maintenance of cell wall integrity during mating PRM4: Plasmamembranprotein Ste12 Ste12 STE12: Transkriptionsfaktor mating genes PRE 84 Phänotypischer Unterschied zwischen Knospe und Shmoo? Shmoo 85 Zellfusionen in anderen Systemen: Neurospora crassa Hier: die Fusion genetisch identischer Zellen! Gekeimte Sporen von Neurospora crassa 86 87 Lebenszyklus von Saccharomyces cerevisiae 12. Sporulation von Hefezellen Zygotenbildung Pheromone a a a a a/a Shmoo a a Mitotische a/a Mitotische Teilungen a a Teilungen 2n a a 1n 1n diploide a a a a a/a a/a a-Zelle a-Zelle a/a-Zelle a/a a/a a a a/a Meiose a a Ascus mit a 4 Ascosporen Gekeimte Ascosporen a Wikipedia 88 The awesome power of yeast genetics Hefe-Lebenszyklus Hefe-Kreuzungen Øjvind Winge *1886 †1964 Und sein Hund Claus, 1956 Øjvind Winge, Head of Department of Physiology 1933-1956 89 Father of Yeast Genetics Tetradenanalyse in Hefe ▪ Mikromanipulation von Tetraden (Asci mit vier Sporen) ▪ Zeigt den Effekt von Mutationen/Deletionen. ▪ Hier: lebend und koloniebildend gegenüber tot. A B C D E F G H I J 1 2 3 4 90 Tetradenanalyse in Hefe: APOYG THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278, No. 14, Issue of April 4, pp. 11818–11827, 2003 ▪ APOYG: ▪ In einer diploiden Hefe: deletiert man ein Allel eines essentiellen Gens, erhält man einen 2:2 Segregation deletiert man ein Allel eines konditionell essentiellen Gens, wachsen alle vier Sporen zu Kolonien auf nicht selektivem Medium; während es zu einer 2:2 Segregation auf selektivem Medium kommt ▪ In einer haploid Zelle: jede Gendeletion wirkt sich sofort phänotypisch aus. Es ist nicht möglich, ein essentielles Gen 91 zu deletieren. Sporulation bei Saccharomyces cerevisiae Voraussetzungen: ▪ Abwesenheit von Glucose ▪ Stickstoffmangel ▪ Anwesenheit einer nicht-fermentierbaren C-Quelle: Ethanol, Glycerol, Acetat ▪ Anwesenheit von Sauerstoff ▪ Funktionelle Mitochondrien 92  Sporulation bei Saccharomyces cerevisiae ▪ Die Sporulation umfasst die Chromosomen- verteilung und die Sporenmorphogenese. ▪ In der Meiose werden die Chromosomen zuerst repliziert und dann paaren sich homologe Chromosomen während der Prophase und führen meiotische Rekombinationen durch. ▪ Es folgen zwei aufeinanderfolgende Kernteilungen, in denen zuerst die homologen Chromosomen (Meiose I) getrennt werden, und dann die Schwesterchromatiden (Meiose II). 93 DOI: 10.1186/1471-2199-9-40 doi.org/10.1186/gb-2006-7-3-r20 Topic of the day Vererbung von Organellen 94  Lebenszyklus von Saccharomyces cerevisiae 13. Wie werden Organelle vererbt Zellorganelle sind von einer Membran umgeben; 95 Ribosomen und Spindelpolkörper zählen nicht dazu.. https://www.slideshare.net/Lellle/cell-structure-function2?from_action=save  Der Zellkern ▪ Das Kontrollzentrum der Zelle ▪ Umhüllt von einer Doppelmembran ▪ Enthält die DNA und die Chromsomen 96 https://www.slideshare.net/Lellle/cell-structure-function2?from_action=save  Proteinsekretion: Exocytose 97 https://www.slideshare.net/Lellle/cell-structure-function2?from_action=save  Aufnahme von Bestandteilen in die Zelle: Endocytose Hier sind drei Varianten der Endozytose gezeigt: (a) Die Phagozytose: Zellmembran umschliesst einen Partikel und verleibt ihn in die Zelle ein >>> Vakuole / Lysosome (b) Die Pinocytose: Die Zellmembran umschliesst Flüssigkeit und nimmt diese in ein Vesikel in die Zelle auf. (c) Rezeptor-vermittelte Endocytose: Die Aufnahme wird aktiviert durch einen Rezeptor, der durch einen Liganden aktiviert wurde. 