Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos
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Questions and Answers

¿Cuál es la primera etapa en la extracción de ácidos nucleicos?

  • Purificación de los ácidos nucleicos
  • Extracción de los ácidos nucleicos
  • Pretratamiento de la muestra (correct)
  • Lisis de los hematíes

    • ¿Qué proceso se utiliza para eliminar la hemoglobina en el pretratamiento de sangre?

  • Purificación del sobrenadante
  • Agitación manual
  • Centrifugado de la muestra
  • Lisis de los hematíes (correct)

    • ¿Qué se debe evitar para mantener la integridad del ADN en la sangre?

  • Almacenarla a temperaturas superiores a 4ºC
  • Realizar la extracción más de 48 horas después de la recolección (correct)
  • Almacenar la sangre con EDTA
  • Congelarla durante más de 7 días

    • ¿Qué es necesario para el pretratamiento de tejidos fijados en formol?

    <p>Un medio líquido específico</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el objetivo principal del pretratamiento de la sangre?

    <p>Eliminar la hemoglobina</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué tipo de muestra no se debe almacenar más de 3 días si se requiere ADN íntegro?

    <p>Muestra de sangre</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué se obtiene tras el centrifugado de la muestra en el pretratamiento de sangre?

    <p>Un pellet y un sobrenadante</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál de las siguientes afirmaciones sobre la extracción de ácidos nucleicos es correcta?

    <p>Se realiza en tres fases distintas.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el primer paso en el proceso de desparafinización de tejidos FFPE?

    <p>Cortar con microtomo</p> Signup and view all the answers

    En el pretratamiento de cultivos de bacterias y levaduras en medio líquido, ¿qué es lo que se hace después de centrifugar el tubo?

    <p>Se resuspende el sedimento en el tampón</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál de los siguientes métodos se puede usar para recolectar células de la mucosa oral?

    <p>Raspado con torunda o cepillo</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué tipo de agente se utiliza para la fluidificación del esputo?

    <p>N-acetil-L-cisteína</p> Signup and view all the answers

    Al recolectar colonias aisladas sobre un medio sólido, ¿cómo se procede a su resuspensión?

    <p>Se resuspende en el tampón de suspensión</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué sucede con el sobrenadante en el pretratamiento de células de la mucosa oral?

    <p>Se elimina tras centrifugar la suspensión celular</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué compuestos se utilizan para realizar la desparafinización en tejidos FFPE?

    <p>Xilol y etanoles de concentraciones decrecientes</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué se añade al esputo para descontaminar la muestra si se desea detectar micobacterias?

    <p>Hidróxido sódico</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el principal componente que se utiliza para desestructurar la bicapa lipídica de las membranas durante el proceso de lisis celular?

    <p>Dodecil-sulfato-sódico (SDS)</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué función cumple el EDTA en el proceso de lisis celular?

    <p>Inhibe la actividad de las ADN-asas al quelar cationes divalentes.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál de los siguientes tratamientos se utiliza para liberar el contenido celular en células con pared celular?

    <p>Aplicación de proteasas.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué tipo de tratamiento es el bromuro de cetril-trimetril-amonio (CTAB) en el proceso de lisis celular?

    <p>Un agente caotrópico.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el efecto del isotiocionato de guanidinio en la purificación de ARN?

    <p>Desnaturaliza las macromoléculas, inhibiendo la actividad de las ARN-asas.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué tipo de tratamiento se realiza para degradar las paredes celulares de bacterias gram positivas?

    <p>Uso de lisozima o lisostafin.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué se debe verificar tras el proceso de lisis para asegurar resultados exitosos?

    <p>La presencia de grumos o cuerpos celulares.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el papel de las ADN-asas en la lisis celular?

    <p>Degradar ácidos nucleicos.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el primer paso necesario para eliminar el ARN presente en el lisado durante la extracción de ADN?

    <p>Añadir ARNasa A</p> Signup and view all the answers

    ¿Por qué no es necesario eliminar el ARN en las muestras de sangre periférica?

    <p>Porque no hay contaminación de ARN</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la función del acetato sódico durante la precipitación del ADN?

    <p>Unir cationes a las moléculas de ADN</p> Signup and view all the answers

    Durante la purificación de ácidos nucleicos, ¿qué se utiliza para retirar los compuestos solubles en solventes orgánicos?

    <p>Fenol, cloroformo y alcohol isoamílico</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué sucede con el ADN cuando se añade alcohol durante el proceso de precipitación?

