Mikrobiologie Vorlesung PDF - Hefe-Genetik

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 3 HEFE-GENETIK Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland 1 Topic of the day Hefe-Genetik Nukleinsäure...

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 3 HEFE-GENETIK Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland 1 Topic of the day Hefe-Genetik Nukleinsäuren, DNA Das Gen Transkription Tranlation Das Hefe-Genom Das Centromer Das ARS-Element 2 News of the day 3 Nukleinsäuren ▪ Johannes Friedrich Miescher (1844-1895), Schweizer Arzt und Biologe. Er war der erste, der Nukleinsäuren isolierte und identifizierte (1868). Er äusserte die Vermutung, dass Nukleinsäuren an der Vererbung beteiligt sind. ▪ Albrecht Kossel (1853-1927), Deutscher Biochemiker, 1910 Nobelpreis für Physiologie oder Medizin für seine Arbeiten zur chemischen Komposition von Miescher Nukleinsäuren. Er isolierte und beschrieb die fünf organischen Komponenten, die man in Nukelinsäuren findet: Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil. Kossel bezeichnete die Substanz als "nuclein", heute als Nukleinsäure bezeichnet (1881). ▪ Kossel identifizierte ausserdem die Aminosäure Histidin und durch seine Forschungen sagte er die Entdeckung der Polypeptidstruktur von Proteinen Kossel voraus. ▪ „Die Zahl der Bausteine, die Teil eines Proteins sind, ist so groß wie die Zahl von Buchstaben im Alphabet. Wenn wir überlegen, dass wir durch die Kombination von Buchstaben eine unbegrenzte Zahl an Gedanken zum Ausdruck bringen können, dann verstehen wir, welche große Zahl an Eigenschaften eines Organismus in dem kleinen Raum aufgenommen werden kann, den ein Protein einnimmt.“ 4 Nukleinsäuren ▪ Guanin: wurde bereits vor Kossel benannt nach seiner Herkunft von den Exkrementen von Seevögeln, die als Guano bekannt sind. ▪ Adenin wurde von Kossel so benannt, da es aus Pankreas isoliert wurde ('adenas’ im Griechischen). ▪ Thymin wurde in Nukleinsäuren aus Kälberthymus gefunden. ▪ Cytosin wurde auch durch Hydrolyse aus Kälberthymus gefunden. Der Name leitete sich einfach vom griechischen Prefix für Zelle 'cyto’ ab. ▪ Uracil wurde von Ascoli, einem Studenten Kossels, entdeckt durch hydrolytische Spaltung von Nukleinsäuren. Der Name wurde 1885 vom deutschen Chemiker Robert Behrend geprägt, der versuchte, synthetische Varianten von Harnsäure herzustellen. 5 Nukleinsäuren RNA: Ribonukleotide, RiboNucleic Acid DNA: deoxyribonucleotide, DeoxyriboNucleic Acid 6 https://biologywise.com/nucleoside-vs-nucleotide wikipedia Nukleinsäuren: Die Phosphodiester-Bindung ▪ Nukleinsäuren sind Polymere, die aus Nukleotid-Monomeren aufgebaut sind. Sie sind also Polynukleotide, geradeso ▪ wie Proteine aus Aminosäuren aufgebaut sind und daher Polypeptide sind. Phosphodiester-Bindungen werden zwischen zwei Nukleotiden geknüpft. Eine Diester-Bindung wird zwischen dem 3‘-C-Atom eines Zuckermoleküls über eine Phosphatgruppe mit dem 5‘-C-Atom des nächsten 7 Zuckermoleküls geknüpft. Nukleinsäuren: Die Direktionalität – von 5‘ nach 3‘ ▪ Die chemischen Konventionen, wie die