98 https://courses.lumenlearning.com/suny-mcc-biology1/chapter/active-transport/  Mikrotubuli-Zytoskelett ▪ Microtubulus Hohlzylinder aus Tubulindimeren ▪ Die Polymerisierung von Aktinfilamenten verbraucht ATP; ▪ Die Polymerisierung der Mikrotubuli GTP Mikrotubuli entstehen aus speziellen Strukturen, den sogenannten Mikrotubuli-Organisationszentren (MTOC), typischerweise einem Zentrosom, die Ringe aus Gamma-Tubulin enthalten, die die Keimzellen (Ausgangspunkte) der Mikrotubuli-Polymerisation Organisation der Tubulindimere in einem Protofilament. darstellen. Am SPB ist das (-)-Ende. Alpha-Tubulin weist zum (-) Ende hin; Beta-Tubulin weist zum (+) Ende hin. Hefe-MTOC = Spindelpolkörper 99 https://mmegias.webs.uvigo.es/02-english/5-celulas/7-microtubulos.php  Mikrotubuli-Zytoskelett ▪ Tubulin-Untereinheiten bestehen aus a-tubulin and b-tubulin. ▪ Beide, α and β Tubuline, haben eine Masse von ~50 kDa; ähnlich wie Aktin (~42 kDa). ▪ Sowohl α- als auch β-tubulin müssen GTP binden, um zu polymerisieren ▪ Ein Mikrotrubulus ist ein Hohlzylinder (Durchmesser 25 nm) aus 13 parallelen Protofilamenten. ▪ Ein Mikroubulus ist dynamisch: er kann am + Ende wachsen (polymerization) oder schrumpfen (shrinkage, catastrophe) b-tubulin am Plus-Ende 100 http://images.iop.org/objects/bio/news/thumb/1/5/29/RB2sl18.jpg https://www.youtube.com/watch?v=1Aid3fC6L94&t=187s Fun fact Auch ein Shmoo hat ein Skelett 101  Mikrotubuli-Zytoskelett Male Rat Kangaroo Kidney Epithelial Cells: Immunofluorescence with mouse anti-alpha-tubulin was employed to visualize distribution of the microtubule network in these epithelial cells. Nuclei were stained with DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole). 102 https://www.microscopyu.com/gallery-images/male-rat-kangaroo-kidney-epithelial-cells-ptk2-line-6 Dynamik des Mikrotubuli-Zytoskelett 103  Zytoskelett: Mikrotubuli-assoziierte Motorproteine ▪ Motorproteine, die sich entlang von Mikrotubuli bewegen: Kinesine und Dynein ▪ Sie setzen die Energie aus ATP-Spaltung in Bewegungsenergie um. ▪ Dynein ist ein (-) End gerichteter Motor ▪ Kinesis ist ein (+) End gerichteter Motor ▪ Head and Tail. Mit den Tails/Schwänzen kann unterschiedliche Fracht gebunden werden ▪ Zwei Arten von Motorproteinen ermöglichen bidirektionalen Transport. 