Mikroorganizmaların Kültür ve İdentifikasyonu PDF

Mikroorganizmaların Kültür ve İdentifikasyonu Öğr.Gör.Dr. Seda SALMAN YILMAZ  Sınıflama Ø Family (aile): yakın cinsler Ø Genus (cins): yakın türler Ø Species (tür): yakın izolatlar Ø Strain: tek izolat ya da hat Ø Type (tip): türün alt grubu Clostridium difficile...

Mikroorganizmaların Kültür ve İdentifikasyonu Öğr.Gör.Dr. Seda SALMAN YILMAZ  Sınıflama Ø Family (aile): yakın cinsler Ø Genus (cins): yakın türler Ø Species (tür): yakın izolatlar Ø Strain: tek izolat ya da hat Ø Type (tip): türün alt grubu Clostridium difficile (Cins) (tür) 2 Ø Tür:Birçok sabit özelliği ortak ve diğer köken gruplarından önemli derecede fark gösteren kökenler topluluğu Ø Suş: Bir hastadan izole edilen aynı türe ait izolat  Mikroorganizmaların identifikasyonu Ø Tanıda Ø Etkenin adını koymada Ø Tedavide Ø Antibiyotiklere duyarlılıkları saptamada Ø Tedaviye cevap araştırılmasında Ø Bazı ortam, araç ve gereçlerin kontrolünde 4 Ø Mikroorganizmalardan Aşı Antiserum Antijen eldesinde yararlanılır. BAKTERİLERİN SINIFLANDIRILMASI Ø Morfolojik (kok, çomak, spiral) Ø Boyanma (Gram +, Gram -) Ø Beslenme (heterotrof, ototrof) Ø Sıcaklık (termofil, mezofil, psikrofil) Ø Oksijen ihtiyacına (aerob, anaerorob, fakültatif anaerob, mikroaerofil) Ø Üreme Ø Genetik özellikler Ø Metabolik aktivite 6  Oksijen ihtiyacına göre Ø Zorunlu aerop Ø Zorunlu anaerop Ø Fakültatif anaerop Ø Aerotolerant anaerop Ø Mikroaerofilik  Zorunlu aeroblar Ø Sadece oksijen varlığında çoğalır Ø Fermantasyon yok Ø Oksidatif fosforilasyon var 8  Zorunlu anaeroblar Ø Sadece oksijensiz ortamda çoğalır Ø Fermentasyon var Ø Oksidatif fosforilasyon yok Ø Oksijen varlığında ölür  Fakültatif anaeroblar (Geçici aerob) Ø Normalde oksijensiz solunum, zorunlu durumlarda oksijenli solunum yapar. Ø Fermentasyon var Ø Aerobik solunum var Ø Oksijen varlığında yaşayabilir 10 Aerotolerant anaeroblar Ø Oksijenli ortama toleransi olmasına rağmen anaerob olan bakteriler Ø Solunum anaerobik Ø Oksijen varlığında yaşayabilir  Mikroaerofilik Ø Düşük oksijen varlığında üreme Ø Yüksek oksijen varlığında ölüm 12 YÜKSEK O2 DÜŞÜK  Beslenme durumlarına göre Ø Gereklikarbonu CO2 veya karbonatlardan (inorganik maddelerden) sağlayanlar; Ototrof bakteriler - Fotosentez ve kemosentez yapan Siyanobakteriler Ø Gerekli karbonu organik karbon kaynağından sağlayanlar; Heterotrof bakteriler - Parazit ve saprofit bakteriler 14  Bakterilerin fizyolojisini etkileyen dış faktörler Ø Mikroorganizmaların yaşayıp çoğalabilmesi Sıcaklık pH Ozmotik Basınç Besinler Enzimler Sıcaklık isteklerine göre Sıcaklık (oC) Psikrofil 0 - 20 Mezofil 20 – 45 (insan ve hayvanlarda (37) hastalık yapan bakteriler) Termofil 45 - 80 16  pH İnsan vücudunda bakteriler; pH 5 - 8 arasında en iyi pH 7.2 - 7.5 