Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos - Apuntes de Biología Molecular PDF

(Power point 1) U3. Extracción y purificación de ácidos nucleicos Primera etapa: Los ác.nucleicos se encuentran en el interior del núcleo en el citoplasma o en las mitocondrias y cloroplastos. Están aislados del exterior mediante membranas y paredes celulares. Las membranas celulares limitan a...

(Power point 1) U3. Extracción y purificación de ácidos nucleicos Primera etapa: Los ác.nucleicos se encuentran en el interior del núcleo en el citoplasma o en las mitocondrias y cloroplastos. Están aislados del exterior mediante membranas y paredes celulares. Las membranas celulares limitan a la célula y le permiten tener relación con el exterior. Bíceps lipídica (Regula el transporte de sustancias que entran y salen de la célula) La pared celular recubre la membrana celular y le proporciona rigidez y protección a la célula. Para el análisis y manipulación de membranas y paredes se requiere de: 1º Etapa de extracción: Conseguimos hacer accesibles los ácidos nucleicos a los reactivos y enzimas. 2º Etapa de purificación: Eliminamos las sustancias y elementos que interfieren en ellas El protocolo suele llevar 3 fases: 1- Pretratamiento de la muestra 2- Extracción de los ácidos nucleicos 3- Purificación de los ácidos nucleicos PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS Se requiere un pretratamiento específico en función del tipo de muestra Las suspensiones celulares están formadas por células libres y agregados celulares que flotan dispersos en el seno de un medio líquido. Pretratamientos más habituales: - Sangre - Cultivos celulares - Tejidos animales o vegetales frescos - Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina - Otras muestras como esputos, células de la mucosa oral, bacterias y levaduras PRETRATAMIENTO DE SANGRE (Objetivo eliminación de la hemoglobina mediante lisis de los hematíes) Para estudiar ác.nucleicos, a partir de leucocitos. La hemoglobina interfiere en la técnica por que es un potente inhibidor de la PCR Procesamiento: - Debemos partir de sangre totalmente anticoagulada con EDTA, heparina o citrato de sodio - La extracción se ha de realizar en las 24h siguientes a la extracción de la muestra - Se puede congelar a 4ºC durante 5 días - En técnicas que requieran moléculas intactas de ADN sin fragmentar, la sangre no debe almacenarse más de 3 días, si no se fragmenta y degrada la molécula de ADN El pretratamiento consiste en: 1º Lisis de los hematíes: Rotura de hematíes con solución o tampón en proporción 1:3 (1 volumen de sangre y 3 volúmenes de sol un de lisis) 2º Centrifugado de la muestra: Obtenemos sedimento o pellet y un sobrenadante 3º Eliminación del sobrenadante: Eliminarlo con pipeta Pasteur. Se eliminan los componentes del plasma sanguíneo y la hemoglobina 4º Conservación del sedimento: En el sedimento habrán quedado los leucocitos (Pretratamiento también usado para muestra de médula ósea) OBTENCIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEADAS DE SANGRE PERIFÉRICA La sangre también sirve para detectar, aislar y estudiar ácidos nucleicos precedentes de retrovirus que infectan los linfocitos (VIH o virus linfotrópicos humanos de células T (HTLV)) Se aíslan células mononucleadas de sangre periférica, PBMC (Linfocitos y monocitos) antes de extraer los ácidos nucleicos, mediante la técnica de centrifugación en gradiente de densidad, utilizando un medio de extracción de PBMC Procedimiento de obtención: 1º Se coloca en un tubo el medio de separación y encima la sangre 2º Se centrifuga 3º Eliminamos el sobrenadante y con una pipeta Pasteur, se aspira cuidadosamente la capa de células mononucleadas 4º Se transfiere a un tubo limpio y se lava con tampón o solución salina para eliminar restos de