Technique d'immunohistochimie PDF

**ECOLE PARAMEDICALE DE BLIDA** **LICENCE LABORANTIN DE SANTE PUBLIQUE** **Technique d'immunohistochimie** **Semestre VI** **Dr W. ABDALLAH** **Service d'Anatomie Pathologique** **CHU FRANTZ FANON BLIDA** **Année universitaire 2024-2025** I. **Introduction** II. **Applications** III. **An...

**ECOLE PARAMEDICALE DE BLIDA** **LICENCE LABORANTIN DE SANTE PUBLIQUE** **Technique d'immunohistochimie** **Semestre VI** **Dr W. ABDALLAH** **Service d'Anatomie Pathologique** **CHU FRANTZ FANON BLIDA** **Année universitaire 2024-2025** I. **Introduction** II. **Applications** III. **Antigène /Anticorps/enzymes et chromogènes** IV. **Principes de l'immunohistochimie** V. **Etapes techniques** VI. **Immunomarquages multiples** VII. **Localisation du signal en Immunohistochimie** VIII. **Automatisation** IX. **Conclusion** I. **Introduction** **L'immunohistochimie (IHC) est une technique associant l'immunologie et l'histochimie.** **Elle permet la détection** **d'une** **substance** **chimique** **dans** **un** **tissu** **ou** **dans** **une** **cellule** **par** **un anticorps** **(AC)** **dirigé** **contre** **cette** **substance.** **Les** **AC** **sont** **appliqués** **sur** **la** **section** **tissulaire** **(ou** **sur** **la** **cellule)** **pour** **se** **lier** **à l'antigène** **(Ag)** **correspondant.** **Un** **système** **de** **détection** **est** **ensuite** **utilisé** **pour** **identifier** **le** **lieu** **de** **la** **réaction antigène-AC.** **Ce** **système** **de** **détection** **utilise** **des** **molécules** **marquées** **qui peuvent** **être** **visualisées** **:** II. **Applications** -pour classer une tumeur si l\'histologie seule ne le permet pas -pour apporter des informations complémentaires : en terme de pronostic et à visée thérapeutique. L'IHC peut se faire : sur - **Coupes en paraffine** - **Coupes en congélation** - **Examen cytologique** III. **Antigènes/Anticorps /Enzymes et chromogènes :** **III.2. Anticorps :** http://www.svt.ac-aix-marseille.fr/ancien\_site/unidiv/Tsanticor/model.gif - Il en existe deux types : - Les AC polyclonaux - Les AC monoclonaux Plusieurs Ac contre le même Ag mais épitopes différents. -Immunisation d'un animal 3 à 9 X, récupération du sérum.( généralement lapin)  **III.2.2.AC monoclonaux** **Les** **anticorps** **monoclonaux** **sont** **produits** **par** **des** **clones** **de** **plasmocytes. Les** **AC** **d'un** **clone** **donné** **sont** **immunologiquement** **identiques** **et** **réagissent** **avec** **un** **seul épitope** **de** **l'Ag. Immunisation d'un seul animal (souris ou lapin)** **III.3.Enzymes et chromogènes** Les enzymes utilisées comme système de révélation en IHC, doivent catalyser des réactions difficilement réversibles. Elles doivent être stables, peu coûteuses, faciles à conjuguer, sans perte d'activité et présenter une activité facilement détectable. Le substrat de ces enzymes (chromogène) est soluble et incolore. Il doit précipiter immédiatement sur place après avoir été modifié par l\'enzyme. Cette attaque enzymatique le transforme en un produit coloré, insoluble qui ne doit pas diffuser dans le tissu. **Les méthodes immuno-enzymatiques utilisent une réaction enzyme-substrat pour convertir un chromogène non coloré et soluble en un produit final coloré insoluble** **Formule générale : enzyme + substrat complexe ES** **ES Produit coloré + Enzyme** **Deux (02) principales enzymes sont utilisées, chacune a un ou plusieurs chromogène spécifiques.