Técnicas de Laboratorio de Bioquímica Clínica I - PDF

UD I: Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I  Contenidos UD II Las técnicas utilizadas en el laboratorio de bioquímica clínica que NO emplean las radiaciones electromagnéticas para la determinación de los parámetros...

UD I: Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I  Contenidos UD II Las técnicas utilizadas en el laboratorio de bioquímica clínica que NO emplean las radiaciones electromagnéticas para la determinación de los parámetros bioquímicos Espectrometría de masas Cromatografía Osmometría Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I  Contenidos UD I Las técnicas utilizadas en el laboratorio de bioquímica clínica que emplean las radiaciones electromagnéticas para la determinación de los parámetros bioquímicos Espectrometría de absorción molecular Espectrometría de absorción y emisión atómicas Espectrometría de luminiscencia Espectrometría de dispersión de la radiación Refractometría de líquidos Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Introducción a las técnicas de bioquímica clínica  La bioquímica clínica es la especialidad de las ciencias de la salud que estudia los procesos metabólicos y moleculares que tienen lugar en nuestro organismo, tanto en los estados de salud como en los de enfermedad Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Introducción a las técnicas de bioquímica clínica  Las magnitudes bioquímicas son signos clínicos, valores cuantitativos de la química de los procesos metabólicos que se utilizan para conocer el estado clínico de un paciente Las pruebas bioquímicas son muy habituales entre los análisis clínicos Determinaciones de magnitudes bioquímicas:  A partir de muestras biológicas (ej: Ch, glucosa, bilirrubina; en sangre u orina)  Aplicando métodos químicos y bioquímicos de laboratorio (técnicas instrumentales: UD I, UD II) Proporcionan información básica en:  Prevención, diagnóstico y evolución de enfermedades  Seguimiento de la respuesta a tratamiento Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas  Métodos espectrométricos: grupo de métodos analíticos que se basan en las interacciones de la radiación electromagnética con la materia.  Rapidez  Automatización  Instrumentación  Radiación electromagnética: es el tipo de energía que toma varias formas: luz, calor, radiante, rayos gamma, rayos X, radiación ultravioleta, de microondas y de radiofrecuencia Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas  Autoanilazodores Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas  Las técnicas que se basan en la medición de las radiaciones electromagnéticas por sus propiedades de interacción con la muestra, reciben el nombre de técnicas espectrométricas  Información cualitativa y cuantitativa del analito en estudio  Principales radiaciones utilizadas en las técnicas de espectrometría:  Luz visible (VIS)  Luz ultravioleta (UV)  Luz infrarroja (IR) Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas  Las técnicas que se basan en la medición de las radiaciones electromagnéticas por sus propiedades de interacción con la muestra, reciben el nombre de técnicas espectrométricas  La energía, se manifiestan de múltiples formas, entre las que se cuentan las radiaciones electromagnéticas  Las radiaciones electromagnéticas se pueden describir:  Como partículas: fotón  Como ondas: Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas Las radiaciones electromagnéticas. Conceptos básicos Magnitudes de las ondas electromagnéticas  Magnitudes características: o Amplitud (A) (desviación máxima de la onda con respecto al valor medio) o Longitud de onda ( (lambda, λ): (distancia entre dos crestas sucesivas: nanómetros) o Frecuencia (gamma, γ) (nº de oscilaciones por segundo: Herzios)  λ y γ: son inversamente proporcionales Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas Las radiaciones electromagnéticas. Conceptos básicos Magnitudes de las radiaciones como partículas  Energía electromagnética de un fotón :  Cuanto mayor es la frecuencia de una onda : mayor es su energía  Cuanto mayor es la longitud de onda : menor es su energía Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas Las radiaciones electromagnéticas. Conceptos básicos El espectro electromagnético  Es el conjunto de radiaciones electromagnéticas que existen en la naturaleza  Se ordena en regiones según la longitud de onda Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas  Las radiaciones empleadas en las técnicas instrumentales son: la ultravioleta visible, los infrarrojos y los rayos X Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas Interacción radiación-muestra Transmisión: radiación incide sobre una sustancia sin producirse pérdidas de energía ni cambios de dirección Absorción: radiación incide sobre una sustancia y se produce pérdidas de energía. Las moléculas que absorben