TP 05 : La coloration de Gram - Document PDF

ECOLE NATIONALE SUPERIEURE VETERINAIRE-ALGER Département Préclinique 2eme année Laboratoire de Microbiologie TP 05: La coloration de Gram Préparé par Mme BAKOUR-KERAMANE Leila Et Mme ALLOUACHE Amel...

ECOLE NATIONALE SUPERIEURE VETERINAIRE-ALGER Département Préclinique 2eme année Laboratoire de Microbiologie TP 05: La coloration de Gram Préparé par Mme BAKOUR-KERAMANE Leila Et Mme ALLOUACHE Amel 1  Contrairement à la coloration simple (un seul colorant), la coloration de Gram utilise deux colorants ce qui va permettre de : ✓ Bien visualiser les bactéries en distinguant; leur morphologie (forme), leur mode de groupement (mode d’assemblage), et leur taille. ✓ Constater la pureté de l’échantillon étudié. ✓ Connaitre la nature biochimique de la paroi des cellules purifiées et de les classer selon leur caractère Gram; positif ou négatif. Elle permet d'orienter l'identification de la bactérie étudiée. 2  Etapes à suivre pour réaliser une coloration de Gram 1-Préparer un frottis Comme dans toutes coloration, la réalisation d’un frottis est indispensable. Prélever quelques gouttes d’un bouillon contenant une culture microbienne à l’aide d’une anse de platine stérilisée. Déposer les gouttes prélevées au centre d’une lame. Bien étaler avec l’anse de platine en formant un film très mince. 3 2-Séchage et fixation du frottis. Cette étape consiste à tuer les bactéries et les coller sur la lame: la fixation s’effectue par la chaleur. La lame, tenue par une pince (frottis situé sur le dessus) est passée 3 ou 4 fois dans la flamme du bec Bunsen. Laisser refroidir avant d’entreprendre la coloration de Gram. 4 3- Coloration avec le violet de gentiane (1er colorant): Violet de gentiane phénique Déposer la lame dans le premier colorant le «VIOLET DE GENTIANE» Violet de Gentiane pendant 1min => le violet de gentiane va permettre de colorer le cytoplasme en violet. 5 4- Rincer la lame Rincer à l'eau distillée et égoutter. 6 5- Fixation du 1er colorant: Lugol (iodo-iodure de potassium) Immerger le frottis (la lame) dans le bain contenant le «LUGOL» pendant 1min => le Lugol lugol va permettre de renforcer la coloration violette on appelle cet étape le « MORDANCAGE ». 7 6- DECOLORATION: Alcool à 95% (ou mélange alcool absolu+ 1/5ème d’acétone) Faire un jet d'alcool sur la lame jusqu' à disparition des traces violettes dans la Alcool solution de rejet du jet ou bien plonger la lame dans un bécher contenant de l’alcool. 8 7-Rincer Rincer immédiatement à l'eau distillée et égoutter. 9 8- Coloration secondaire (avec la fuschine): Safranine (ou Fuchsine phéniquée de ziehl) immerger le frottis dans la FUSCHINE pendant 1min => cela va Fuschine permettre de recolorer le cytoplasme décoloré en rose. 10 Séchage Sécher le frottis entre 2 feuilles de papier absorbant ou en passant la lame au dessus de la flamme du bec. Ajouter une goutte d’huile à immersion au centre de la lame au dessus de l’échantillon en prenant soin de laisser la goutte bien bombée pour une bonne observation. 11 Observation au microscope Observer à l'objectif x100 à immersion en prenant soin de bien coller l’objectif à la goutte d’huile. 12 Observation au microscope L’huile à immersion a pour rôle d’améliorer la qualité de l’image en microscopie. L’huile à immersion permet la propagation de la lumière. Cette huile incolore remplace l’air entre l’objet et l’objectif et permet la propagation de la lumière à la même vitesse que dans le verre, évitant ainsi la déformation de l’image. 13  Observation au microscope Résultats A l’issue de cette coloration, on peut distinguer : – Des bactéries colorées en violet foncé ; elles ont gardé le violet, ‘le gram’ elle sont dites ‘Gram positif’. – Des bactéries colorées en rose ou rouge pâle ; elles ont perdu le violet, ‘le Gram’ elles sont dites ‘Gram négatif’. 14  Observation au microscope Sur cette image on voit clairement qu’il y a non pas une seul espèces mais bien deux espèces dans l’échantillon coloré, une qui apparait colorée en rose et une autre colorée en violet. 15 Observation au microscope Sur cette image on voit qu’il y a présence que d’une seul couleur il s’agit d’un Gram positif. On distingue par ailleurs le type d’agencement qui est dit ici en grappe de raisin ou en amas illustré par les cercles bleus. On remarque aussi parfaitement que les cellules sont bien sphérique et de type Cocci. 16  Observation au microscope Cette image montre des bactérie à Gram positif de forme Cocci et qui sont disposées en chainettes. Sur celle-ci les bactérie sont à Gram négatif de forme Bacille sans disposition particulière. 17 Quelques exemples 18  Interprétation de la coloration de Gram La coloration de Gram met en évidence les différences biochimiques situées précisément au niveau de la paroi en distinguant les bactéries à Gram positif des bactéries à Gram négatif. Cette première analyse peut contribuer à orienter sur un traitement empirique (routinier). Observez le schéma suivant: Les Bactéries à Gram Les Bactéries à Gram positif ont une paroi négatif comptent une épaisse composée de couche plus mince de PEPTIDOGLYCANE (de 50 PEPTIDOGLYCANE Lipopolysaccharides (environ 10 % de la à 90 % de la paroi bactérienne). Phospholipides paroi bactérienne) PEPTIDOGLYCANE 19  Interprétation de ce qui se passe Gram Positif Gram Négatif Fixation Bactérie Les bactéries sont incolores à peine visibles au microscope Bactérie Violet de Gentiane Le cytoplasme de toutes les bactéries se colorent en violet Lugol = MORDANCAGE Fixation par le Lugol du violet sur les structures internes Reste Décoloration à l’alcool: Redevient violet décoloration du cytoplasme des bactéries ayant une paroi pauvre en incolore peptidoglycane qui facilite l’entrée de l’alcool pour éliminer le violet.. Contre-coloration à la fuschine Le cytoplasme des bactéries décolorées se colore en rose Bactéries à Bactérie à Gram Positif Gram Négatif 20 Interprétation de ce qui se passe L’ajout d’alcool solubilise les lipopolysaccharides (partie La paroi des bactéries à Gram indiquée en orange) se trouvant sur positif très épaisse (partie la paroi des Gram négatif, ceci va délimitée en violet) de par sa créer la formation de trous dans la composition en peptidoglycane paroi bactérienne permettant ainsi permet à l’organisme de retenir la l’entrée massive de l’alcool dans le coloration en violet et l’empêche cytoplasme et qui élimine la d’être éliminée lors du rinçage. coloration violette, 21