    <p>Se elimina la capa hidratante que lo rodea</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál de las siguientes afirmaciones es correcta sobre la fase acuosa y la fase orgánica después de centrifugar el lisado?

    <p>La fase acuosa contiene ácidos nucleicos y sales</p> Signup and view all the answers

    ¿A qué temperatura se debe incubar la muestra después de añadir ARNasa A?

    <p>37ºC</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el objetivo de la purificación de ácidos nucleicos?

    <p>Separar los ácidos nucleicos de otros componentes del lisado</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué sucede con el ADN después de eliminarlo completamente del tubo?

    <p>Se deja secar con el tubo abierto a temperatura ambiente.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el propósito de la incubación inicial a 55-95ºC durante la rehidratación del ADN?

    <p>Desnaturalizar el ADN para facilitar su disolución.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la función principal de la precipitación con sales (salting out)?

    <p>Separar los ácidos nucleicos de las proteínas.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué tipo de intercambiadores se utilizan para la purificación de ácidos nucleicos?

    <p>Intercambiadores aniónicos.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué se hace con el sobrenadante después de precipitar proteínas en el proceso de salting out?

    <p>Se utiliza para resuspender el ADN.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué componente se añade al sobrenadante para precipitar el ADN?

    <p>Isopropanol.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la temperatura ideal para la incubación final en la rehidratación del ADN?

    <p>4ºC.</p> Signup and view all the answers

    Al lavar el ADN después de su precipitación, ¿qué tipo de solvente se utiliza?

    <p>Ethanol al 70-75%.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la función principal de los plásmidos en el contexto de la biología molecular?

    <p>Clonar secuencias génicas</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la función del detergente aniónico SDS en la lisis alcalina?

    <p>Romper la membrana del núcleo celular</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué sucede durante la neutralización rápida en el proceso de purificación de plásmidos?

    <p>Se producen macroagregados insolubles del ADN cromosómico</p> Signup and view all the answers

    ¿Por qué se debe trabajar en condiciones especiales para la purificación del ARN?

    <p>Porque las ARNasas son muy resistentes a las temperaturas elevadas</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué agente se menciona como el más utilizado para inactivar ARNasas en la solución de lisis?

    <p>Isotiocianato de guanidinio</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el primer paso del procedimiento de purificación de plásmidos?

    <p>Lisis alcalina</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué efecto tiene la alta concentración salina durante la neutralización en el proceso de purificación de plásmidos?

    <p>Provocar la precipitación del detergente y las proteínas</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué es necesario certificar antes de realizar la purificación para evitar la contaminación con ARNasas?

    <p>Todo el material debe estar libre de ARNasas</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

    • Los ácidos nucleicos se encuentran en el núcleo, citoplasma, mitocondrias y cloroplastos.
    • Están aislados del exterior celular por membranas y paredes celulares.
    • Las membranas celulares permiten la interacción con el exterior y regulan el transporte de sustancias mediante la bicapa lipídica.
    • La pared celular protege y da rigidez a la célula.
    • La primera etapa de extracción hace accesibles los ácidos nucleicos a los reactivos y enzimas.
    • La segunda etapa de purificación elimina las sustancias que interfieren en la extracción de los ácidos nucleicos.

    Pretratamiento de Muestras Biológicas

    • El pretratamiento depende del tipo de muestra.
    • Las suspensiones celulares están formadas por células individuales y agregados que flotan en un medio líquido.
    • Los pretratamientos más comunes incluyen: sangre, cultivos celulares, tejidos animales o vegetales frescos, tejidos fijados en formol e incluidos en parafina y otras muestras como esputos, células de la mucosa oral, bacterias y levaduras.

    Pretratamiento de Sangre

    • El objetivo es eliminar la hemoglobina mediante lisis de los hematíes para estudiar los ácidos nucleicos a partir de leucocitos.
    • Se debe usar sangre anticoagulada con EDTA, heparina o citrato de sodio, y la muestra debe procesarse dentro de las 24 horas de su extracción.
    • El pretratamiento de la sangre implica lisis de los hematíes (rotura de eritrocitos).
    • Se centrifuga la muestra para obtener el sedimento (pellet) de leucocitos y eliminar el sobrenadante con los componentes del plasma sanguíneo y la hemoglobina.
    • El sedimento se conserva para continuar el proceso de extracción.