104 https://slideplayer.org/slide/12658951/  Kernbewegung während der Zellteilung ▪ Das Centrosome bei Säugern und der Spindelpolkörper (SPB, spindle pole body) in Hefe können beide Mikrotubuli generieren. ▪ Sie sind Mikrotubuli-organisierende Centren (MTOCs). ▪ Ein weiteres gemeinsames Merkmal ist die Duplikation der MTOCs genau einmal in jedem Zellzyklus. ▪ Der SPB ist bei Hefe in der Kernmembran verankert. Dadurch kann er im Kern die nukleären Mikrotubuli (MTs) und im Cytoplasma die cytoplasmatischen MTs organisieren. ▪ Die nukleären MTs werden für die Chromosomensegregation benötigt. ▪ Die cytoplasmatischen MTs für die Positionierung des Zellkerns. + + - + - + + 105 doi:10.1038/nrm1402  Kernbewegung während der Zellteilung ▪ Geschlossene Mitose in Hefe: Die Kernmembran bleibt intakt 106 http://jcb.rupress.org/content/139/4/985  Kernbewegung durch Dynein ▪ Dynein ist am Kortex der Tochterzelle verankert. ▪ Sobald cytoplamatische Mikrotubuli des SPB in die Tochter einwandern, kann Dynein diese greifen und seine (-)-End gerichtete Motoraktivität ausüben. ▪ Dadurch wird der Tochterkern in die Tochterzelle gezogen. ▪ Myo2 ist ein Motorprotein, das an Aktin entlangwandert, dies liefert eine zweite Möglichkeit, Kerne zu transportieren. ▪ Myo2 sitzt am (+) Ende eines Mikrotubules und kann am Aktin entlangwandern und dabei den Mikrotubulus und den Zellkern bewegen. 107 Asymmetric localization of Kar9 in Saccharomyces cerevisiae. Kar9 (karyogamy 9) is asymmetrically loaded onto the spindle-pole body that is destined for the daughter cell. Kar9 is excluded from the mother spindle-pole body through phosphorylation by Clb4–Cdc28 (B-type-cyclin-4–cell-division-cycle-mutant-28). The asymmetric localization of Kar9 might allow for selective doi:10.1038/nrm1402 orientation of the bud-specific spindle-pole body towards the bud, by shuttling active Kar9 from the spindle-pole body to the microtubule plus-end for linking to the actin cytoskeleton  Kernbewegung durch Dynein ▪ Spindel Verlängerung ▪ Spindel Reorientierung ▪ Bewegung des Kerns in die Tochterzelle 108 Candida albicans H4-GFP Wendland Lab  Kernbewegung in einer Candida albicans Dynein-Mutante 109 Wendland Lab Kernbewegung während der Zellteilung: Zwei unterschiedliche Maschinerien zur Kernbewegung: Myosin ▪ Myosin. Myo2 sitzt mittels der Adaptorproteine Bim1 und Kar9 am Ende eines Mikrotubulus, wandert am Aktinfilament zu dessen (+) Ende (zur Spitze der Tochterzelle) und zieht den Kern. ▪ Falls Dynein nicht vorhanden ist, kann das Myosin der Kerntransport auch alleine bewerkstelligen. 110 https://depositphotos.com/vector/carrying-a-heavy-burden-34226991.html Das Aktinzytoskelett ▪ Aktinfilamente sind helikale Polymere aus Aktin Durchmesser 6 nm ▪ Aktin: ist eines der häufigsten Proteine in der Zelle, hoch konserviert und gut charakterisiert ▪ Ein einzelnes, monomers Aktinmolekül (= globuläres or G- Aktin) kann zu filamenten polymerisieren (= F-Aktin) 111  Zytoskelett: Mikrotubuli-assoziierte Motorproteine Human cytoplasmic actin 1 Human cytoplasmic actin 2 Bos taurus Gallus Act1 S. cerevisiae Act1 112 Das Aktinzytoskelett 113  Das Aktinzytoskelett Die Organisation des Aktin-Zytoskeletts während des Zellzyklus in Saccharomyces cerevisiae: Hefen in unterschiedlichen Zellzyklusstadien besitzen drei unterschiedliche Aktin-Strukturen: ▪ Kortikales Aktin (cortical actin patches), ▪ polarisierte Aktinfilamente (actin filaments or cables) und ▪ einen Aktinring (actin ring) während der Cytokinese. Die Fluoreszenz-Bilder zeigen Zellen, die chemisch (Formaldehyd) fixiert wurden und dann mit Rhodamin-Phalloidin gefärbt wurden. 