radiación, pasan a estado excitado Emisión: moléculas o átomos excitados, liberan energía y vuelven a su estado de reposo Dispersión: radiación incide sobre una sustancia, y no cambia su energía, pero si la dirección de propagación Refracción: radiación incide sobre una solución de diferente naturaleza, y cambia de dirección de propagación Reflexión: radiación incide sobre una sustancia, rebota y cambia de dirección Difracción: la radiación se desvía al pasar por el extremo de una superficie o al atravesar una rendija Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas Las radiaciones electromagnéticas. Conceptos básicos Interacción radiación-muestra Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas Las radiaciones electromagnéticas. Conceptos básicos Y principales técnicas espectrométricas Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas La instrumentación: el espectrofotómetro  Equipo que se usa en las técnicas de espectrofotometría  Es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por la solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia  Luz incidente:  Estable  Continua  Monocromática  Vídeo: Técnicas básicas en Bioquímica: Espectrofotometría. Duración 5:58. URL: https://youtu.be/fXjP10sdmQU Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas La instrumentación: el espectrofotómetro  Fuentes de radiación:  Fuentes de espectro continuo:  Lámparas de filamento de tungsteno (wolframio)  Lámparas de filamento de haluro de tungsteno  Lámparas de hidrógeno y deuterio  Lámparas de arco de xenón o mercurio a elevada presión  Fuentes de espectro líneas:  Lámparas de vapores de mercurio  Lámparas de vapor de sodio  Lámparas de cátodo hueco  Fuentes de luz láser (los más modernos) Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas  Monocromador  Un monocromador es un dispositivo óptico que permite seleccionar y transmitir una radiación monocromática a partir de la luz generada por la fuente emisora, que produce una amplia gama de longitudes de onda  Monocromador = rendija de entrada + selector de longitud de onda + rendija de salida Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas  Monocromador: rendija de entrada  Evita la entrada de luz difusa  Enfoca de forma que la luz pasa siendo un rayo organizado en luz paralela Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas  Monocromador: selector de longitud de onda  El ancho de banda se define como el intervalo de longitudes de onda medido en la mitad de un pico del flujo radiante detectado Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas  Monocromador: selector de longitud de onda  Selectores de longitud de onda: Redes de difracción Prismas Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas La instrumentación: el espectrofotómetro  Selectores de longitud de onda Redes de difracción: - consiguen mejores anchos de banda. Ancho de banda < 50 nm - es un vidrio o una superficie metálica con un gran número de hendiduras paralelas, situadas a distancias iguales entre si Prismas: ancho de banda entre 0,5 y 1,5 nm De vidrio: VIS, y UV próximo De cuarzo: UV lejano Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas  Monocromador: rendija de salida  Dirige el haz sobre la cubeta Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas La instrumentación: el espectrofotómetro  Cubetas: se fabrican en materiales que no absorban la λ deseada.  Generalmente 1 cm de ancho  Volúmenes variables  Dos caras Plástico: para luz visible Cuarzo: para luz UV Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas La instrumentación: el espectrofotómetro  Detector: se basa en el efecto fotoeléctrico (los fotones que inciden en la sustancia, originan liberación de electrones, que producen una corriente eléctrica proporcional a los fotones recibidos. Esta señal eléctrica es mínima, por lo que debe ser amplificada para poder ser medida) Tipos de detectores: Fototubos y fototubos multiplicadores Fotodiodos Detectores de carga acoplada (CCD)  Sistema de registro y lectura: amplificación de la señal eléctrica y transformación en señal digital Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas La instrumentación: el espectrofotómetro Tipos de espectrofotómetros  Espectrofotómetros de HAZ SIMPLE  Espectrofotómetros de DOBLE HAZ: en el tiempo (alterna el paso entre la cubeta del blanco y la de la muestra) y en el espacio (el haz atraviesa al mismo tiempo la cubeta del blanco y la de la muestra. Se duplica todo el instrumental) Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular La instrumentación: el espectrofotómetro  Las longitudes de onda que cada sustancia absorbe son características de la molécula (se pueden identificar las sustancias)  Análisis por espectrometría de absorción molecular, puede ser:  Cuantitativo: Se realiza con radiaciones UV-VIS Se fundamenta en la Ley de Lambert-Beer Análisis más usado en el laboratorio