plasma y plaquetas 5ª Se continúa con el proceso de extracción de ác.nucleicos CULTIVOS CELULARES Es un método de obtención de células in vitro Consiste en la recolección de las células antes de la obtención de los ác.nucleicos 2 situaciones: - En suspensión: Células crecen en suspensión en el medio de cultivo - En monocapa: Células crecen adheridas en monocapa en paredes del frasco Procedimiento de obtención: A- En suspensión: 1º Recolectar en un tubo 2º Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación 3º Lavar las células con tampón o suero fisiológico antes de la extracción y purificación del ADN y/o ARN B- Cultivos en monocapa (2 posibilidades) B1- Utilizar el mismo frasco para continuar el proceso de extracción: 1º Retirar del frasco el medio de cultivo 2º Lavar la monocapa con tampón o solución salina 3º Iniciar in situ, en el propio frasco, el proceso de extracción B2- Pasar la monocapa a un tubo 1º Despegar la monocapa de células de la pared del frasco. 2 maneras: - Forma mecánica con raspador - Medios enzimáticos (Tripsinización): Tras retirar el medio de cultivo del frasco y lavar la monocapa con tampón o solución salina, se incuban las células con una solución de tripsina al 0,05-0,25% 2º Recolectar las células en un tubo 3º Lavar las células antes de continuar con la extracción PRETRATAMIENTO TEJIDOS ANIMALES O VEGETALES FRESCOS Requiere un pretratamiento previo de homogeneización (Química o mecánica) para liberar las células que integran el tejido La cantidad de tejido que se va a procesar dependerá del tipo de tejido, del método de homogeneización y de procedimiento de extracción y purificación de ác. Nucleicos Homogeneización Mecánica: Acción trituradora o abrasiva para desmenuzarlo Puede ser automatizada o manual: - Automatizada: Se usan máquinas o elementos mecánicos 1º Se corta el tejido en pequeños fragmentos 2º Con trituradores mecánicos por la acción de agentes abrasivos y agitación, por esferas de vidrio o cerámica que colisionan contra la muestra mediante oscilación o por sonicación 3º Se transfiere a un tubo limpio para la realización de la extracción Este proceso puede liberar proteasas y enzimas que degraden los componentes celulares. Se ha de realizar en frío y rápido o añadir inhibidores enzimáticos. - Manual: Se usa un mortero, minimiza la degradación 1º Se colocan los fragmentos de tejido en un mortero 2º Se cubren con nitrógeno líquido. Evita la formación de cristales en el interior de las células 3º Con la mano del mortero se pulverizan los fragmentos congelados hasta conseguir un polvo 4º Se deja evaporar el nitrógeno líquido 5º El polvo obtenido se transfiere a un tubo limpio para iniciar el proceso de extracción La homogeneización puede realizarse directamente en un tampón de lisis, simultáneamente con el primer paso del proceso de extracción Homogeneización química: Uso de proteasas y detergentes que degradan los componentes tisulares, disgregando las células Se realiza para muestras pequeñas y cortes de tejido en congelación obtenidos con un criostato 1º Se añade la mezcla de incubación que contienen las proteasas y detergentes para la digestión del tejido 2º Se lleva la muestra a la incubadora (37-56ºC durante 12-24h) 3º Pasado el tiempo, se retira la muestra y se sigue con el proceso de extracción PRETRATAMIENTO TEJIDOS FIJADOS EN FORMOL E INCLUIDOS EN PARAFINA O TEJIDOS FFPE Este tejido es muy útil para estudios retrospectivos, la calidad de los ác. Nucleicos recuperados suele ser peor que la de aquellos purificados a partir de tejidos frescos En el pretratamiento de los tejidos FFPE se requiere la desparafinización para la extracción de ác.nucleicos La desparafinización se realiza de la siguiente manera: 1º Con microtomo realizamos cortes finos 2º Se transfiere a un tubo Eppendorf 