Beslenme ve üremeleri için gerekli besin maddeleri Su Ø Bakterilerin vejetatif formda %70-90 iken sporlarda %5-20 kadardır. Ø Beslenme ve üreme için gerekli Ø Ortamdaki besin maddelerinin kullanımında Ø Enzimatik ve metabolik aktivitenin devamında 18 Bakterilerin: Kuru maddenin % 50 kadarını karbon % 20’sini oksijen % 8’ini hidrojen  Karbon Ø Bakterihücresinin yapı taşlarının sentezinde Ø Polisakkarit, lipid ve proteinlerin yapısında gerekli karbonlar için; CO2, karbonatlar ve organik kaynaklar 20 Azot ; kuru maddenin % 14’ünü (protein, nükleik asit ve enzim) Fosfor; (çekirdek asitleri, fosfolipid ve koenzimlerin) Kükürt; (a.a ve koenzimlerin) Magnezyum; (enzimler için kofaktör) Demir, çinko ve molibden; (bazı enzimlerin yapısında) Eser elementler; Cr, Ca, Cu, Se, Ni, Mn 22 Gelişme faktörleri ve vitaminler; Pantotenik asit, biyotin, nikotinik asit, folik asit, glutamik asit, riboflavin, yağ asitleri, B12 vitamini  Karbondioksit Ø Ototrof bakteriler için önemli Ø Bazı bakteriler % 5-10 CO2'li ortamda daha kolay ürer. 24 BAKTERİLERİN ÜREMELERİ Bölünerek Çoğalma Ø Bütün bakteri türlerinin esas üreme şekli bölünme ile çoğalmadır. Ø Su, besin maddesi ve sıcaklığın uygun olduğu ortamlarda çok hızlı bölünür.  BAKTERİLERİN ÜREMELERİ Ø Bölünme her 20 dakikada bir, Ø Geometrik olarak artmaya başlar, Ø Bu artış sürekli değildir, Ø Zamanla ortam sıcaklığı artar, asitler ve CO2 birikir, besin maddeleri tükenir, Ø Bakteriler için öldürücü doza ulaşınca geometrik artış bozulur. 26 Ø Mikroorganizmaların uygun çevre koşulları sağlanarak çoğaltılmasına ; ÜRETİM 28 Ø İnsanve hayvanlarda hastalık oluşturan mikroorganizmaların izolasyonu, tanımlanması ve üretilmesinde ; canlı ve cansız ortamlar kullanılır. Canlı ortam olarak Ø Hücre kültürü Ø Embriyonlu yumurta Ø Deney hayvanları  Ancak zorunlu hücre içi paraziti olan mikroplar (Riketsiler, klamidiler ve virüsler) canlı hücre içinde çoğalabilmektedirler. Ø Hücre kültürleri: Diploid hücre kültürleri, ilk ürün hücre kültürleri ve sürekli hücre dizileri Ø Tavuk embriyonunda üretim: Koryoallantoik zarda üretme, amniyon boşluğuna, allantois boşluğuna ve sarı torbaya aşılama Ø Deney hayvanları: Etkenin hastalandırma gücünün tayini, yeni ilaçların araştırılması, koruyucu aşı ve bağışık serum eldesinde Ø Cansız ortam Zorunlu hücre içi paraziti olmayan bakteriler yaşamları ve çoğalmaları için gerekli enerjiyi ve esas metabolitlerini yapabildikleri ortamlarda ürerler (pH, sıcaklık, O2 ve CO2 ve gerekli besin maddeleri) Ø Mikroorganizmaların üretilmeleri için gerekli maddeleri içeren hazırlanmış ortamlara » BESİYERİ « 32  Zorunlu hücre içi paraziti olmayan bakterilerin üretiminde kullanılan BESİYERLERİ * DOĞAL BESİYERLERİ Süt, yumurta, patates, havuç * YAPAY BESİYERLERİ Sentetik Besiyerleri Sentetik Olmayan