114 DOI: 10.1128/MMBR.00013-06  Zellzyklus und Aktin-Zytoskelett: Establishment of cell polarity 115 Genetics, 2012, Vol. 191, 347–387  Der Aktinring Kontraktion des Akto-Myosin Rings während der Cytokinese in S. cerevisiae. Aktin gefärbt durch Rhodamin-Phalloidin, Myo1 markiert mit GFP. Ringkonstriktion verfolgt über einen Zeitraum von 11 Minuten. 116 DOI: 10.1128/MMBR.00013-06  Das Aktinzytoskelett (A) An example showing the contraction dynamics of the actin probe iqgCH- GFP and the spindle pole body motion of Spc42-mCherry in wild-type cell. Shown is a representative movie of 82 frames, 3.93 s apart. (B) An example showing the contraction dynamics of the Myo1-GFP and the spindle pole body motion of Spc42- mCherry in wild-type cell. 117 https://doi.org/10.1016/j.devcel.2012.04.015  Septierung in Ashbya gossypii Cyk1-GFP Calcofluor 118 Wendland and Philippsen, FG&B 2002 Cytokinese Der zytokinetische F-Aktinring baut sich am bud neck auf, kontrahiert sich und disassembliert. Dabei entsteht das Septum durch Einlagerung von Zellwandbestendteilen. 119  Cytokinese ▪ Chitinsynthase Chs2 ist verantwortlich für die Bildung des Primärseptums. ▪ Chs2 wird durch Myo2 entlang der Aktinfilaments zum bud neck gebracht. ▪ Kurz nachdem mit dem Aufbau des primären Septums begonnen wurde, lagern Mutter- und Tochterzelle auf jeder Seite des primären Septums ein sekundäres Septum aus Glucanen (Polymere von Glukose) und Mannoproteinen (stark glykosylierte Zellwandproteine, die reichlich Mannose-Zucker enthalten) ab. ▪ Synthese von beta-1,3-verknüpften Glucanen, die der Hefezellwand Festigkeit verleihen, wird von den Glucansynthase Fks1 und Fks2 vorgenommen. 120 DOI 10.1007/s00018-016-2220-3  Cytokinese ▪ Nach Fertigstellung der primären und sekundären Septa wird die Zellwand zwischen Mutter- und Tochterzelle durch hydrolytische Enzyme wie die Chitinase Cts1 und mehrere Glucanasen, darunter Dse4 und Egt2, abgebaut, wodurch die Zelltrennung ermöglicht wird. ▪ Die Transkription von CTS1, DSE4 und EGT2 wird durch den Transkriptionsfaktor Ace2 gesteuert und erfolgt nur beim Übergang von M zu G1 des Zellzyklus. ▪ Das Ace2-abhängige Transkriptionsprogramm wird nur von der Tochterzelle aktiviert. ▪ Das erklärt, warum nach der Zellteilung eine Knospennarbe (bud scar) aus unverdauter Zellwand nur in 121 den Mutterzellen sichtbar ist. Unterschied zwischen Knospe und Shmoo? Shmoo 122 Die Zellpolarität bei der Knospenbildung wird durch die Positionsinformation der landmark proteins (Bud-Proteine) gesteuert. Bud3, Bud4, Bud8, Bud9, Axl1, Axl2/Bud10 Rax1, Rax2 Bud5 GEF GDP GTP Bud1 Bud1 GAP Bud2 Cdc24 GEF GTP GDP Cdc42 Cdc42 GAP Bem2/Bem3 123 1n – axial 2n – bipolar budding pattern budding pattern  Die Zellpolarität bei der Bildung des Shmoos wird durch den Pheromongradienten gesteuert. ▪ Durch die Pheromon-Signalkaskade wird Far1 aktiviert. ▪ Far1 bindet an sowohl an die Gb- Untereinheit als auch an Cdc24. ▪ Damit wird Cdc24 an Stellen aktiver Pheromonrezeptoren gebracht. ▪ Cdc24 aktiviert Cdc42 und damit wird die Zellpolarität in Richtung des Mating-Partners ausgerichtet. 