Immunohistochimie : Enzymes et Chromogènes

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Questions and Answers

Quels anticorps doivent être utilisés pour que l'anticorps secondaire puisse lier les deux anticorps ensemble ?

Des anticorps provenant de la même espèce animale (correct)

Des anticorps de différentes espèces

Des anticorps polyclonaux

Des anticorps monoclonaux

Quelle méthode utilise la peroxydase comme enzyme ?

Amplification par la tyramine

PAP (correct)

Complexe streptavidine-biotine

APAAP

Quel est un inconvénient de la méthode streptavidine-biotine ?

Difficulté de couplage

Biotine endogène dans de nombreux tissus (correct)

Coût élevé des réactifs

Sensibilité diminuée

Quelle est la fonction principale de la streptavidine dans les méthodes utilisant la biotine ?

Se lier fermement à la biotine Signup and view all the answers

Quel processus est catalysé par la peroxydase dans l'amplification par la tyramine ?

Formation de radicaux tyramine Signup and view all the answers

Quelle est la principale caractéristique des enzymes utilisées en immunohistochimie (IHC) ?

Elles doivent être stables et peu coûteuses. Signup and view all the answers

Quel est le rôle du substrat dans une réaction enzyme-chromogène en IHC ?

Il doit précipiter immédiatement après modification. Signup and view all the answers

Quel produit coloré est généré par la peroxydase avec le chromogène DAB ?

Produit brun. Signup and view all the answers

Quel chromogène produit un résultat rouge lors de l'utilisation de la phosphatase alcaline ?

Fast Red. Signup and view all the answers

Quelle est l'activité endogène de la peroxydase ?

Lignée myéloïde et hémoglobine. Signup and view all the answers

Quelle enzyme est inhibée par le lévamisole ?

Phosphatase alcaline. Signup and view all the answers

Quel est le produit généré par le substrat 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphatase (BCIP) ?

Produit pourpre. Signup and view all the answers

Quelle méthode utilise un complexe soluble constitué par une enzyme et un anticorps ?

Méthode enzyme-anti-enzyme. Signup and view all the answers

Quel est le site fonctionnel où l'on trouve des récepteurs et des enzymes?

Membrane cellulaire Signup and view all the answers

Quels exemples de protéines peuvent être localisées dans le cytoplasme?

CK7 et CK5,6 Signup and view all the answers

Quel type de protéines peut être localisé dans le noyau?

Enzymes et protéines de régulation Signup and view all the answers

Quelle est une des principales raisons d'automatiser l'immunohistochimie?

Réduire la variabilité des résultats Signup and view all the answers

Quel type de marquage peut être observé pour les protéines comme CD15 et CD30?

Membranaire et granulaire intracytoplasmique Signup and view all the answers

Quelle méthode utilise un polymère de dextran pour le couplage des molécules enzymatiques ?

Ehanced Polymer One step Staining (EPOS) Signup and view all the answers

Quelles sont les conditions essentielles pour réaliser une immunohistochimie efficace ?

Absence de marquage non spécifique et détection efficace Signup and view all the answers

Quel est un des inconvénients du processus de fixation et d'inclusion en paraffine ?

Coupes de 3 à 4 µ peuvent couper les antigènes Signup and view all the answers

Quel est un avantage de la technique EPOS par rapport aux techniques basées sur la streptavidine ?

Ne nécessite pas d'anticorps secondaires Signup and view all the answers

Quelle est la température de séchage recommandée pour les lames en étuve ventilée ?

58°C Signup and view all the answers

Quel produit est utilisé dans la séquence automatisée pour le déparaffinage ?

Ethanol Signup and view all the answers

Quelle est la première étape essentielle à suivre dans la préparation tissulaire pour l'immunohistochimie ?

Fixation et inclusion en paraffine Signup and view all the answers

Quel est le rôle de la tyramine biotinylée dans les techniques décrites ?

Révéler les anticorps fixés Signup and view all the answers

Quel tampon est souvent préféré pour des anticorps marqués à la phosphatase alcaline ?

Tampon Tris Signup and view all the answers

Quelle est la durée d'incubation avec l'agent bloquant H2O2 ?

10 minutes Signup and view all the answers

Quel colorant est le plus souvent utilisé pour la contre-coloration à la fin de la réaction IHC ?

Hématoxyline de Mayer Signup and view all the answers

Quel effet le PBS a-t-il sur certaines réactions avec des anticorps monoclonaux ?

Il la réduit. Signup and view all the answers

Quel est le temps d'incubation recommandé pour les anticorps primaires ?

Variable jusqu'à une nuit Signup and view all the answers

Comment la durée et la méthode de lavage influencent-elles l'immunomarquage ?