de bioquímica (usan patrones; soluciones de concentración conocida, para calcular la concentración en la muestra)  Cualitativo: Se realiza con radiación IR Se usa para el análisis de la composición de cálculos urinarios Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular La absorción molecular Las moléculas se componen de átomos unidos entre sí por diferentes orbitales de enlace que comparten electrones. Cuando una molécula absorbe radiación electromagnética, pasa del estado de reposo al estado excitado (de mayor energía). Este cambio se conoce como TRANSICIONES Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular La absorción molecular  Un átomo o una molécula absorberá energía: cuando pasa de un estado de menor energía a otro de mayor energía  Un átomo o molécula emitirá energía: cuando pasa de un estado de mayor energía a otro de menor energía Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular La absorción molecular  Fenómeno de absorción: cuando una partícula en estado de reposo (basal o fundamental), interacciona con un haz de luz, ABSORBE energía pasando a un estado excitado. La partícula en estado excitado tiende a volver de forma espontánea a su estado de reposo desprendiendo la energía absorbida en forma de CALOR.  Fenómeno de emisión: algunos compuestos, tras ser excitados con luz, vuelven a su estado fundamental produciendo la emisión de energía radiante (LUZ). En este caso lo que se mide es la energía emitida Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular La absorción molecular Transmitancia, absorbancia y espectro de absorción Transmitancia: cociente entre la intensidad de luz transmitida (It) e incidente (Io). No tiene unidades. Valores entre 0-1. 0 o 0%: no se transmite luz; por tanto, la absorción es total 1 (o 100%): se transmite toda la luz; por tanto no existe absorción Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular La absorción molecular Transmitancia, absorbancia y espectro de absorción Absorbancia Cuando la transmitancia se expresa en %: A = 2 – log %T Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular La absorción molecular Transmitancia, absorbancia y espectro de absorción El espectro de absorción es el conjunto de bandas (transiciones electrónicas) que indican la cantidad de luz absorbida por una sustancia a diferentes valores de longitud de onda, y es único o característico de cada sustancia Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular La ley de Lambert-Beer Transmitancia, absorbancia y espectro de absorción La ley de Lambert-Beer enuncia que la absorbancia de un analito es directamente proporcional al coeficiente de absorción de la molécula (ε), a la distancia recorrida por el haz de luz en la disolución (b) y a la concentración de dicho analito (c) Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular La ley de Lambert-Beer Linealidad y desviaciones de la ley de Lambert-Beer La linealidad es el intervalo de concentraciones entre las cuales existe una relación lineal entre la concentración y la absorbancia (Es decir, se cumple la ley de Beer). Desviaciones instrumentales: Alteraciones en la luz incidente Errores en la rendija de salida Errores debido a la cubeta Errores debido al detector Desviaciones químicas: Variaciones del pH Absorbancia del solvente Interferencias Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular  El espectrofotómetro más usado es el espectrofotómetro UV-VIS Manejo del espectrofotómetro UV-VIS: Encender 20´antes: calentamiento Seleccionar la λ, modo de medida (ABS o T) y lámpara (UV o VIS) Ajustar al 0% de absorbancia Medir la muestra problema Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Curvas de calibrado En las muestras biológicas, hay otras moléculas en la muestra, que actúan de interferentes puesto que absorben a la misma longitud de onda. Y se debe tener en cuenta la ABS del disolvente Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Curvas de calibrado Antes de realizar una medición espectrofotométrica se deben hacer mediciones de la absorbancia que no es debida a la sustancia que queremos estudiar. Esto son: La ABS debida a corrientes oscuras o radiaciones que no procede de la fuente de luz La ABS debida a la composición de la cubeta, los disolventes y otros reactivos usados Por tanto, para establecer la relación entre la ABS de la muestra y la concentración del analito se requiere aplicar antes una calibración de la técnica, que permita obtener una relación matemática entre ambas Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Curvas de calibrado Ley de Lambert-Beer real: El proceso de calibración: 1) Mediante un factor de calibración 2) Mediante una curva de calibración Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Curvas de calibrado Procedimiento mediante un factor de calibración Patrón de concentración conocida: Cp, Ap Concentración de otra disolución