3º Se incuba con xilol u otro agente desparafinante, etanoles de concentraciones decreciente y agua destilada 4º Este tejido se somete a una homogeneización química PRETRATAMIENTO DE OTRAS MUESTRAS CULTIVOS DE BACTERIAS Y LEVADURAS Consiste en situar las bacterias y levaduras en una solución tampón (Solución GTE: TRIS 25mM, pH8; EDTA 10mM y glucosa 50Mm) 2 situaciones: 1- Cultivos en medio líquido: - Se centrifuga el tubo para eliminar el medio de cultivo sobrenadante - El sedimento se resuspende en el tampón de suspensión 2- Colonias aisladas sobre un medio sólido (Placa de agar): - Se recoge una colonia de la superficie de la placa con un asa de siembra estéril - Se resuspende la colonia en el tampón de suspensión CÉLULAS DE LA MUCOSA ORAL Nos podemos encontrar en el mercado soluciones y kits comerciales, diversos sistemas de obtención: 1- Mediante raspado de la mucosa oral con torunda o cepillo Directamente se sumerge la torunda o cepillo en una solución conservante para el desprendimiento de las células. 2- Mediante enjuague con una solución conservante 3- Recolectando directamente saliva El pretratamiento consistirá en centrifugar la suspensión celular y eliminar el sobrenadante ESPUTO El pretratamiento consistirá en la fluidificación de un agente mucolítico del tipo N-acetil-L-cisteína en una disolución de citrato sódico Si el microorganismo que se quiere detectar es una micobacteria se puede añadir hidróxido sódico para descontaminar la muestra (Power point 2) El proceso de extracción de ác.nucleicos consiste en la obtención de un lisado celular de aspecto homogéneo en el que los ác.nucleicos se encuentran libres de las estructuras celulares en las que se mantenían aislados. Implica 2 procesos: 1- La lisis celular para liberar los ác.nucleicos 2- La inactivación de las ADN-asas y ARN-asas para evitar la degradación de los ác.nucleicos La composición de la solución de lisis dependerá de la célula que se va a lisar A- DETERGENTES (Rompe la grasa) Desestructura la bicapa lipídica de las membranas y desnaturaliza las proteínas que la integran Se libera el contenido citoplasmático y nuclear al medio de reacción El dodecil-sulfato-sódico (SDS), un compuesto tensioactivo aniónico, es el más utilizado, sobre todo en muestras humanas y de animales, en combinación con el EDTA B- EDTA (Quelante de calcio y magnesio) Es un quelante de cationes divalentes, como el calcio y el magnesio. Al atrapar los cationes del medio de reacción inhibe la actividad de las ADN-asas, ya que estas necesitan el magnesio para su funcionamiento C- PROTEASAS (Digiere proteínas citoplasmáticas) La proteinasa K digiere las proteínas de la membrana celular como las citoplasmáticas, eliminando así las nucleasas Útil en muestras de tejidos frescos y FFPE D- AGENTES CAOTRÓPICOS (Desnaturalizan macromoléculas) Desnaturalizan las macromoléculas impidiendo que realicen su actividad, como el isotiocionato de guanidinio, potente in activador de las ARN-asas, por lo que se requiere su uso siempre que queramos purificar ARN TRATAMIENTO EN CÉLULAS CON PARED CELULAR Para degradar pared celular en bacterias, levaduras, hongos y células vegetales, se requieren otros tratamientos, como el tratamiento enzimático, mecánicos o el bromuro de cetril-trimetril-amonio (CTAB) A- TRATAMIENTO ENZIMÁTICO 1- Lisozima o Lisostafin: para bacterias gram + 2- Liticasa o Zimolasa: para células vegetales, levaduras y hongos (Se puede hacer antes de usar la solución de lisis o bien incorporando la enzima a la solución de lisis) B- TRATAMIENTO MECÁNICO Consiste en la ebullición de agua destilada o tampón, ciclos de congelación-descongelación, sonicación, etc C- TRATAMIENTO CON CTBA Estas células tienen un alto contenido en polisacáridos y derivados polifenólicos que interfieren en muchos