Mibi 02: Trübung

Mikrobiologie Vorlesung: Trübung & Hefe-Zellzyklus

• Das Thema des Tages ist Saccharomyces cerevisiae, wobei Trübung-Flockulierung, Wachstum, Zellzyklus und Altern (Seneszenz) behandelt werden.

Bestimmung der Zellzahl und Trübung

• Die Bestimmung der Zellzahl in einer Lösung kann durch Messung der Trübung erfolgen.
• Eine Mikrobenzelle ist unsichtbar, aber viele zusammen verursachen eine Trübung.
• Unterschiedliche Hefezellzahlen verursachen in klaren Flüssigkeiten unterschiedliche Trübungsmuster.
  • 1.000/ml: Kristallklar
  • 100.000/ml: Geradeso erkennbare Trübung
  • 1.000.000/ml: Geringe Trübung/Haze = Schleier
  • 10.000.000/ml: Hohe Trübung
  • Die optische Dichte ist bei einzelligen Organismen proportional zur Zellzahl.

Bestimmung der Trübung und optische Dichte

• Zellen verschiedener Hefearten sind unterschiedlich groß, was bedeutet, dass dieselbe optische Dichte (OD) bei ihnen unterschiedlichen Zellzahlen entspricht.
• Die Messung der Zellzahl erfordert die Erstellung einer Standardkurve.
• Eine Tabelle für Saccharomyces cerevisiae existiert für Zellzahl/OD Verhältnisse.

Zählen aller Zellen: Gesamtzellzahl

• Es wurde ein direktes mikroskopisches Zählverfahren unter Verwendung der Petroff-Hausser-Zählkammer verwendet.
• Normalerweise verwendet man zur Zählung der Zellen ein Phasenkontrastmikroskop, um das Anfärben zu vermeiden
• Die Formel zur Berechnung der Anzahl der Zellen pro Milliliter Probe ist: 12 Zellen x 50/25 Großquadrate x 10^3 = 1,5 x 10^7

Bestimmung der Lebendkeimzahl

• KBE steht für Kolonie-bildende Einheiten (CFU = colony forming units)
• Für die Lebendkeimzahl wird eine Probe verdünnt und auf Agarplatten ausgestrichen.
• Nach Inkubation werden die Kolonien gezählt und mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert

Mikrobielle Trübung

• Hefe oder Bakterienwachstum nach der Abfüllung kann zu Bombage(dem gewölbten Aussehen) durch Nachgärung in Flaschen führen.
• Alkoholfreier Sekt wurde in den Regalen aufgrund des Vorhandenseins von Alkohol und der daraus resultierenden Explosionsgefahr wieder zurückgerufen.

Flockulierung bei Hefen

• Flockulierung sorgt dafür, dass sich Hefezellen am Ende der Fermentation verklumpen und am Boden absetzen (untergärig) oder an der Oberfläche ansammeln (obergärig).

Staubhefe vs Bruchhefe

• Staubhefe sind einzelne Zellen die nicht flockulieren
• Bruchhefe verklumpen, es werden größere Aggregate gebildet

Zelltrennungsdefekte≠Flockulierung

• Zelltrennungsdefekte verhindern die Trennung von Mutter- und Tochterzelle

Flockulierung bei Hefen

• Am Ende der Fermentation und als Schwarmbildung, um als Kolonie widrige Umweltbedingungen zu überleben, flockulieren die Hefen
• EDTA wird verwendet, um zweiwertige Metallionen zu binden und die Flockulierung zu inhibieren

Inhibierung der Flockulierung

• EDTA
• Temperaturkontrolle: Senken der Temperatur beeinträchtigt die Flockulierung bei Lagerbier-Hefen.
• pH-Kontrolle sehr stammabhängig
• Wahl der Hefe: Staubhefe vs Bruchhefe
• Zugabe von Mannoproteinen inhibiert die Flockulierung
• Bei hohen Zuckergehalten findet keine Flockulierung statt - Glucoserepression

Flockulierung bei Hefen: Zymolectin Theorie

• Auf der Hefezelloberfläche interagieren Proteinlektine mit Mannose und/oder Glucose enthaltenden Kohlenhydratdeterminanten auf den Zellwänden benachbarter Zellen, aber nur in Gegenwart von Calcium.

Flockulierungsgene: FLO-gene

• Die FLO-Gene sind für die Flockulierung verantwortlich.

Flockulierungsgene: FLO-gene Struktur

• Das Signalpeptid dient dem Transport des Proteins aus der Zelle.
• Die N-terminale Domäne enthält eine Zuckerbindestelle und die ermöglicht die Agglutinierung
• Zuckermoleküle sind Glukose oder Mannose.

Saccharomyces fermentans

• Saccharomyces fermentans hat FAS-Gene, die FLO/ALS-ähnliche Sequenzen enthalten.

FLO-Gene werden transkriptionell reguliert durch Flo8

• FLO-Gene werden transkriptionell durch Flo8 reguliert.

FLO8 in Laborstämmen

• BY44741 und andere Laborhefen tragen eine Mutation im FLO8-Gen, weshalb diese Stämme nicht flockulieren.

Hefe in verschiedenen Formen

• Trickenhefe enthält 5% Wassergehalt.
• Frischhefe 70% Wassergehalt.
• Aktive Trockenhefe hat keine Feuchtigkeit
• Instant Trockenhefe hat eine etwas körnigere Optik

Hefe: Frischhefe warum eigentlich 42 Gramm?