124 doi.org/10.1083/jcb.201609124  Cdc42: Establishment of cell polarity (-) Ende (+) Ende cell polarity establishment an der Knospenspitze und Bildung der Aktinfilamente. Cdc42 wird von Cdc24 aktiviert und aktiviert seinerseits das Formin Bni1. 125 Bni1 assembliert Aktinmonomere in ein Aktinfilament, d.h. das Aktinfilament wächst am Bni1-Ende. DOI: 10.1128/MMBR.00013-06  Der Spitzenkörper: Das Vesicle Supply Center – Polarisom von Hyphen Salomon Bartnicki-Garcia 126 127 100 Jahre Spitzenkörper 128 Spitzenkörper in Ashbya gossypii: AgSPA2-GFP 129 Spitzenkörper in Ashbya gossypii: AgSPA2-GFP in einer bud1 Mutante 130  Myosin: Ein Motorprotein, ein Transporter entlang von Aktinfilamenten ▪ Myosin-Motorprotein: - besitzt eine ATPase-Kopf Domäne und eine - Schwanz Domäne, Head and Tail-Domain, die mit einer Fracht interagiert - bildet ein Dimer ▪ Myosin ist ein zum (+) Ende also zum wachsenden Ende des Aktinfilaments gerichteter Motor 131 http://www.differencebetween.net/science/health/difference-between-myosin-and-kinesin/  Muskelsarkomere - Muskelkontraktionen ▪ Bei der Kontraktion im Sarkomer ist Myosin als Motorprotein der aktive Teil. ▪ Der Kopfteil bildet mit dem Aktinfilament eine Querbrücke, liefert die Bewegung und löst die Querbrücke wieder. ▪ Die Aktinfilamente gleiten in Richtung auf die M-Linie an den Myosinköpfen entlang. ▪ Das Sarkomer wird verkleinert, indem sich die Breite des I-Bandes ändert. 132 https://www.youtube.com/watch?v=J9K1enGBJRw https://www3.unifr.ch/apps/med/elearning/de/biochemie/muskel/kontraktion/d-kontraktion.php Muskelsarkomere - Muskelkontraktionen ▪ Als die Totenstarre (med.-lat. rigor mortis ‚Leichenstarre‘) wird die nach dem Tod (post mortem) eintretende Erstarrung der Muskulatur bezeichnet. Sie ist eines der sicheren Todeszeichen. ▪ Verursacht wird die Starre durch die Bindung von Myosin an die Aktinfilamente: Nach dem Einsetzen des Todes wird ATP aus ADP nicht mehr regeneriert. ▪ Die Bindung wird wegen der Abwesenheit von ATP nicht mehr aufgehoben, der Muskel erstarrt. 133  Myosin: Ein Muskelprotein Weißblaue Belgier haben eine natürliche Mutation in dem Gen, welches das Muskelwachstums-Hemmungs-Protein Myostatin kodiert Weiss-Blaue Belgier 134 https://www.google.com/search?q=arnold+schwarzenegger&tbm=isch&tbs=rimg:CfHvOE3_1cHx2IjhhjlmT1YHFWi5NK6vTyoFPXWu6333VZqjKEs2R0J8Da06YBFm-jXA- fBHUhwSwRWFkzVx13Y6pvyoSCWGOWZPVgcVaEV3tdr8YV7AhKhIJLk0rq9PKgU8RevEfAoHkCsoqEglda7rffdVmqBFGVbfxgZl4HioSCcoSzZHQnwNrEZ2CJaxoImNxKhIJTpgEWb6 NcD4RMRb8-lGu- jgqEgl8EdSHBLBFYRGJo3ZJXNvGtioSCWTNXHXdjqm_1Eb6mRcVQvwfo&tbo=u&sa=X&ved=2ahUKEwj08MuPlOHjAhWhxIUKHc5sDz4Q9C96BAgBEBs&biw=1618&bih=843&dpr=1 #imgrc=8e84Tf9wfHZLpM: https://www.strangeanimals.info/2010/12/belgian-blue-super-cow.html