Protocolo Prácticas Genética 2023-2024 PDF

FACULTAD DE CIENCIAS BIOMÉDICAS Y DE LA SALUD DPTO. CIENCIAS DE LA SALUD PRÁCTICAS DE GENÉTICA GRADO DE BIOMEDICINA Contenido: - Extracción de ADN - Amplificación por PCR - Electroforesis en gel de agarosa - Digestión con enzima...

FACULTAD DE CIENCIAS BIOMÉDICAS Y DE LA SALUD DPTO. CIENCIAS DE LA SALUD PRÁCTICAS DE GENÉTICA GRADO DE BIOMEDICINA Contenido: - Extracción de ADN - Amplificación por PCR - Electroforesis en gel de agarosa - Digestión con enzimas de restricción - Análisis de polimorfismos genéticos  NORMAS DE EVALUACIÓN DE LAS PRÁCTICAS DE GENÉTICA Las prácticas constituyen un 15% de nota final de la asignatura de Genética, siendo necesario sacar una nota 5 en las prácticas de laboratorio para superar la asignatura. Las prácticas se evaluarán teniendo en cuenta los siguientes criterios: La asistencia es obligatoria todos los días de prácticas. Si se falta uno de los días, las prácticas estarán suspensas. Los conocimientos adquiridos durante las prácticas se evaluarán mediante una prueba escrita objetiva tipo test, que se realizará el último día de prácticas. La nota del examen será modulada por la nota obtenida en el desarrollo de competencias y habilidades en el laboratorio. Por tanto, la nota final de prácticas será la nota del examen modulada desde -1,5 hasta +1,5 por la nota de competencias a criterio del profesor de prácticas, que se guiará por la rúbrica siguiente: Competencia o habilidad Ítem Puntualidad. Se permitirán 10 min de margen. Responsabilidad No usar el móvil durante las sesiones de trabajo Bata abrochada Acudir al laboratorio equipado correctamente Pelo recogido Utilizar guantes cuando se manejen reactivos y ADN Seguimiento de protocolos de seguridad y de Eliminar los residuos de forma adecuada trabajo en el laboratorio Recoger el material y dejarlo limpio Traer el guion impreso y leído (estudiado y entendido) Aprendizaje activo Actitud “activa” en el laboratorio Participar en las explicaciones del profesor y en la puesta en común de resultados Aprender a usar las pipetas automáticas Desarrollo de destrezas en el laboratorio Aprender a cargar geles de agarosa Llevar a cabo el trabajo del laboratorio siguiendo siempre el protocolo de trabajo. PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 2 Objetivos: - Comprender y conocer la función de cada reactivo y colorante utilizado en el medio de cultivo y en las extensiones celulares. - Familiarizarse con técnicas básicas del laboratorio de Genética a nivel de extracción de ADN. - Comprender y conocer la función de cada reactivo utilizado para el aislamiento y purificación de ADN cromosómico. - Comprender el funcionamiento y la técnica utilizada para la amplificación in vitro de un fragmento concreto de ADN - Comprender el funcionamiento de la electroforesis - Entender los principios básicos de la digestión con enzimas de restricción - Aprender a interpretar los resultados obtenidos 1. Extracción de ADN genómico a partir de sangre El método que vamos a utilizar es óptimo para la extracción y purificación de ADN a partir de sangre. Vamos a utilizar un kit comercial llamado QIAamp DNA Micro Kit que utiliza una tecnología bien establecida para la purificación de ADN genómico a partir de volúmenes o tamaños de muestra pequeños. El kit combina las propiedades de unión selectiva de procedimiento es adecuado para una amplia gama de muestras, como pequeños volúmenes de sangre. El procedimiento está diseñado para garantizar que no haya contaminación cruzada entre muestras y permite la manipulación segura de muestras potencialmente infecciosas (aunque no sea nuestro caso). Tras la lisis de la muestra, el sencillo procedimiento QIAamp DNA Micro, es muy adecuado para el procesamiento simultáneo de múltiples muestras, produciendo ADN puro en menos de 30 minutos. El ADN se eluye en agua y está inmediatamente listo para su uso en reacciones de amplificación (PCR) o para su almacenamiento a -20°C. El ADN purificado está libre de proteínas, nucleasas y otras impurezas. PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 3 El procedimiento consta de 4 pasos generales (Figura 1): Figura 1: desnaturalización alta presencia de degrada proteinas. 