de la misma sustancia Teniendo en cuenta la absorbancia del blanco Ab: Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Curvas de calibrado Procedimiento mediante un curva de calibración La curva de calibración es la representación gráfica de la ABS (ordenadas) frente a la concentración (abcisas) Construcción mediante disoluciones sucesivas del patrón de concentración conocida, y se miden las absorbancias: Cp, Ap La curva de calibración es la recta que se aproxima lo más posible a las coordenadas obtenidas y que se obtiene por métodos matemáticos de regresión lineal Una vez obtenida, se extrapola en la recta el valor de la concentración de la muestra a partir de la absorbancia medida con el espectrofotómetro Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Curvas de calibrado Procedimiento mediante un curva de calibración Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Mediciones a punto final, cinéticas y enzimáticas La mayoría de analitos no absorbe luz: uso de reactivos para provocar reacciones que den lugar a sustancias mensurables. Cálculo de magnitudes bioquímicas, se dividen en tres magnitudes: Concentración en técnicas de punto final: colorimétricas o enzimáticas Concentración en técnicas cinéticas Actividad enzimática Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I  Espectrometría de absorción molecular Cálculo de la concentración a punto final colorimétricas Se diseñan reacciones analíticas con reactivos comerciales, que transforman el analito en una sustancia mesurable que absorba dentro de la región visible del espectro electromagnético (la disolución adquiere color) En las determinaciones con reactivos comerciales suele haber exceso de reactivos para asegurar que el analito reacciona en su totalidad Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I  Espectrometría de absorción molecular Cálculo de la concentración a punto final enzimática Se consigue la sustancia mesurable, mediante la intervención de una enzima La enzima realiza su función, ante el sustrato adecuado Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Cálculo de la concentración a punto final enzimática Mediación en reacciones enzimáticas ACOPLADAS: El producto de una reacción, es el sustrato de la siguiente, que lo transforma en un producto coloreado que se puede medir espectrofotométricamente El NADPH es coloreado y proporcional a la glucosa Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Cálculo de la concentración a punto final (química o enzimática) En las condiciones establecidas por el protocolo de la casa comercial, se emplea un factor de dilución para el cálculo de la concentración o se aplican factores de conversión. Mediación en reacciones química (colorimétrica): LA ABS del producto, es proporcional a la concentración de analito Ejemplo: medida del calcio por el método de la ortocresolftaleína complexona ( el calcio, forma un complejo coloreado) Mediación en reacciones enzimáticas: La c del producto coloreado es proporcional a la c del analito Ejemplo: media de la glucosa por el método de la hexoquinasa Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Cálculo de la concentración en técnicas cinéticas (química o enzimática) Se mide la velocidad de reacción antes de que ésta concluya La presencia del analito en la muestra da lugar a la aparición o desaparición de sustancias capaces de absorber la radiación a la longitud de onda medida La variación de la absorbancia por unidad de tiempo es proporcional a la concentración y/o actividad del analito: La ley de Lambert-Beer, se modifica o adapta (variación de la ABS). Y se dispone de una disolución c conocida: Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Cálculo de la actividad enzimática La concentración de enzimas en suero es muy baja, pero es posible determinar su actividad, la cual es proporcional a su concentración La cantidad de enzima, se realiza, midiendo la velocidad de reacción: bien la aparición de producto, o la desaparición de sustrato Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción molecular Mediciones a punto final, cinéticas y enzimáticas Cálculo de la actividad enzimática Métodos a punto final: Se determina la absorbancia a la longitud de onda indicada. Según el periodo de incubación de la enzima, el método es: A un punto: no existe A dos puntos: existe. Se realizan dos medidas: una después de la incubación, y otra al final de la reacción). Métodos cinéticos: Se asegura la condición de velocidad constante durante el ensayo Se realizan medias a intervalos de tiempo de 3-5´, para saber que realmente estamos en la fase lineal de la curva La actividad enzimática se expresa en: Unidad de actividad enzimática: U Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción infrarrojos Espectrometría de absorción molecular en el infrarrojo Composición química de los cálculos urinarios Se obtienen unas gráficas (% tansmitancia frente a longitud de onda),que se comparan con gráficas patrones Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción atómica La espectrometría de absorción atómica se basa en la capacidad de los electrones de un elemento químico de pasar de su capa de valencia (estado basal) a orbitales de mayor energía (estado excitado) gracias a la energía absorbida en forma de radiación electromágnética UV-VIS Para conseguir la absorción atómica es necesario la transformación de la muestra a vapor atómico mediante el proceso de Atomización (por llama o electrotérmica con horno de grafito) Las longitudes de onda que absorbe un elemento químico tienen un ancho de banda muy estrecho y se denominan líneas espectrales Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción atómica Espectrometría de absorción atómica con llama  Para bajas concentraciones (ppm)  Fuente: lámpara de cátodo hueco. El cátodo es del mismo elemento que se pretende analizar en la muestra (analito)  Sistema de atomización por llama. Formado por:  Nebulizador (nebuliza la muestra, la transforma en aerosoles)  Cámara de premezcla (mezcla los aerosoles con el gases de la premezcla)  Quemador (se somete a la llama, transformando en átomos que es la especie absorbente) Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción atómica Espectrometría de absorción atómica con llama  Interferencias: químicas, de ionización o de matriz Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de absorción atómica Espectrometría de absorción atómica con atomización electrotérmica  La espectrofotometría de absorción atómica con atomización electrotérmica y horno de grafito es más sensible que la atomización con llama y se utiliza cuando los metales que se van a medir se encuentran en muy baja concentración  El horno de grafito:  Un tubo de grafito sujeto por dos electrodos. Con un orificio central por donde se introduce la muestra  Un sistema de refrigeración por agua y gas  Los electrodos dan lugar a una corriente que atomiza rápidamente la muestra Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de emisión atómica  Algunos elementos químicos, tras excitados, vuelven a su estado fundamental. Cuando vuelven a su estado fundamental, emite el exceso de energía que emite en forma de LUZ, cuya longitud de onda es característica de cada elemento  La intensidad luminosa producida por los átomos : es directamente proporcional al número de átomos excitados : es proporcional a la concentración del compuesto en la muestra  Se calcula la cantidad de elemento químico a partir de la intensidad  Dos métodos de espectrometría de emisión atómica:  Con llama o fotometría de llama  Por plasma Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de emisión atómica  Espectrofotometría de emisión atómica de llama:  La fotometría de llama utiliza el calor aplicado mediante llama para producir la atomización y la excitación atómica, y la posterior emisión de luz cuando vuelven al estado fundamental.  La instrumentación es igual a la de del espectrofotómetro de absorción atómica por llama, pero carece de fuente de luz Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de emisión atómica  Espectrofotometría de emisión atómica por plasma:  El plasma es una mezcla gaseosa conductora de electricidad constituida por cationes y electrones.  El plasma más usado es el Argón: altas temperaturas (hasta 10000K) : alta eficiencia en al atomización  No se usa habitualmente en bioquímica clínica Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de luminiscencia Se entiende por luminiscencia todo fenómeno de emisión de luz que no está asociado a altas temperaturas  Clasificación según el origen de la excitación:  Fotoluminiscencia: la energía de excitación, procede de la absorción de fotones:  Fluorescencia  Fosforescencia  Quimioluminiscencia: la energía de excitación, procede de una reacción química  Bioluminiscencia: la energía de excitación, procede de la quimioluminiscencia en un ser vivo  Electroquimioluminiscencia: emisión de luz fría debido a una corriente eléctrica Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de luminiscencia La espectrometría de luminiscencia se basa en la medición de intensidad de la luz emitida para terminar la concentración de la sustancia luminiscente de la muestra Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de luminiscencia Fotoluminiscencia Tras la excitación, el electrón vuelve a su estado fundamental emitiendo radiación de mayor longitud de onda que la recibida  Según el tiempo de emisión:  Fluorescencia: típicamente 10-8 s  Fosforescencia: emite hasta horas Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de luminiscencia Fotoluminiscencia Espectrometría de fluorescencia La espectrometría de fluorescencia o fluorimetría mide la luz fluorescente emitida por moléculas que poseen anillos aromáticos o dobles enlaces