Myosin: Ein Muskelprotein ▪ Das Wachstum der menschlichen Skelettmuskulatur wird durch das Zytokin Myostatin reguliert. ▪ Myostatin bindet an Zielzellen und setzt Signalwege in Gang die letztlich zu einer Hemmung des Muskelwachstums führen. ▪ Mittel, die die Wirkung von Myostatin neutralisieren sind somit höchst interessant für die Behandlungen von Krankheiten, die mit einem Abbau der Muskulatur einhergehen. Dopingmittel: Myostatin-Inhibitoren ▪ Die Anwendung von Substanzen zur Hemmung des Myostatins, wird seit dem 1.1.2008 von der Welt Anti-Doping Agentur (WADA) unter S4 Gruppe der Hormonantagonisten und Modulatoren verboten. 135 https://www.google.com/search?q=Myostatin+mutants&rlz=1C1CHBF_deDE841DE842&tbm=isch&source=iu&ictx=1&fir=SRUDGM8QEMiU1M%253A%252CgPLmhI-SUCq4zM%252C_&vet=1&usg=AI4_-kS- jZE10A8UjyE6tbwqm30buuLzNQ&sa=X&ved=2ahUKEwitl6_flOHjAhVLXRoKHZO9AakQ9QEwAXoECAcQCQ#imgrc=SRUDGM8QEMiU1M: Funktion und Vererbung von Vakuolen Funktionen: 1. Speicherorganell: Die Vakuole fungiert als Speicherkompartiment für verschiedene Metabolite, darunter Aminosäuren und Ionen. 2. Proteinabbau: Unter Hungerbedingungen findet etwa 85 % des gesamten Proteinabbaus in der Vakuole statt. Bis zu 40 % aller zellulären Proteine ​können innerhalb von 24 Stunden in der Vakuole abgebaut werden. 3. pH-Wert und Ionenhomöostase: Die Vakuole spielt eine Rolle bei der Regulierung des zytosolischen pH-Werts und der Ionenhomöostase. 4. Entgiftung: Sie ist an Entgiftungsprozessen beteiligt. 5. Autophagie: Sie dient als Endkompartiment für autophagische Prozesse, darunter den Abbau von Mitochondrien. 6. Membranproteine ​w erden auch in derVakuole abgebaut. 7. Größe und Volumen: Die Vakuole kann einen Großteil des gesamten Zellvolumens einnehmen. 8. Energieabhängiger Transport: Die vakuoläre V-ATPase aktiviert den gerichteten Transport über die Vakuolenmembran. 9. Die Vakuole von S. cerevisiae ist funktionell homolog zu Lysosomen in höheren Eukaryoten. 136  Vakuolenvererbung ▪ Myo2 bindet über die Adaptoren Vac8 und Vac17 an die Vakuolen Lois Weissman 137 doi: 10.1016/j.devcel.2014.02.001 Vakuolenvererbung: über Myo2 entlang der Aktinfilamente 138  Vakuolenvererbung Vac17p ist für die Vererbung von Vakuolen erforderlich: Fluoreszenzmikroskopiebilder von FM4-64 angefärbten Vakuolen im Wildtyp und der vac17 Mutante. Beispiele für Knospen mit (Pfeil) und ohne (Pfeilspitze) Vakuolen sind angegeben. Die Vererbung von Vakuolen ist offenbar nicht essentiell. 139 Vakuolen können von der Tochterzelle de novo erschaffen werden doi: 10.1083/jcb.200210139 Funktion und Vererbung von Peroxisomen Funktionen: 1. Fettsäureabbau: In S. cerevisiae findet der Abbau von Fettsäuren ausschließlich in den Peroxisomen statt, im Gegensatz zu höheren Eukaryoten, wo dies teilweise in Mitochondrien geschieht. 2. β-Oxidation: Peroxisomen enthalten ein spezielles β-Oxidationssystem zum Abbau von Fettsäuren. Dies ist besonders wichtig, wenn Hefen auf fettsäurehaltigen Medien wachsen. 