** - **Peroxydase** **40kD, racine de radis noir** **substrat : H2O2** **activité endogène : lignée myéloïde, hémoglobine** **inhibition : H2O2 en excès** **Chromogènes : DAB -produit brun,** **- insoluble dans l'alcool et les solvants organiques** **- possibilité d'intensification par le tetroxyde d'osmium ou par des métaux lourds (cuivre, cobalt, \...)** **AEC -produit rouge** **-soluble dans l'alcool (montage en milieu acqueux)** - **Phosphatase alcaline** **-Phosphatase alcaline intestinale de veau, 100kD** **-Substrat : esters de phosphate de naphtol** **-Activité endogène : intestin, rein, ostéoblastes, cellules endothéliales,** **polynucléaires, etc\...** **-Inhibition de l'activité endogène : lévamisole (pas de blocage de la PA intestinale)** **Chromogènes :** - **Substrat naphtol AS-MX phosphate** - **Fast Red, Fast Blue : produit rouge ou bleu** - **New Fuchsin : produit rouge insoluble dans l'alcool** - **Substrat 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphatase (BCIP)** - **Nitro Bleu de Tetrazolium (NBT) : produit pourpre noir insoluble** IV. **Principe de l'immunohistochimie** !(media/image6.jpeg) **Réactions croisés avec le Ig endogènes** 5 **IV.2 - Méthode enzyme-anti-enzyme** **Méthode utilisant des anticorps non conjugués. Elle utilise un complexe soluble constitué par une enzyme (HRP, PA) et un anticorps dirigé contre l'enzyme.** **Séquence 1. AC primaire non conjugué** **2. AC de liaison** **3. complexe enzyme-anti-enzyme** **L'AC primaire et l'AC du complexe enzyme-anti-enzyme doivent provenir de la même espèce animale afin que l'AC secondaire puisse lier les deux AC ensemble. Le nom de la méthode dépend de l'enzyme utilisée :** **PAP (peroxydase-anti-peroxydase)** **APAAP (phosphatase alcaline-anti-phosphatase alcaline)** **[Avantages] : sensibilité augmentée**  **IV. 3 - Méthodes streptavidine-biotine** **Méthode** **utilisant** **la** **grande** **affinité** **de** **la** **streptavidine** **pour** **la** **biotine. *Streptavidine* *:* *Streptomyces* *avidinii,* *pH7,* *pas* *d'hydrate* *de* *carbone.*** ***Biotine* *:* *vitamine* *de* *faible* *poids* *moléculaire*** ***La* *streptavidine* *a* *4* *récepteurs* *pour* *la* *biotine.*** ***La* *biotine* *peut* *être* *couplée* *aux* *anticorps* *et* *aux* *enzymes* *(enzyme* *biotinylé).*** ***La* *streptavidine* *peut* *être* *couplée* *aux* *enzymes*** **Deux méthodes streptavidine-biotine sont fréquemment utilisées.** **Ces deux méthodes nécessitent un AC biotinylé comme AC de liaison** **IV.3.1 - Complexe streptavidine-biotine (SABC)** **Complexe tridimensionnel comportant de l'avidine en excès et de la peroxydase biotinylée** **IV.3.2 - Streptavidine conjuguée-biotine (LSAB)** **Septravidine conjuguée à l'enzyme** ***[Avantages]* : sensibilité** ***[Inconvénients]* : biotine endogène dans de nombreux tissus (foie, rein)** **IV.4 - Amplification par la tyramine** **" Catalysed Reporter Deposition " (CARD) ou " Catalysed Signal Amplification " (CSA)** ***[Principe]* : la peroxydase catalyse la formation de radicaux tyramine. Ces** **radicaux se lient de façon covalente avec les protéines de proximité.** **Méthodologie :** **4.1 - Technique conventionnelle : LSAB peroxydase** **SABC peroxydase** **4.2 - Incubation avec la tyramine biotinylée et H2O2** **4.3 - Révélation de la tyramine biotinylée par S.avidine-peroxydase ou SABC-peroxydase.