procesos enzimáticos. El CTBA facilita la eliminación de estos compuestos en el proceso de purificación VERIFICACIÓN DEL RESULTADO DE LISIS Comprobar si hay presencia de grumos , cuerpos celulares, etc. Seguir el protocolo hasta conseguir muestra homogénea Transcurrido el tiempo de incubación estándar de protocolo, se deberá añadir más solución de lisis y reincubar la muestra, incluso a temperaturas elevadas (37ºC-65ºC) CONSIDERACIONES EN LA EXTRACCIÓN DE ADN Una vez finalizada la lisis celular y antes de la purificación, es necesario eliminar el ARN presente en el lisado por que el ARN puede interferir en los estudios posteriores Para ello: 1- Se añade al medio de reacción ARNasa A 2- Se incuba a 37ºC durante 15-45 min Paso necesario en muestra de saliva, tejidos y raspados celulares por alto riesgo de contaminación de ARN, mientras que no es necesario en las de sangre periférica o médula ósea por que la contaminación es mínima (PowerPoint 3) PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Consiste en separar los ác.nucleicos de los demás componentes del lisado Diferentes técnicas: PURIFICACIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS Se basa en la solubilidad de los compuestos ADN es una molécula soluble en agua porque presenta carga fuertemente negativa por los grupos fosfatos que tienen en el exterior de la doble hélice. En medio acuoso, estas moléculas se repelen entre sí y se rodean de moléculas de agua que las estabilizan Procedimiento: (Se divide en 4) 1- Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos Se utiliza combinación de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico en proporciones 25:24:1 - Mezclar volúmenes iguales de lisado y reactivo - Agitar en vórtex *Fase acuosa: (Superior) contiene productos de la lisis *Fase orgánica (Cloroformo): (Inferior) se disuelven los  lípidos y también desnaturaliza y disuelve las proteínas - Centrifugar *Fase acuosa: (Superior) contiene ác.nucleicos, las sales y componentes hidrosolubles del lisado *Fase orgánica: (Inferior) Proteínas y lípidos 2- Precipitación del ADN - Se transfiere a un tubo limpio la fase acuosa - Se añade acetato sódico e isopropanol o etanol al 100% frío y precipita el ADN Al añadir alcohol, se elimina la capa hidratante que rodea las moléculas de ADN Al haber cationes de sodio procedentes del acetato sódico, se unen a las moléculas de ADN y estas ya no se repelen. Forman unas finas hebras blanquecinas Precipitar el ADN después de centrifugar 3- Lavado del ADN El pellet de ADN, se lava con etanol al 70% y volvemos a centrifugar El ADN es insoluble en etanol y permanece en el sedimento. El resto de contaminantes son solubles en etanol y se eliminan con el sobrenadante 4- Resuspensión del ADN Hay que eliminar por completo el ADN invirtiendo el tubo sobre un material absorbente El pellet de ADN se deja secar con el tubo abierto a temperatura ambiente Se vuelve are suspender, una vez seco, con agua destilada o en un tampón a pH neutro o ligeramente a alcalino, Tris-EDTA (TE) Rehidratación (Proceso lento): 2 maneras: - Incubación inicial a 55-95ºC seguido de incubación a Tª con agitación suave - incubación en nevera a 4ºC hasta el día siguiente y la completa disolución PRECIPITACIÓN CON SALES (SALTING OUT) 1- Precipitación de proteínas Se añade al lisado volumen igual de una solución salina concentrada Se agita vigorosamente en el vórtex durante 20-30 seg Se centrifuga la mezcla y las proteínas precipitan en el fondo del tubo como un pellet de color pardo En el sobrenadante quedan los ác.nucleicos, sales y componentes hidrosololuble 2- Precipitación del ADN Se transfiere el sobrenadante a un tubo limpio y se añade un volumen igual de isopropanol y se mezclan por inversión suave del tubo varias veces mediante centrifugación, sedimentan