    Obtención de Células Mononucleadas de Sangre Periférica

    • Para aislar células mononucleadas de sangre periférica (PBMC), que incluyen linfocitos y monocitos, se usa la técnica de centrifugación en gradiente de densidad, utilizando un medio de extracción específico (PBMC).
    • Esto permite la obtención de PBMC antes de la extracción de los ácidos nucleicos.

    Cultivos Celulares

    • Es un método de obtención de células in vitro.
    • Existen dos tipos de cultivos: en suspensión y en monocapa.
    • Las células en suspensión crecen libremente en el medio cultivo
    • Las células en monocapa crecen adheridas a las paredes del frasco.

    Pretratamiento de Tejidos Animales o Vegetales Frescos

    • Para liberar las células de tejido requiere un pretratamiento de homogeneización, química o mecánica, para procesar la muestra.
    • La cantidad de tejido dependerá del método de homogeneización y del procedimiento de extracción de los ácidos nucleicos.
    • La homogeneización mecánica rompe el tejido.
    • La homogeneización automatizada utiliza máquinas o elementos mecánicos; la manual se realiza con mortero.

    Pretratamiento de Tejidos Fijos en Formaldehído e Incluidos en Parafina (FFPE)

    • Necesita desparafinización del tejido.
    • Se realiza con microtomo para cortes finos.
    • Se incuba con xilol, solventes desparafinantes, etanoles de concentraciones decrecientes y agua destilada.

    Cultivos de Bacterias y Levaduras

    • Se ubican en una solución tampón (Solución GTE: TRIS 25mM, pH 8, EDTA 10mM y glucosa 50 mM).
    • Métodos de obtención: en medio líquido o en colonias aisladas sobre medio sólido (Placa de agar).

    Pretratamiento de Esputo

    • Se fluidifica con un agente mucolítico (N-acetil-L-cisteína)
    • Si la muestra es de micobacteria, se adiciona hidróxido de sodio para descontaminarla.

    Extracción de Ácidos Nucleicos (Etapa 2)

    • Este proceso implica la liberación de los ácidos nucleicos de las estructuras celulares.
    • Dos procesos clave: lisis celular (para liberar los ácidos nucleicos) e inactivación de ADN-asas y ARN-asas (para prevenir la degradación de los ácidos nucleicos).
    • La composición de la solución de lisis depende del tipo de célula.

    Detergentes

    • Desestructuran la bicapa lipídica de las membranas y desnaturalizan las proteínas.

    EDTA

    • Es un quelante de cationes divalentes (como calcio y magnesio) que inhibe la actividad de las ADN-asas.

    Proteínas

    • La proteinasa K digiere las proteínas de la membrana celular.

    Agentes caotrópicos (Guanidinio)

    • Desnaturalizan macromoléculas, evitando la degradación de componentes celulares.

    Tratamiento de Células con Pared Celular

    • Requiere métodos enzimáticos (ej. lisozima) o mecánicos (ej. ciclos de congelación-descongelación, sonicación) para romper la pared celular.
    • (ej. cetyltrimethylammonium bromide o CTAB) es útil para eliminar polisacáridos y otros componentes que interfieren con los procesos enzimáticos.

    Purificación con Solventes Orgánicos

    • Se basa en la solubilidad de los ácidos nucleicos en solventes orgánicos.
    • ADN es soluble en agua porque presenta carga negativa.
    • El procedimiento implica la extracción de los compuestos solubles utilizando una combinación de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico.
    • Se separa el ADN del resto de contaminantes, con agitación suave

    Purificación Mediante Esferas Magnéticas

    • Método para extraer y purificar ácidos nucleicos de una muestra, uniéndolos a microesferas magnéticas.
    • Se usa para separar de contaminantes.
    • Se puede utilizar para aislar ARNm, mediante el uso de oligo-T.

    Ultrafiltración

    • Se basa en la retención por tamaño de las moléculas.
    • Se utilizan membranas de tamaño de poro definido.

    Purificación de Plásmidos (Lisis Alcalina)

    • Usa lisis alcalina para separar ADN cromosómico de ARN bacteriano.
    • Se basa en diferentes procesos desnaturalización-renaturalización de ambos tipos de moléculas.

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    Este cuestionario explora los procesos de extracción y purificación de ácidos nucleicos, incluyendo las etapas de pretratamiento de muestras biológicas. Se analizan los métodos para hacer accesibles los ácidos nucleicos y purificarlos de contaminantes. Ideal para estudiantes de biología molecular.

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