** **IV.5- Polymère couplé à la peroxydase : technique utilisée au service d'anatomie et de cytologie pathologiques (CHU BLIDA)** **" Ehanced Polymer One step Staining " (EPOS)** **Polymère couplé à de nombreuses molécules de peroxydase** ***[Méthodologie]* : AC primaire couplé au polymère-peroxydase** Elle est basée sur l'utilisation d'un polymère de dextran hydrophile et non chargé, sur lequel sont fixés de façon covalente un grand nombre (50-500) de molécules enzymatiques (peroxydase ou phosphatase alcaline) ainsi que 10-50 molécules de l'anticorps secondaire. Ce polymère est appliqué sur la préparation après application de l'anticorps primaire. Cette technique est de réalisation simple et rapide ; par rapport aux techniques basées sur l'interaction entre la streptavidine et la biotine, elle offre l'avantage de ne pas utiliser des anticorps secondaires (qui peuvent être source de réactions croisées ou provoquer un bruit de fond) ni la streptavidine, qui peut se fixer sur la biotine endogène V. **Etapes techniques** 1. **Conditions essentielles pour l'immunohistochimie** - **Préservation de l'antigène dans le contexte cellulaire ou tissulaire (fixation)** - **Marquage spécifique et sensible avec absence de marquage non spécifique** - **Anticorps bien caractérisés** - **Marquage et détection efficaces** 2. **Préparation tissulaire** 1. **Fixation et inclusion en paraffine** ***[Inconvénients]* :** **Coupes de 3 à 4 µ sur (un microtome dédié à l'immunohistochimie)** - **bain d'eau distillée à 37- 40°C, décontaminé le soir !!!!** - **Sur plaques chauffantes progressives +++** **Lames spéciales, silanisées (+système adhésif, superfrost plus )** **Sécher 1h à 2h 58° puis une nuit à 37°+++ dans l'étuve ventilée ( thermomètre de contrôle à l'intérieur)** **2.3Déparaffinage** - **Séquence automatisée:** - **Xylène 3 x (10minutes) 30 min** - **Ethanol 100%, 95%, 70%, 50% 15 min.** - **Eau déminéralisée 2 min.** - ***Ils peuvent couper ou détruire les Ag. Risque de faux négatifs*.** **2.4.2-Démasquage par la chaleur : bain marie, autoclave, micro-ondes** - **Augmentation de la réactivité, augmentation de l'intensité du signal** - **Détecte des Ag non détectables après fixation : Ki67, Ig de surface..** - ***Micro-ondes*** ** température : 100°C +/- 5°C** ** cycles courts : 5 mn, x 1, x 2, x 3** - ***Incubateur : Bain marie, autocuiseur*** ** température : 95°C +/- 2°C** ** 40 mn** - ***Nature de la Solution de démasquage,* il faut immerger les lames dans une solution tampon** ** citrate 10 mM, pH 6** ** EDTA pH 9, pH 9,9** *Le pH des solutions d'incubation des Ac est un paramètre fondamental intervenant non seulement sur la détectabilité des Ag mais également sur la spécificité de la réaction IHC. Ce paramètre intervient vraisemblablement par l\'intermédiaire de variations de la charge et de la conformation non seulement des épitopes, mais également des sites de liaisons des Ac. Idéalement, l\'optimum du pH devrait donc être déterminé pour chaque Ac*. - **Laisser les lames 20 minutes précises dans le tampon sur la paillasse** **5. Blocage des activités enzymatiques endogènes :** **Peroxydases endogènes :** le blocage doit être réalisé, par incubation des coupes pendant 10 minutes dans une solution 3 % H202 dans H20. **Phosphatases alcalines endogènes : **le levamisole est l\'inhibiteur de choix, mais présente l\'inconvénient de ne pas bloquer les phosphatases alcalines intestinales. **6. Incubation de l'Anticorps primaire: L'incubation de l'Ac primaire se fait dans une chambre humide, cercler auparavant les sections tissulaires avec un stylo hydrophobe, facilitant ainsi le dépôt des substrats.** En routine, la durée moyenne d\'incubation de l\'Ac primaire est de 30 minutes à 1 heure. L\'incubation de l\'Ac primaire sur la nuit permet à la réaction Ag - Ac d\'atteindre son équilibre et par là même de diluer l\'antisérum par un facteur trois et de diminuer un bruit de fond éventuel. Elle **doit être adaptée dans chaque laboratoire et ceci grâce à des blocs témoins.