C-Atome in Ringstrukturen 5‘ durchnummeriert werden, führt dazu, dass es in einem Einzelstrang DNA oder RNA ein 5’-Ende meist verbunden mit einer Phosphatgruppe und ein 3’-Ende mit einer freien OH-Gruppe der Ribose gibt. ▪ Nukleinsäuren können in vivo nur vom 5’-Ende zum 3’-Ende synthetisiert werden. Das liegt daran, dass die Polymerasen, die die Synthesen durchführen, die Energie für den Vorgang aus Triphosphaten beziehen. Durch Aufbrechen der Bindung wird das Monophosphat an das 3’-OH-Ende angehängt. 3‘ 8 Nukleinsäuren – DNA, der Träger der Erbinformation Microbe of the day Streptococcus pneumoniae ▪ Gram (+), Coccus, kommt als Diplococcus vor ▪ Polysaccharidkapsel als Virulenzfaktor ▪ S-Form („smooth“: glatt) = virulent R-Form („rough”: rauh) = avirulent ▪ In Deutschland sterben pro Jahr mehr als 10.000 Menschen an einer Lungenentzündung durch Pneumokokken ▪ Erfolgreiche Behandlung durch Penicillin 9 Nukleinsäuren – DNA, der Träger der Erbinformation ▪ Das Griffith Experiment 1928: Transformation von Streptococcus pneumoniae Frederik Griffith 1879–1941 10 https://www.toppr.com/guides/biology/the-molecular-basis-of-inheritance/the-genetic-material/ Nukleinsäuren – DNA, der Träger der Erbinformation ▪ DAS Experiment, das zweifelsfrei belegte, dass DNA der Träger der genetischen Information ist, wurde von Avery et al. beschrieben: ▪ Dabei wurde DNA von einem pathogenen Stamm von Pneumococcucs extrahiert. Dieser Stamm ist von einer Kapsel umgegen und bildet glatte Kolonien (smooth colonies - S). Avery – 38x Zugabe aufgereinigter S DNA zu einer Kultur eines nicht-pathogenen, kapsellosen Stammes (R für rauhe “rough” Kolonien) führte zur Bildung von S Kolonien. ▪ Daraus folgt, dass in der aufgereinigten DNA die genetische Information enthalten gewesen sein musste, die für die Transformation von R in S Bakterien verantwortlich war. MacLeod McCarty 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod, and Maclyn McCarty 11 Nukleinsäuren – DNA, der Träger der Erbinformation Oswald Avery (21.10.1877 –20.02.1955), Colin MacLeod (28.01.1909 – 11.02.1972) & Maclyn Mc Carty (09.06.1911 –02.01.2005) Sie bestimmten die biochemische Natur des ‚Transformierenden Prinzips‘, das von Griffith entdeckt wurde. Sie reinigten DNA, RNA und Protein von einem hitzeinaktivierten S-Stamm auf und untersuchten, welche Fraktion einen R-Stamm in einen S-Stamm transformieren konnte. Experiment: Hitzeinaktierter S-Stamm wurde mit Protease, danach mit RNAsen und schließlich mit DNAsen behandelt. Beobachtung: Sowohl Protease- als auch RNAse Behandlung inhibierte die Transformation nicht. Erst die Behandlung mit DNAsen blockierte die Transformation. Schlussfolgerung: Das genetische Material kann nicht RNA oder Protein sein, sondern muss DNA sein. 12 https://www.youtube.com/watch?v=0QjVnJ7H198  Nukleinsäuren – DNA, der Träger der Erbinformation S: in Aminosäuren, nicht in DNA P: in DNA, nicht in Aminosäuren ▪ Hershey and Chase Experiment: 1952 S35 P32 Alfred Hershey, Nobel Prize 1969 Martha Chase 13 ▪https://www.youtube.com/watch?v=g9JQURwseIY Nukleinsäuren – DNA, der Träger der Erbinformation Not in RNA DNA: A,C,G,T RNA: A,C,G,U Not in DNA 14 Nukleinsäuren: Warum gibt es Thymin und Uridine? ▪ Obwohl DNA ein sehr stabiles Material ist, was auch benötigt wird für den Speicher der genetischen Information, ist DNA ein komplexes organisches Molekül, das selbst unter physiologischen Bedingungen durch spontane chemische Prozesse verändert werden kann. ▪ Falls diese Veränderungen unentdeckt blieben, würde das in Mutationen resultieren. ▪ Eine spontane Deaminierung von Cytosin zu Uracil in der DNA geschieht etwa 100x pro Zelle und Tag irgendwo im Genom. ▪ Wenn Uracil selbst eine Base in der DNA wäre, wären diese Ereignisse in der Zelle nicht erkennbar, könnten somit nicht repariert werden und würden eine Vielzahl von Mutationen verursachen. Cytosin Uracil 15 Nukleinsäuren: Die Doppelhelix ▪ Erwin Chargaff entdeckte zwei fundamentale Regeln über DNA: ▪ (i) In einer DNA ist das Verhältnis von Guanine gleich dem von Cytosin UND das Verhältnis von Adenin ist gleich dem von Thymin. Dies gab einen Hinweis auf eine Basenpaarung in der DNA. G=C and A=T ▪ Chargaff (ii) Die relative Mengen von GC und AT sind verschieden in verschiedenen Arten. 16 Nukleinsäuren: Die Doppelhelix ▪ Maurice Wilkins & Rosalind Franklin: X-ray Kristallographie zeigte, dass die DNA eine Helix bildet aus einer Kette von Nukleotiden. Wilkins Franklin 17 DNA Nukleinsäuren: Die Doppelhelix ▪ Basenpaarungsregeln: (i) Ein Purin muss mit einem Pyrimidin paaren; Purine und Pyrimidine können nicht mit sich selbst paaren. ▪ (ii) Eine Base die 2 (oder 3) Wasserstoffbrücken bildet, kann nur mit einer anderen Base paaren, die auch 2 (oder 3) Wasserstoffbückenpaare benötigt. Wasserstoffbrücken sind einzeln schwach, aber zusammengenommen sehr stark. 18 Nukleinsäuren: Die Doppelhelix ▪ Aufbauend auf den Daten der X-Ray Kristallographie und der 3D Visualisierung durch Modellbauten, schlugen Watson und Crick vor, dass die DNA eine Doppelhelix – eine verdrehte Leiter- ist mit zwei Phosphat-Zucker Grundgerüsten und Basenpaarungen als Verbindungen. Nobelpreis zusammen mit Wilkins. Nature Veröffentlichung am 25. April 1953. James Watson 06.04.1928 Francis Crick 19 08.06.1916 – 28.07.2004 https://www.youtube.com/watch?v=qoERVSWKmGk Nukleinsäuren: Die Doppelhelix 20 Nukleinsäuren: Die Doppelhelix ▪ DNA Dimensionen: (i) Die DNA Doppelhelix hat eine gleichförmige Breite von 2 nm (= 20 Angström). Das liegt an den Purin-Pyrimidin A=T und G=C Basenpaarregeln. ▪ (ii) Eine Umdrehung (= Periodizität) ist 3.4 nm, d.h. zwei Basenpaare liegen 0.34 nm auseinander. ▪ (iii) Die beiden Stränge der DNA sind antiparallel und zueinander komplementär angeordnet. D.h. kennt man die Basenabfolge des einen Stranges, kann man den anderen Strang komplementär ergänzen wg der Basenpaarungsregeln. ▪ (iv) Wg der Helixstruktur gibt es eine major und eine minor groove (Furche). 