Elles influencent le bruit de fond et le signal spécifique. Signup and view all the answers

Quel est l'avantage des immunomarquages multiples selon le contenu fourni ?

Moins de réactifs pour démasquage antigénique Signup and view all the answers

Quel substrat est utilisé dans le processus de révélation de la réaction Ag-Ac ?

DAB+ Signup and view all the answers

Study Notes

Enzymes et chromogènes

Deux enzymes principales sont utilisées en immunohistochimie : la peroxydase et la phosphatase alcaline.
Chaque enzyme a un ou plusieurs chromogènes spécifiques pour produire une réaction colorée visible au microscope.
La peroxydase est une enzyme de 40 kD provenant de la racine de radis noir, avec un substrat spécifique : H2O2.
L'activité endogène de la peroxydase est limitée à la lignée myéloïde et à l'hémoglobine.
L'excès de H2O2 inhibe l'activité de la peroxydase.
Les chromogènes pour la peroxydase incluent le DAB (produit brun, insoluble dans l'alcool et les solvants organiques) et l'AEC (produit rouge, soluble dans l'alcool).
La phosphatase alcaline est une enzyme intestinale de veau de 100 kD, utilisant des esters de phosphate de naphtol comme substrat.
L'activité endogène de la phosphatase alcaline se retrouve dans l'intestin, le rein, les ostéoblastes, les cellules endothéliales et les polynucléaires.
Le lévamisole inhibe l'activité endogène de la phosphatase alcaline sans bloquer la PA intestinale.
Les chromogènes pour la phosphatase alcaline sont :
- Le naphtol AS-MX phosphate, produisant du rouge ou du bleu avec les Fast Red et Fast Blue.
- La New Fuchsin, produisant une coloration rouge insoluble dans l'alcool.
- Le 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphatase (BCIP).
- Le Nitro Bleu de Tetrazolium (NBT), produisant un produit pourpre noir insoluble.

Méthodes immunohistochimiques

La méthode enzyme-anti-enzyme utilise des anticorps non conjugués et un complexe soluble constitué d'une enzyme (HRP ou PA) et d'un anticorps dirigé contre l'enzyme.
La méthode PAP (peroxydase-anti-peroxydase) et la méthode APAAP (phosphatase alcaline-anti-phosphatase alcaline) sont les deux variantes de cette méthode.
Les méthodes streptavidine-biotine exploitent la forte affinité entre la streptavidine et la biotine.
La streptavidine a quatre récepteurs pour la biotine et peut être couplée à des enzymes.
La biotine peut être couplée aux anticorps et aux enzymes, créant des enzymes biotinylés.
Les deux méthodes streptavidine-biotine utilisent un anticorps biotinylé comme anticorps de liaison.
Le complexe streptavidine-biotine (SABC) est un complexe tridimensionnel contenant de l'avidine en excès et de la peroxydase biotinylée.
La streptavidine conjuguée-biotine (LSAB) utilise la streptavidine conjuguée à l'enzyme.
L'amplification par la tyramine, aussi connue sous le nom de CARD (Catalysed Reporter Deposition) ou CSA (Catalysed Signal Amplification), utilise la peroxydase pour catalyser la formation de radicaux tyramine.
Les radicaux tyramine se lient de manière covalente aux protéines de proximité.
La technique "Ehanced Polymer One step Staining" (EPOS) utilise un polymère couplé à de nombreuses molécules de peroxydase.
L'anticorps primaire est couplé directement au polymère-peroxydase dans la technique EPOS.

Etapes techniques de l'immunohistochimie

La préservation de l'antigène dans le contexte cellulaire ou tissulaire est essentielle (fixation).
Un marquage spécifique et sensible sans marquage non spécifique est crucial.
L'utilisation d'anticorps bien caractérisés est impérative.
Un marquage et une détection efficaces sont nécessaire pour un résultat optimal.

Automatisation en immunohistochimie

L'automatisation des techniques est recommandée pour uniformiser et améliorer la reproductibilité de la coloration, réduisant ainsi la variabilité des résultats analytiques.

Conclusion

L'immunohistochimie est une technique importante pour l'identification et la localisation des protéines dans les tissus.
La compréhension des différentes méthodes et de leurs principes permet d'adapter la technique pour chaque application spécifique.
L'utilisation d'anti-corps de qualité, d'enzymes et de chromogènes appropriés ainsi que la maîtrise des étapes techniques sont essentielles pour obtenir des résultats fiables et reproductibles.

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Description

Ce quiz explore l'utilisation des enzymes peroxydase et phosphatase alcaline en immunohistochimie. Il détaille les propriétés de chaque enzyme, leurs substrats et les chromogènes associés qui permettent de visualiser les réactions colorées au microscope. Testez vos connaissances sur ces fondamentaux de la biologie et de la chimie analytique.