** - **Détermination de la dilution optimale d'un Ac concentré** - **Travailler sur un tissu contrôle positif, gamme de dilution en cascade de 4 à 5 points centrée sur la dilution recommandée. Si trop concentrée bruit de fond + signal. Si trop dilué signal faible Trouver rapport optimal entre signal et bruit de fond. Exp 1/100-1/500** - **1/100** - **1ul d'AC 100ul de diluant** - **X 1000ul** - **1000/100 =10 Ac** - **990 de diluant** Les deux tampons les plus utilisés sont le PBS (tampon phosphate 0,01 M, 0,15 M NACL, pH 7,4) ou le Tris-HCI salin (TBS) (Tris-HCI O,OIM à 0,05M ; 0,15 M NACI ; pH 7,4 à 7,6). Avec certains Ac monoclonaux, la réaction Ag Ac se ferait moins bien en TBS qu\'en PBS. Le PBS apportant une grande quantité de phosphate inorganique ne peut être utilisé avec les Ac marqués à la phosphatase alcaline (Principe de Le Châtelier). Un tel inconvénient n\'est pas rencontré avec le tampon Tris qui bien au contraire favorise l\'hydrolyse du substrat. Les fonctions alcool du Tris sont, en effet, transestérifiées par les phosphates libérés. ***l\'intensité, non seulement du bruit de fond mais également du signal spécifique, dépendent des modalités du lavage (durée, lavage par immersion ou par rinçage à la pissette, composition du tampon)***. **7. Révélation de la réaction Ag-Ac exp de la technique polymère couplé à la peroxydase** **ETAPES** **TEMPS D'INCUBATION** -------------------------------------------------- ----------------------------- Agent bloquant les enzymes endogènes : H2O2 10 min Anticorps primaire (souris ou lapin) Variable : jusqu'à une nuit Polymère marqué à la HRP (peroxydase de raifort) 30 min Substrat-Chromogène 3,3'-diaminobenzidine (DAB+) 5 min Contre-coloration à l'Hématoxyline 3 min **8. Contre coloration** **A la fin de la réaction IHC, une contre coloration nucléaire est généralement réalisée, permettant une meilleure visualisation des cellules marquées ou non au sein de la préparation et une interprétation plus aisée de l'immunomarquage ; le colorant le plus utilisé est l'hématoxyline de Mayer.** VI. **Immunomarquages multiples** - **Moins d'étalement de lames** - **Moins d'utilisation de témoins** - **Moins d'étiquette multirésistante** - **Moins de réactifs pour démasquage antigénique** !(media/image16.jpeg) VII. **Localisation du signal en immunohistochimie** - **Site où la protéine est présente : synthèse, concentration, stockage** - **site fonctionnel : membrane cellulaire, noyau, cytoplasme \[endocytose de la protéine par la cellule\]** **1*.* *membrane* *cellulaire* *: récepteurs, transport transmembranaire, enzymes...Exemples : antigènes leucocytaires CD45, CD20, CD5.., EMA, CEA, molécules d'adhérence protéines virales : LMP-1 d'EBV*** 2. ***.cytoplasme* *: cytosquelette, lysosomes...Exemples : filaments intermédiaires, cytokératines, CK7, CK5,6, CK20, CK18..*** ***3.* *noyau* *: enzymes, protéines de structure, de régulation de l'expression*** ***Transcriptionnelle. Exemples, récepteurs hormonaux, TTF1, Ki67, P53*** ***Cependant, on peut avoir l'association de plusieurs signaux dans la cellule exp CD15, CD30 : marquage membranaire, granulaire intracytoplasmique, zone du golgi*** VIII. **Automatisation** Quand les demandes d'analyses IHC sont très nombreuses, il peut devenir difficile de gérer l'utilisation d'un grand nombre d'anticorps tout en tenant compte des particularités de chacun. L'automatisation permet d'uniformiser et d'améliorer la reproductibilité de la coloration et de réduire la variabilité des résultats analytiques. Par conséquent, il est fortement recommandé d'automatiser ces techniques. IX. **Conclusion**