21 Nukleinsäuren: Zwei komplementäre und antiparallele Stränge 22 Genome: Das grösste Genom besitzt eine Amoebe: Amoeba dubia, ein Einzeller mit 686,000 Mb, 200 x größer als das Humangenom und 40,000 x größer als das Hefegenom 23 Das Saccharomyces cerevisiae Genom 6417 Genes 16 Centromere 352 ARS-Elemente 24 ARS = autonomously replicating sequence Das Saccharomyces cerevisiae Genom Pulsfeld-Gelelektrophorese von Hefechromosomen. ▪ In Agarose eingebettete Hefezellen werden aufgelöst, um intakte chromosomale DNA zu erhalten. ▪ Anschließend werden die Chromosomen unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes in einem Agarosegel der Größe nach aufgetrennt. ▪ Die Apparatur verändert periodisch die Richtung des elektrischen Feldes, so dass auch sehr langer DNA- Moleküle (bis zu mehreren Millionen bp) diese Auftrennung überstehen. 25 Saccharomyces cerevisiae: CHRIII NATURE· VOL 357. 7 MAY 1992 26 Das Saccharomyces cerevisiae Genom TEL CEN14 TEL YNL004w YNL001w YNR004w YCL018W = LEU2 YNL003c YNL002c YNR001c YNR002c YNR003c Systematische Nomenclatur von S. cerevisiae Genen: Y : Yeast A-P : Chromosom 1 (A) bis16 (P) L/R : Linker (L) oder rechter (R) Arm des Chromosoms XXX : Genenummer entsteht bei Zählung ab dem Centromer; die Zahl hat immer drei Stellen w/c : zeigt die Trranscriptionsrichtung an: oberer Strang : w für Watson, 27 untere Strang: c für Crick Saccharomyces cerevisiae: ARS elements ▪ Autonom replizierende Sequenzen (ARSs) der Hefe S. cerevisiae fungieren als Replikationsursprünge auf Plasmiden und auch auf Chromosomen. ▪ Die ARS-Funktion erfordert eine Kopie der ARS core consensus Sequenz (5'-[A/T]TTTAT[A/G]TTT[A/T]-3') und zusätzliche Sequenzen 3' zum T-reichen Strang der Konsensus-Sequenz. ▪ Unsere Analyse eines ARS von Chromosom III, des C2G1-ARS, legt nahe, dass die ARS-Funktion vom Vorhandensein einer genauen Übereinstimmung mit dem Kernkonsens und dem Vorhandensein zusätzlicher Beinahe-Übereinstimmungen in der 3'-flankierenden Region abhängt. ▪ Wir haben gezeigt, dass die ARS-Funktion durch mehrere Übereinstimmungen mit dem Kernkonsensus vermittelt werden kann, indem wir synthetische ARS-Elemente aus Oligonukleotiden konstruiert haben, die Kopien der Konsensussequenz enthalten. ▪ Wir stellen fest, dass zwei Kopien des Kernkonsensus für die ARS-Aktivität ausreichen und dass ein künstliches ARS-Element, genauso effizient ist wie ein natürliches chromosomales ARS. ▪ ECC-DNA Elemente tragen ein ARS. 28 https://genesdev.cshlp.org/content/20/14/1874/F1.expansion.html  Plasmide als Werkzeuge in der Biotechnology ▪ Plasmide sind einfache extrachromosomal DNA Elemente ▪ Künstliche Plasmide werden zum Klonieren von DNA-Fragmenten verwendet. 29 https://www.slideshare.net/basimks/p-bluescript Plasmide als Werkzeuge in der Biotechnology ▪ Plasmide müssen einen Selektionsmarker tragen: z.B. das Ampicillin-Resistenzgen, ampR. ▪ Penicillin inhibiert die Transpeptidase für die Zellwandsynthese. ▪ Plasmide benötigen einen Replikationsursprung: origin of replication (ori). Hier beginnt die Replikation, d.h. Die Neusynthese zur Verdoppelung der DNA. ▪ Eine Multiple Cloning Site – ist hilfreich für das Einbringen von DNA-Fragmenten oft kombiniert mit einem lacZ Gen, das für eine b-Glucosidase kodiert. 