• Bäckershefe ist abgepackt sodass diese für 1kg Mehl zu verwenden ist

Hefe-Mikrobiologie

• Eine Hefezelle ist 4 µm breit und 6 µm lang sind.
• 20 Hefezellen übereinander sind so dick wie 1 Blatt Zeitungspapier sind.
• Alle Zellen von einem 1 kg Hefeblock aneinander gereiht liefern eine 42.000 km lange Kette - einmal um die Erde.
• Für Bier-Fermentation: 15-50 Millionen Zellen/ml
• Für Wein-Fermentation: 2 Millionen Zellen/ml

Der Zellzyklus

• Der Zellzyklus besteht aus vier Phasen: G1 (Gap1), S (Synthese), G2 (Gap2) und M (Mitose)
• G1: Wachstum der Tochterzelle, um selbst groß genug zu werden, um in einen neuen Zellzyklus einzutreten. mRNA und Proteine werden angesammelt.
• S: Verdoppelung des Spindelpolkörpers (SPB), Entstehung der Knospe/Tochterzelle, Replikation der DNA
• G2: Wachstum der Tochterzelle, Überprüfen Sie, ob die DNA-Replikation abgeschlossen ist, Vorbereitung auf die Teilung, Organellenvererbung
• M: Verlängerung der Spindel, Ausrichtung der Spindel in der Mutter-Knospen-Achse, Bewegung der Chromosomen zu den entgegengesetzten Polen des Kerns, Bewegung des Tochterkerns in die Knospe hinein.

Asymmetrische Zellteilung

• Lee Hartwell, Tim Hunt, Paul Nurse (Nobelpreis 2001) haben die asymmetrischen Zellteilung und den Zellzyklus charakterisiert

Geschlossene Mitose – Kernbewegungen bis zur Mitose

• Geschlossene Mitose: Die Kernmembran bleibt intakt

Der Spindelpolkörper

• Der SPB ist ein Organisationszentrum für Mikrotubuli in Hefezellen

Kernwanderung: Zeitraffermikroskopie

• Candida albicans Zellen mit Histone H4-GFP, das im Kern lokalisiert

Das Altern und die Seneszenz

• Replikative Seneszenz: Die endliche replikative Kapazität von sich mitotisch teilenden Zellen.
• Chronologische Seneszenz: Endet mit dem Zelltod

Das Hayflick-Limit

• Das Hayflick-Limit (1961) gibt an, wie oft sich eine normale menschliche Zellpopulation teilt, bis die Zellteilung aufhört
• Hayflick zeigte zum ersten Mal, dass es sterbliche (normale) und unsterbliche (bösartige) Säugetierzellen gab.
• Auf molekularer Ebene bedeutet dies, dass sich die Telomere bei jeder neuen Zellteilung bis zu einer kritischen Länge verkürzen und die Zellen dann in eine Seneszenzphase eintreten.
• Embryonale Stammzellen exprimieren Telomerase, wodurch sie sich die Telomere verlängern.

Fun Fact Impfstoffe

• 1963 gelang die Entwicklung des ersten Impfstoffes auf Basis der WI-38-Zelllinie, ein Polioimpfstoff, es folgten nach und nach Impfstoffe gegen Masern, Mumps, Röteln, Tollwut, Windpocken und Hepatitis A
• Bis 2015 wurden 4.5 Milliarden vor gefärlichen Infektionen geschützt

Der Werner Syndrom

• Zellen aus Werner-Syndrom-Patienten zeichnen sich durch - langsame Wachstumsraten, vorzeitige Alterung, beschleunigte Telomerverkürzungsraten, und Genominstabilität aus
• Helikasen sind für wesentliche Prozesse wie die Replikation und Transkription verantwortlich

Progeria

• Das Krankheitsbild wurde erstmals 1886 von Jonathan Hutchinson und Hastings Gilford beschrieben
• Auffälligstes Merkmal ist eine vorzeitige Vergreisung der betroffenen Kinder.
• Ursache ist eine Falsche Prozessierung von Lamin A.

Was passiert molekular beim Altern?

• Der Upstream-activating-Faktor (UAF)-Komplex des rRNA-Gens kann auch als transkriptioneller Repressor am SIR2-Locus wirken.
• Da die Ansammlung von ERCs (extrachromosomalen rDNA-Kreisen) in der Mutterzelle ihre RLS (replikative Lebensspanne) begrenzt, sind sir2Δ- und fob1Δ-Stämme kurz bzw. langlebig.

Lebensverlängernde Maßnahmen?

• Kalorienrestriktion (CR) ist die einzige nicht genetische Manipulation von Tieren, die die Lebenserwartung zuverlässig verlängert.
• CR-Tiere weisen auch eine verbesserte Anfälligkeit für eine Vielzahl pathologischer Erkrankungen auf.
• CR ist eine wichtige Intervention, die sowohl die Gesundheitsspanne als auch die Lebensdauer moduliert

Fasten als lebensverlängernde Maßnahme

• Fasten treibt die metabolischen, molekularen und geroprotektiven Wirkungen einer kalorienreduzierten Ernährung bei Mäusen an.

Klausurfragen

• In welche vier Phasen kann man den Zellzyklus unterteilen? Beschreiben Sie insbesondere Vorgänge, die in der S-Phase stattfinden sowie Prozesse, die zur Trennung von Mutter- und Tochterzelle bei Saccharomyces cerevisiae führen.
• Erklären Sie die Begriffe replikative und chronologische Lebensspanne. Nennen Sie molekulare Marker des Alterns und eine Strategie/Strategien zur Lebensverlängerung.
• Wie kann man die Gesamtzellzahl und die Lebendzellzahl einer Probe experimentell bestimmen?
• Zelle-Zell-Adhäsion bezeichnet man als Flockulierung. Wie machen wir uns Flockulierung bei Fermentationen zu Nutze? Wie funktioniert Flockulierung molekular? Welche Gene sind daran beteiligt? Wie kann man Flockulierung inhibieren?