3. Wasserstoffperoxid-Metabolismus: Peroxisomen enthalten Enzyme für den Stoffwechsel von Wasserstoffperoxid (H2O2), einschließlich H2O2 -produzierender Oxidasen und H2O2 -abbauender Katalase. 4. Anpassung an Nährstoffbedingungen: Die Anzahl, Größe und Proteinausstattung der Peroxisomen in S. cerevisiae passt sich den Wachstumsbedingungen an. Bei guter Glukoseversorgung sind nur wenige kleine Peroxisomen vorhanden, während bei Wachstum auf langkettigen Fettsäuren 20 bis 25 große Organellen gebildet werden. 5. Essentielle Funktion bei bestimmten Wachstumsbedingungen: Für das Wachstum auf Medien mit bestimmten Kohlenstoffquellen, wie z.B. Ölsäure, benötigt S. cerevisiae funktionelle Peroxisomen. 140  Funktion und Vererbung von Peroxisomen ▪ We identified Inp2p as the peroxisomespecific receptor for Myo2p. ▪ Cells lacking Inp2p fail to partition peroxisomes to the bud but are unaffected in the inheritance of other organelles. Richard Rachubinski ▪ Inp2p is a peroxisomal membrane protein, preferentially enriched in peroxisomes delivered to the bud. ▪ Inp2p interacts directly with the globular tail of Myo2p. ▪ Cells overproducing Inp2p often transfer their entire populations of peroxisomes to buds. 141 Vererbung von Peroxisomen Inp2 ist erforderlich für die Vererbung (= Transport) von Peroxisomen in die Tochterzelle wildtype myo2 mutant 142 Vererbung von Peroxisomen ▪ Wenn der Transport übermäßig erfolgreich wäre, verblieben gar keine Peroxisomen in der Mutterzelle und alle würden an die Tochterzelle vererbt. ▪ Um die Organellen gleichmäßig aufzuteilen, muss ein Rückhalte- mechanismus vorhanden sein. ▪ Ein Teil der Peroxisomen wird währen des Wachstums der Tochterzelle an der Peripherie der Mutterzelle verankert. ▪ Dazu wird Inp1 benötigt. ▪ Inheritance of peroxisomes protein 1 (Inp1) ist ein peripheres Membranprotein von Peroxisomen mit einer wesentlichen Rolle bei der Immobilisierung von Peroxisomen an der Zellrinde. 143 Vererbung von Peroxisomen ▪ Nach Deletion von INP1 erfolgt die Peroxisomen- vererbung ungleichmäßig. ▪ Alle Peroxisomen gelangen in die Tochterzelle. 144 Vererbung von Peroxisomen ▪ Nach Überexpression von INP1 erfolgt die Peroxisomenvererbung ebenfalls ungleichmäßig. ▪ Nun verbleiben alle Peroxisomen in der Mutterzelle. 145 Organelle movement: peroxisomes Inp1 serves as anchor in the mother cell Inp1: Membrananker Inp2: Adaptorprotein 146 Unterschiede zwischen Mutter- und Tochterzellen ▪ 1.) Die Mutterzelle ist größer als ihre Tochter, daher verbleiben Tochterzellen länger in der G1- Phase des Zellzyklus. ▪ 2.) In der Mutterzelle wird HO exprimiert >>> Paarungstypwechsel ▪ 3.) Die Tochterzelle exprimiert ASH1 (HO-Repressor) ▪ 4.) Die Tochterzelle exprimiert ACE2, welches die Expression von CTS1, DSE4 und EGT2 steuert. Das führt zu einer bud scar bei der Mutterzelle und einer birth scar bei der Tochterzelle. ▪ 5.) Mutter sorgt für juvenile Tochter – quality control bei der Organellenvererbung ▪ 6.) der Cytosolische pH-Wert ist in alternden Müttern höher als in Tochterzellen. ▪ 7.) Mutterzellen vergrößern sich mit zunehmendem Alter. Tochterzellen von alten Müttern sind daher größer als Töchter von jungen Müttern. Mit zunehmendem Alter der Mutterzellen steigt damit auch die Häufigkeit symmetrischer Teilungen. 