unas hebras blanquecinas de ADN 3- Lavado y resuspensión del ADN Se elimina el sobrenadante y el ADN se lava con etanol 70º-75 Se resuspende en agua destilada o tampón TE CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO DE GASES Únion electroestática reversible de iones en solución a grupos funcionales cargados que están unidos covalente mente a una fase estacionaria - Fase estacionaria con carga neta positiva: intercambiadores aniónicos. Se unirán los iones negativos - Fase estacionaria con carga neta negativa: intercambiadores catiónicos. Se unirán los iones positivos Para la purificación de ác.nucleicos se utilizan intercambiadores aniónicos ya que tienen carga negativa Los grupos funcionales mas utilizados como intercambiadores aniónicos: - Metilaminoetanol - Dietilaminoetanol PROCEDIMIENTO 1- Cargar columna de cromatografía con una solución de lisado en tampón de baja salinidad y ph neutro. Los ác.nucleicos, con carga negativa, se unen a los grupos funcionales intercambiadores, que tiene carga positiva. Las proteínas, polisacaridos y otros contaminantes con carga positiva no se unen al intercambiador y eluyen la columna 2- La columna se lava con tampones de concentración salina creciente, que van eliminando contaminantes con débil carga negativa 3- El ADN se eluye de la columna con un tampón de máxima salinidad y alto pH Para finalizar la purificación, los ácidos nucleicos se precipitan dele luidlo con isopropanol o etanol, se lavan con etanol y se resuspenden en agua destilada o tampón TE CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN Se basa en la capacidad de adsorción de los ác.nucleicos al vidrio y a la sílice en presencia de sales caotrópicas Vidrio: Presenta moléculas de silicatos SO-4 Forma puentes de hidrógeno con las moléculas de H2O Los ác.nucleicos, solución acuosa, también se recubren de moléculas de H2O unidas a sus grupos fosfatos mediante puentes de hidrógeno Las 2 capas hidratantes, impiden la interacción entre ellas Si se añade una sal caotrópica, esta atrae las moléculas de agua y esto permite la interacción entre el vidrio y los ác.nucleicos PROCEDIMIENTO Se utilizan membranas de lana de vidrio o perlas de sílice empaquetadas en columnas de polipropileno que se ajustan a tubos como los eppendorf 1- Se carga la columna con el lisado diluido en un tampón que contiene el agente caotrópico. Se centrifuga. Los ác.nucleicos se unen a la membrana. El medio líquido con proteínas y contaminantes se recogen en el tubo colector y se eliminan 2- Se carga la columna con etanol al 70%, se centrifuga y se elimina el contenido. Se vuelve a centrifugar, para eliminar el resto de alcohol y se desecha el tubo colector 3- Se ajusta la columna en otro eppendorf limpio y se añade sobre la membrana agua destilada o tampón TE. Los ác.nucleicos vuelven a recuperar la capa hidratante Se incuba 3-5 min la resuspensión, se centrifuga y se desecha la columna. En el tubo eppendorf queda el ác.nucleico purificado PURIFICACIÓN MEDIANTE ESFERAS MAGNÉTICAS Se basa en la unión de los ác.nucleicos a microesferas magnéticas que pueden ser retenidas mediante un imán PROCEDIMIENTO A- Adsorción a esferas magnéticas 1- Se añaden las esferas con un agente caotrópico al lisado. Los ácidos se unen a las esferas por adsorción 2- El tubo con la mezcla se coloca en un soporte con un imán y las esferas se unen al imán, agrupándose en la zona de la pared del tubo que está en contacto con el mismo 3- Los contaminantes se eliminan por decantación o pipeteo 4- Se retira el tubo del separador magnético. Los ác.nucleicos se lavan con etanol al 70% y se agita. Se vuelve a aglutinar las esferas en la pared del tubo colocándolo en el separador magnético. Los contaminantes se eliminan por decantación o pipeteo 5- Se resuspenden los