Besiyerleri Yarı Sentetik Besiyerleri  Sentetik Besiyerleri Belirli miktarda kimyasal maddelerle hazırlanan ve bileşimi bilinen - Koser’in sitratlı besiyeri 34  Sentetik Olmayan Besiyerleri Mikrobiyolojide en sık kullanılan b.y peptonlu, tuzlu et suyu (buyyon) = sıvı agar agar katılarak yarı katı ve katı ( jeloz) = katı  Yarı Sentetik Besiyerleri İçerikleri kısmen belinen - Lövenstein-Jensen 36  Besiyerleri görevlerine göre *mikropları çoğaltma (genel üretim besiyerleri) *karışık mikroplar arasında istenileni ayırma (seçerek üretici ve seçerek ayırıcı besiyerleri) *bakterilerin bazı özelliklerini tanıtma (Tanıtıcı Besiyerleri) *mikropları saklama (saklama besiyerleri )  Genel üretim besiyerleri Ø Normal flora üyeleri ile birlikte bir çok hastalık etkeninin üreyebildiği besiyerleridir. 38 GENEL ÜRETİCİ SIVI BESİYERLERİ *Adi buyyon *Pepton *Balıklı buyyon GENEL ÜRETİCİ KATI BESİYERLERİ *Kanlı agar *Çikolatamsı agar *Mueller hinton agar SEÇEREK ÜRETİCİ SIVI BESİYERLERİ Üretilmesi istenmeyen bakteriyi üretmeyen ya da üremesini zorlaştıran, buna karşılık aranan bakterinin üremesini kolaylaştıran b.y (kimya maddeleri, pH değişikliği, sıcaklık farkları) - Safralı buyyon, alkali peptonlu su 40 SEÇEREK AYIRICI KATI BESİYERLERİ Karışık bakteriler arasından aranan bakteriyi saf halde elde etmek için kullanılır. *- Başka bakterilerin üremesini engelleyen boyalar ve antibiyotikler , - Basitracinli çikolatamsı agar *- Bakterilerin özel tanıtıcı koloni oluşturmalarını sağlayan renk maddeleri, - Endo besiyeri, SS besiyeri,  TANITICI BESİYERLERİ Bakterilerin fizyolojik özelliklerini gösterir. Bakterilerin solunum, beslenme, üreme, karbonhidratlara, organik asitlere, proteinlere, yağlara etki özellikleri - TSI besiyeri, D Besiyeri (Glikozlu b.y) Sitratlı besiyeri 42 TSI Besiyeri  Zenginleştirilmiş besiyerleri Ø Temel besiyerlerine kan, serum, glikoz, yumurta vb. ilavesi Ø Basit besiyerlerinde üretilemeyen m.o için kullanılır. - Kanlı agar; hemoliz yapan ve yapmayan m.o Ø Klinik örneklerden üretilmesi düşünülen m.o özelliklerine göre uygun olan besiyeri seçilir. 46  İzolasyon ve identifikasyon 1. Adım: Kültür petrileri – kolonilerin inkübasyonu (örn:24 hr) – boyut, yapı, renk, hemoliz – oksijen gereksinimi  İzolasyon ve identifikasyon Ø 2. Adım: Gram boyama - mikroorganizmalar mikroskopla incelenir 50 Gram negative Gram positive ısı/kurutma Kristal viyole İyodin fiksatifi Alkol (de-staining) Safranin Gram pozitif ve Gram negatif  Morfoloji Ø Şekil l Kok (yuvarlak) l Basil (çubuk) l Spiral yada dalgalı (örn: spiroketler) Ø Tek yada gruplar halinde olma l Salkım şeklinde (örn: stafilokoklar) l Zincir şeklinde (örn: streptokoklar) 3. Adım: İzole edilen Mikroorganizmaların tür ayrımı yapılır. 54 4.adım: Antibiyotik direnç ve duyarlılık testleri 55