147 Unterschiede zwischen haploiden und diploiden Zellen ▪ 1.) Diploide Zellen sind größer als haploide Zellen. ▪ 2.) Haploide Zellen: axiales Knospungsmuster – diploide Zellen: bipolares Knospungsmuster ▪ 3.) 1n: MATa oder MATa – 2n: MATa/MATa ▪ 4.) 1n: können sich paaren, aber nicht sporulieren 2n: können nicht paaren, aber sporulieren >>> Ascus mit 4 Ascosporen 2:2 = MATa:MATa ▪ 5.) 1n: einfacher Chromosomensatz – 2n: doppelter Chromosomensatz ▪ 6.) Haploide Zellen exprimieren haploid spezifische Gene (hsg) und RME1. Diese Gene sind in 2n Zellen reprimiert. ▪ 7.) Haploide Zellen können den Paarungstyp wechseln, diploide nicht. 148 Video Material 149  Saccharomyces cerevisiae: Lebenszyklus Watch this: https://www.youtube.com/watch?v=x_05ZlrYrZg 150  Yeast mating: the pheromone-response signal transduction cascade ▪ Watch these videos: https://www.youtube.com/watch?v=MAhkB9qX2pI Takes 27 min 151 Klausurfragen: ▪ Organelle einer Zelle können vererbt werden. Erklären Sie den Vererbungsvorgang von Peroxisomen in Saccharomyces cerevisiae. Wie kann die Mutterzelle sicherstellen, dass sie auch noch Peroxisomen behält und nicht alle vererbt werden? Nennen Sie die Funktionen der wesentlichen Komponenten (Transporter + Adaptorproteine). ▪ Wie werden Vakuolen vererbt? Welche Proteine beteiligt (Transporter + Adaptorproteine)? Was passiert, wenn eine Tochterzelle keine Vakuole vererbt bekommt? ▪ Beschreiben Sie die zwei unterschiedlichen Mechanismen, auf denen Hefen den Tochterkern in die Tochterzelle transportieren können. Welche Zytoskelette sind beteiligt, welches sind die Transportproteine? ▪ Entlang der Zytoskelette wandern Transport-/Motorproteine. Welche Proteine, nennen Sie drei, wandern dabei in welche Richtung? An welchen Cytoskelettfilamenten geschieht der Transport? Welche Aufgaben erfüllen diese Transportproteine dabei? 152 Klausurfragen: ▪ Beschreiben Sie den Lebenszyklus von Hefe. Welche Zelltypen/Paarungstypen treten dabei auf? Welche Eigenschaften haben die jeweiligen Zellen? ▪ Beschreiben Sie die Pheromon-Signaltransduktionskaskade bei S. cerevisiae. Welche Proteine sind daran beteiligt? Welche Rolle haben diese Proteine? Welcher Input wird verarbeitet und welcher output entsteht, d.h. auf welches Signal reagieren Zellen und wie regieren Sie? Was ist das Endergebnis dieser Signalverarbeitung? ▪ Was passiert beim Paarungstypwechsel (mating type switch) bei S. cerevisiae? ▪ Wie regulieren die Gene des MATa Lokus die a-Zellidentität? ▪ Was sind Pheromone bei S. cerevisiae? Welche Pheromone gibt es bei S. cerevisiae? Wie werden sie hergestellt? ▪ Erklären Sie die Rolle des Spindelpolkörpers im Zellzyklus. ▪ Wie entsteht bei S. cerevisiae ein Septum? Woraus bestehen Primär und Sekundärsepten? Welche Rolle spielt die Tochterzelle bei der Cytokinese? ▪ Welche Arten des Knospungsmusters gibt es bei S