TP 05: La coloration de Gram

TP 05: La coloration de Gram

• La coloration de Gram est une technique de coloration utilisée en microbiologie pour distinguer les bactéries Gram positives des bactéries Gram négatives.
• Contrairement à la coloration simple (un seul colorant), la coloration de Gram utilise deux colorants.
• Cette technique permet de visualiser la morphologie des bactéries, leur mode de groupement, et leur taille.
• Elle permet de déterminer la pureté de l'échantillon étudié.
• La coloration permet de connaitre la nature biochimique de la paroi des cellules purifiées et de les classer selon leur caractère Gram positif ou négatif, ce qui aide à orienter l'identification de la bactérie.

Préparation du frottis

• La réalisation d'un frottis est indispensable pour toutes les colorations.
• Prélever quelques gouttes d'une culture microbienne à l'aide d'une anse de platine stérilisée.
• Déposer les gouttes au centre d'une lame.
• Bien étaler avec l'anse de platine pour former un film très mince.

Séchage et fixation du frottis

• Cette étape tue les bactéries et les colle sur la lame.
• La fixation s'effectue par la chaleur.
• Tenir la lame avec une pince et la passer 3 à 4 fois dans la flamme du bec Bunsen.
• Laisser refroidir avant de continuer la coloration de Gram.

Coloration avec le violet de gentiane

• Déposer la lame sur le premier colorant (Violet de Gentiane) pendant 1 minute.
• Le violet de gentiane permet de colorer le cytoplasme en violet.

Rincer la lame

• Rincer la lame avec de l'eau distillée et égoutter.

Fixation du premier colorant (Lugol)

• Immerger le frottis dans le bain contenant le Lugol pendant 1 minute.
• Le Lugol renforce la coloration violette, cette étape est appelée mordangeage.

Décoloration

• Faire un jet d'alcool à 95 % (ou mélange alcool absolu + 1/5ème d'acétone) sur la lame jusqu'à disparition des traces violettes.
• Ou bien plonger la lame dans un bécher contenant de l'alcool.

Rincer

• Rincer immédiatement la lame avec de l'eau distillée et égoutter.

Coloration secondaire (Fuschine ou Safranine)

• Immerger le frottis dans la Fuschine (ou Safranine) pendant 1 minute.
• Cela permet de recolorer le cytoplasme décoloré en rose.

Séchage

• Sécher le frottis entre deux feuilles de papier absorbant ou en passant la lame au-dessus de la flamme du brûleur.
• Ajouter une goutte d'huile à immersion au centre de la lame.

Observation au microscope

• Observer à l'objectif x100 à immersion en prenant soin de bien coller l'objectif à la goutte d'huile.
• L'huile à immersion améliore la qualité de l'image et permet la propagation de la lumière.
• Sur les images obtenues, on peut voir des bactéries colorées en violet foncé (Gram positives) ou en rose/rouge pâle (Gram négatives).
• La forme et l'agencement des bactéries permettent de les identifier davantage.

Quelques exemples

• Des exemples de bactéries Gram positives et Gram négatives sont présentés, avec leurs formes et leurs dispositions.

Interprétation de la coloration de Gram

• La coloration de Gram met en évidence les différences biochimiques de la paroi des bactéries (Gram positif et Gram négatif), aidant à orienter le traitement empirique.
• La paroi des bactéries Gram positives est épaisse et riche en peptidoglycane qui retient la coloration violette.
• La paroi des bactéries Gram négatives est plus mince, avec une couche supplémentaire de lipopolysaccharide, qui permettent à l'alcool de décolorer l'échantillon.