ác.nucleicos con agua destilada o tampón TE 6- Se coloca el tubo en el separador magnético para que las esferas sin ác.nucleicos, se agrupen en la pared del tubo y los ác.nucleicos en solución se pipetean y se transfieren a un tubo limpio B- Separación magnética por afinidad 1- Para purificar ARNm de eucariotas, se utilizan microesferas-oligo T, las cuales se añaden al lisado junto con un tampón que facilita la hidratación específica del oligo-T con la cola de poli-A de los ARNm 2- El tubo con la mezcla se coloca en un soporte con un imán y las esferas se unen al imán, agrupándose en la zona de la pared del tubo que esta en contacto con el mismo, manteniendo el ARNm unido a las esferas 3- Se lavan las esferas con etanol. Para eluir el ARNm se mezclan las esferas con agua destilada o tampón TE y se leva la temperatura produciéndose la separación del ARNm de los oligo-T 4- Se retiran las esferas con el separador magnético y el ARNm en solución se transfiere a un tubo limpio Una variante de esta técnica consiste en recubrir las esferas con estreptavidina. Previamente, el lisado se incuba con oligonucleótidos poli-T marcados con biótina. Existe una alta afinidad de la estreptavidina con la biotina ULTRAFILTRACIÓN Se basa en la retención por tamaño de las moléculas de ác.nucleicos mediante membranas con un tamaño de poro determinado, estas membranas se sitúan en la base de columnas que ajustan en tubos colectores Se utiliza para purificar productos de PCR con un tamaño superior a 150 pb PROCEDIMIENTO 1- La muestra se carga en la columna. Se centrifuga, quedándose sobre el filtro los productos amplificados de PCR, y al tubo colector pasan los contaminantes 2- Se lava el filtro con etanol para eliminar el resto de contaminantes 3- La resuspensión se hace con agua destilada o tampón TE. Se incuba a Tª ambiente unos minutos y se transfiere a un tubo limpio (Se resuspende en la misma columna o eppendorf) PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS Los plásmidos se utilizan para clonar secuencias génicas Hay que separar el ADN cromosómico y el ARN bacteriano para ello usamos la lisis alcalina LISIS ALCALINA Se basa en diferencias en el proceso de desnaturalización/renaturalización de ambos tipos de moléculas PROCEDIMIENTO: 1- Lisis alcalina Se suspenden las bacterias en una solución de lisis alcalina, pH 11, compuesta por detergente (Rompe la membrana del núcleo de la célula) aniónico SDS e hidróxido sódico. Se produce la desnaturalización del ADN, del cromosómico y del plásmido 2- Neutralización rápida Se añade una solución concentrada de acetato potásico a pH 4,8 produciéndose 2 efectos: A- La brusca neutralización provoca macroagregados insolubles del ADN cromosómico. El ADN plasmídico se renaturaliza perfectamente, recuperando su estructura. B- La alta concentración salina provoca la precipitación del detergente y las proteínas que atrapan el ADN cromosómico no renaturalizado. Se centrifuga y el sobrenadante se encuentra el ADN plasmídico El sobrenadante se transfiere a un tubo limpio y se trata con ARNasa para eliminar el ARN contaminante. Finalmente se purifica con algún método ya descrito: cromatografía de adsorción, de esferas magnéticas… CONSIDERACIONES ESPECIALES PARA LA PURIFICACIÓN DEL ARN Las ARNasas son enzimas muy resistentes. Con Tª elevadas pierden su actividad pero cuando disminuye la recobran, por eso condiciones especiales: - Trabajar con guantes en cabina de flujo laminar - Limpieza de superficies con soluciones comerciales inactivadoras de ARNasas - Debe estar todo certificado de que todo el material esté libre de ARNasas - La solución de lisis debe contener un agente caotrópico que inactive ARNasas. El más utilizado el isotiocianato de guanidinio - Todos los reactivos, incluida el agua, libre de ARNasas