conjugados Gran sensibilidad Muestras diluidas (analitos en muy baja concentración) Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de luminiscencia Fotoluminiscencia Espectrometría de fluorescencia Fuente de luz: lámpara de arco de xenón o lámparas de mercurio Dos monocromadores que seleccionan las longitudes de onda de entrada y de salida (la de emisión fluorescente) Cubetas de cuarzo Diseñados en ángulo recto Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de luminiscencia Quimioluminiscencia Espectrometría de fluorescencia Luz emitida por el producto de la reacción de oxidación de un compuesto orgánico por un oxidante en presencia de enzimas Sustancias a muy baja concentración Detección de trazas en sangre En técnicas de inmunoanálisis Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de dispersión de la radiación Se trabaja con suspensiones formadas por agregados procedentes de reacciones antígeno-anticuerpo La dispersión de la luz se fundamenta en la ley de Rayleigh: La dispersión es directamente proporcional a: La concentración de partículas El peso molecular de las partícula La dispersión es inversamente proporcional a: El cuadrado de la distancia entre detector y cubeta La cuarta potencia de la longitud de onda Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de dispersión de la radiación Turbidimetría La turbidimetría es la técnica de análisis cuantitativo que consiste en medir la disminución de la intensidad el haz de luz (transmitancia) que atraviesa la cubeta que contiene la suspensión Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Espectrometría de dispersión de la radiación Nefelometría La nefelometría es la técnica de análisis cuantitativo de suspensiones que consiste en medir la intensidad de luz dispersada en un ángulo determinado (10º-90º con respecto a la cubeta). A bajas concentraciones Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Refractometría de líquidos Técnica de análisis cuantitativo basada en el fenómeno de refracción de la luz La velocidad a la que se propaga la luz depende del medio de propagación (de su índice de refracción) La ley de Snell relaciona el índice de refracción con el cambio de dirección El índice de refracción es directamente proporcional a la cantidad de sustancias disueltas en una solución: Se puede calcular la concentración de solutos a partir de la variación de dirección Se emplea en el estudio de solutos como la albúmina: Concentración en muestras séricas y/o plasmáticas Peso específico en orina Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Fotometría de reflectancia. Química seca Se utilizan reactivos secos fijados en un soporte La muestra difunde sobre la fase sólida del soporte disolviendo los reactivos: se produce la reacción Se mide la intensidad de la luz reflejada en la superficie tras producirse la reacción Tipos de reflexión: Especular/Difusa /Mixta La reflectancia es el cociente entre el flujo de luz reflejada y el flujo de luz incidente Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Fotometría de reflectancia. Química seca Instrumentación  Partes del espectrofotómetro de reflexión:  Fuente de luz: lámparas de haluro de tungsteno y xenón  Selector de longitud de onda  Sistema óptico: lentes, espejos y filtros  Reactivos de fase sólida: parte reactiva del soporte  Detector, procesador de datos: cuantifican la reacción  Sistema de lectura. Puede ser:  Sobre la superficie: tiras reactivas  Sobre el reverso de la superficie: reactivos multicapa Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Fotometría de reflectancia. Química seca Los reactivos de química seca  Tiras reactivas:  Experimentan un cambio de color al entrar en contacto con la muestra  Partes de una tira:  Soporte de plástico  Matriz de celulosa con reactivos  Se utilizan en diagnóstico rápido o pruebas de autodiagnóstico Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Fotometría de reflectancia. Química seca Los reactivos de química seca  Películas multicapa: lámina de múltiples capas.  La muestra difunde a través de las diferentes capas produciendo la reacción  Se utilizan mediante analizadores automáticos Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I Las técnicas espectrométricas En resumen  Espectroscopía: interacción de la radiación electromagnética con la materia  Análisis espectroscópico: rama de la espectroscopía usada para análisis cualitativo y cuantitativo  Métodos más comunes de análisis: UV, VIS, IR, espectroscopía de fluorescencia molecular  Fundamento: el contenido de la energía de la materia está cuantificado y los fotones de la radiación pueden ser absorbidos o emitidos por la materia  Los métodos difieren unos de otros con respecto a las longitudes de onda de las radiaciones utilizadas en el análisis o la naturaleza molecular frente a la atómica del analito Técnicas de laboratorio de Bioquímica Clínica I