30 Saccharomyces cerevisiae Shuttle vectors 31 Saccharomyces cerevisiae Shuttle vectors 32 Saccharomyces cerevisiae: Centromere 33 https://europepmc.org/article/pmc/pmc3018795 FEMSMicrobiolRev38(2014)185–200 Das Saccharomyces cerevisiae Genom 34 Das Saccharomyces cerevisiae Genom ▪ A direct selection procedure has been used to isolate 11 distinct yeast genomic DNA fragments that eliminate the extreme segregation bias characteristic of autonomously replicating yeast plasmids… ▪ Nucleotide sequence comparison of the ten centromere DNAs gives a new picture of conserved centromere DNA elements. 35 Saccharomyces cerevisiae: Mother bias A B mother cells daughter cells mother cells daughter cells ARS-plasmids CEN-ARS-plasmids 36 plasmid Saccharomyces cerevisiae: Mother bias A B mother cells daughter cells mother cells daughter cells ARS-plasmids CEN-ARS-plasmids 37 plasmid  Das Saccharomyces cerevisiae CENtromere 38 https://doi.org/10.1002/bies.950150704 DOI:10.1534/genetics.105.046458 ▪ We constructed Aspergillus nidulans transformation plasmids containing the A. nidulans argB+ gene and either containing or lacking centromeric DNA from Saccharomyces cerevisiae chromosome XI (CEN11). ▪ Stable haploid transformants were obtained with both plasmids. ▪ Plasmid DNA was recovered from a transformant containing CEN11, and the sequence of the essential portion of CEN11 was determined to be unaltered. ▪ The CEN11 sequence had little or no effect on chromosome stability. ▪ Thus, CEN11 does not prevent chromosomal integration of plasmid DNA and probably lacks centromere activity in Aspergillus spp. 39 Ashbya gossypii CEN-DNA CDE I 1 CATAATTCATCACGTGAA-ATAAATAATTAGATTTTATCTCAACTATTA-TTTATAATTTAAACTTTTAAGTATACGAAT CEN1 1 ATTTTTAAATCATGTGACCGTAAACTTTAAATATTAAATTTATCTAATAATTATATAAATTATTCTAAAATA-AAACAAG CEN2 1 AATAAACGTTCACGTGATAATATAAGATTTTACAAAACCTGTTTAATATATATATTTTATTATTATAAAACTCAAATTTA CEN3 1 TTGTTATAGGCACGTGACCAATATCAATAAAATTAAAACCCACTTATTATTATAATCAATAATTTATAAATGTTGATGAA CEN4 1 CGCAATGTAGCACGTGAC-ATAAATATGAAATTTACTATGTGCTTGCTT-TATTTAAAATAAGTTTATAAAGTTAGTAAA CEN5 1 AATATTGTATCACATGATCAATAA-AACCAAACTATTAACAAATTATTAATATTAAGAAATTATTTTAAATATCTAT-AT CEN6 1 TTACTTTAATCACGTGAATAATTTTCACAAAGATTTTACAATACTATTATTTTTTGAAATATATTTAAAATATATTAGAG CEN7 CDE II 79 ACTATAAGTGCAATATATATATATATCTAAAATATTGATAAAATAGATACTTTTATCTTTTGTAT-TAACAATTTGTTTC CEN1 80 TATTTACCTACATAATATATTAATATATATTATTATTAAACTAGAACTTTATTAAGTTCAATAATATA-GTATAAAGCTT CEN2 81 AATTTTAGCATATAATTTATTTTAATTTA-TACTTTTAATTCTACCATTTATAT-TATATTATTTATGTAGATTTTACTA CEN3 81 TATTTCCAGTTCTATATTTTTATAATATATTATGTCAATATATTATATTAATATAT-TAATTTCAATGTTTGTGTTAAAT CEN4 79 AATATCAGAGTA-TATATATTTAATTAAATAATATCC-TAAAATATACTAATACAATTTATCAAT-TAAGCTTTATACAC CEN5 79 TATTTATCTGCAAGTTTTAATATATTA-AATATATTATAAAAATATTTATATACAAATTATTACTATGTATATTATAAAC CEN6 81 AATACACGCTTCTATAAATTTATAATATAATGTTTTAAAACATAACATATATACCTGTTAATATAATCTATTCGTAACAT CEN7 CDE III 158 TTTGTATGTTTTTATTTTTTCTTATATGTTTATATGTTCCGAAA--ATAAAAATAAGTTATGGT CEN1 159 AAATAGGAATATATAAATAATTTAT-TGTATGGTATTTCCGAACTTATATTTAAACTTAAAAAT CEN2 159 TTTTAGCT-TTTTTCATTATCATTATTGTTTGTGTTTTCCGAAA--ATATAAATGTTATTTTTG CEN3 160 ATAGAGTTA--TTAAAT-ATTAAATATGTATGTTGTTTCCGAAATTAT-TAAATATTTTAATAT CEN4 156 TTTATAAATAGTTATAATTATAGATGTGTATACGATTTCCGAAAC-ATAAAAATATTTCACTG CEN5 158 ATTAAATTAAATATGAATATTATATATGTATGTCTTTTCCGAAAATAT-TTTTAAAATACATA CEN6 161 TTTAAATCA--TTACATTATTTTGTATGTGTGTTTGTTCCGAACTATA-AAAATATGTTTA-AA CEN7 40 Ashbya gossypii CEN-DNA Holleya sinecauda = Eremothecium sinecaudum Ashybya gossyppii = Eremothecium gossypium Ashbya CEN-DNA is functional in Holleya 41 Ashbya gossypii CEN-DNA AgCEN5-ARS AgARS ScARSH4 42 Mother bias  Point-like vs regional Centromeres 43 FEMSMicrobiolRev38(2014)185–200 Wie findet man Centromere? Warum: ▪ Zahl der Centromere = Zahl der Chromosomen ▪ Hilft bei der Genomannotierung ▪ Erlaubt Analyse von Genomevolution Locally reduced GC content around centromeres is consistent with a model in which GC content correlates with recombination rate, and recombination is suppressed around centromeres, although the troughs are unexpectedly wide (100–300 kb). 44 45 Wie findet man Centromere? 46 ZUSAMMENFASSUNG ▪ Centromere sind für die ordnungsgemäße Chromosomentrennung unerlässlich. ▪ Trotz umfangreicher Forschung sind die Centromerpositionen in Hefegenomen schwer zu ermitteln und bei den meisten Arten sind sie noch immer unbekannt. ▪ Vor kurzem wurde der chromatin conformation capture assay - Chromatin-Konformationserfassungs Assay Hi-C für die Inferenz von Zentromerpositionen beschrieben. ▪ Wir beschreiben eine Methode, Centurion, die die Positionen aller Centromere in einem einzelnen Genom gemeinsam aus Hi-C-Daten ableitet, indem sie die Tendenz der Centromere ausnutzt, sich im dreidimensionalen Raum zu gruppieren. ▪ Wir demonstrieren zunächst die Genauigkeit von Centurion bei der Identifizierung bekannter Centromerpositionen aus high coverage Hi-C-Daten von S. cerevisiae. ▪ Anschließend verwenden wir Centurion, um Centromerpositionen in 14 Hefearten zu ermitteln. ▪ Über alle Mikroben hinweg, die wir in Betracht ziehen, sagt Centurion 89 % der Centromere innerhalb von 5 kb ihrer bekannten Standorte voraus. ▪ Schließlich sagen wir Centromerkoordinaten für sechs Hefearten voraus, für die derzeit keine Centromeranmerkungen vorliegen. ▪ Diese Ergebnisse zeigen, dass Centurion zur Zentromeridentifizierung für verschiedene Hefearten und möglicherweise andere Mikroorganismen verwendet werden kann. 47  Wie findet man Centromere? 48 Saccharomycopsis spec. Saccharomycopsis fermentans  Joke of the day 49 https://www.redbubble.com/i/poster/DNA-and-RNA-Joke-by-Sci-Ninja-Blog/88247406.LVTDI https://www.wattpad.com/528254130-hilarious-jokes-you-will-love-joke-102-dna Klausurfragen: ▪ Beschreiben Sie das Griffith-Experiment. Wie konnte Avery belegen, welche Moleküle die genetische Erbinformation tragen. ▪ Die Hefe Saccharomyces cerevisiae besitzt 16 Chromosomen (= 1N). Grundlegende Funktionen werden von DNA-Elementen verrichtet, die wir Telomere, ARS-Elemente und Centromere nennen. Erklären Sie die jeweiligen Funktionen dieser drei Elemente. ▪ Erklären Sie, warum es bei ARS-Plasmiden einen „Mother bias“ gibt. 50