3 tampón · 1. Lisado: la muestra es lisada ↑ Temperatura · proteinasak y AL - > LJSJS contiene detergente 2. Fijación: el ADN del lisado se une a la membrana de la · SDS columna QIAamp MinElute 3 tampón AL clisis 3. Lavado: la membrana se lava con tampón ANJ y AW2) tampón , lavado. que permite el 4. Eluir: el ADN se eluye de la membrana 3. uso de agua destilada b separa El QIAamp DNA Micro Kit está diseñado para ser utilizado con pequeñas cantidades de muestra, muestras de sangre (1-100 Lisis de las muestras Las muestras se lisan en condiciones de alta desnaturalización a temperaturas elevadas en presencia de proteinasa K y tampón AL (ATL para muestras de tejido). Fijación del ADN a la membrana de la columna QIAamp MinElute Para permitir la unión óptima del ADN a la membrana, se añade Buffer AL (y en la mayoría de los protocolos etanol) al lisado. Los lisados se transfieren a una columna QIAamp MinElute donde el ADN se adsorbe en la membrana de gel de sílice a medida que el lisado es arrastrado por centrifugación. Las condiciones de sal y pH garantizan que las proteínas y otros contaminantes que pueden inhibir la PCR no queden retenidos en la membrana de la columna QIAamp MinElute. El rendimiento de ADN depende del volumen o tamaño y de la calidad de la muestra inicial. Para la limpieza del ADN genómico, las condiciones de unión a la membrana de gel de sílice se se ajustan añadiendo los tampones AW1 y AW2. Las columnas QIAamp MinElute caben en la mayoría de los tubos de microcentrífuga estándar. Debido al volumen de flujo, se necesitan tubos de recogida de 2 ml (suministrados) para sostener la columna QIAamp MinElute durante los pasos de carga y lavado de la muestra. Lavado de los contaminantes residuales Mientras los ácidos nucleicos permanecen unidos a la membrana de la columna QIAamp MinElute los contaminantes se eliminan eficazmente utilizando primero el tampón AW1 y luego el tampón AW2. Para la limpieza del ADN genómico, un solo paso de lavado con el tampón AW2 es suficiente para eliminar los contaminantes. Elución del ADN puro El ADN se eluye de la columna QIAamp MinElute utilizando un pequeño volumen de agua destilada. Dado que el volumen de elución es pequeño, el ADN eluido estará concentrado. En caso de que para aplicaciones posteriores se requieran pequeños PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 4 volúmenes de inicio (PCR) y un eluido más concentrado las columnas QIAamp MinElute permiten un volumen de elución mínimo de PROCEDIMIENTO EXERIMENTAL: Este protocolo sirve para aislar el ADN genómico a partir de 1-200 sangre total tratada con anticoagulantes a base de EDTA, citrato o heparina. Punto importante antes de comenzar Realice todos los pasos de centrifugación a temperatura ambiente (15-25°C). Cosas que hay que hacer antes de empezar Equilibrar las muestras a temperatura ambiente (15-25°C). Equilibrar el agua destilada para la elución a temperatura ambiente. Ajustar una incubadora orbital (termobloque) a 56°C para su uso en el paso 5. Asegúrese de que los tampones AW1 y AW2 se han preparado (añadir etanol). Material: - Tampón PBS (phosphate buffered saline) es una solución tampón o buffer que contiene cloruro sódico, fosfato sódico, cloruro de potasio y fosfato de potasio. Su osmolaridad y concentración de iones es muy semejante a la del líquido extracelular de los mamíferos - Tampón AL (lleva un detergente, SDS, necesario para la lisis celular y así la liberación del ADN del núcleo celular). - Proteinasa K: enzima de amplio espectro que degrada proteínas, entre ellas, las histonas que forman la cromatina - Etanol absoluto: para precipitar el ADN antes de su fijación a la membrana de sílica - Buffer de lavado: Tampón AW1 y tampón AW2 - Agua destilada estéril - Eppendorfs de 1,5 mL - Micropipetas y puntas Procedimiento: 1. Pipetear 200 de sangre total en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml 1’. Si no hay muestra suficiente de sangre, añadir tampón 1XPBS hasta un volumen final de 200 2. Añadir 200 de Buffer AL, cerrar la tapa y mezclar mediante vórtex durante 15 s. 3. muestra, el Buffer 1XPBS, la proteinasa K, y el tampón AL se mezclen a fondo para obtener una solución homogénea. 4. Incubar a 56°C durante 10 minutos. Nota: Si las muestras se agitan durante la incubación, el rendimiento del ADN puede aumentar. 5. Centrifugar brevemente (10”) el tubo de 1,5 ml para eliminar las gotas del interior de la tapa. PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 5 6. -100%), cerrar la tapa y mezclar a fondo con el vortex durante 15 s. Incubar durante 3 min a temperatura ambiente. Nota: Si la temperatura ambiente supera los 25 °C, enfriar el etanol en hielo antes de añadirlo al tubo. 7. Centrifugar brevemente el tubo de 1,5 ml para eliminar las gotas del interior de la tapa. 8. MinElute (en un tubo de recogida de 2 ml de fondo en U) sin mojar el borde. Cerrar la tapa y centrifugar a 8000 rpm durante 1 minuto. Vaciar el contenido del tubo colector cargar secuencialmente (y centrifugar) en la misma columna. 10. mojar el borde. Cerrar la tapa y centrifugar a 8000 rpm durante 1 minuto. Descartar el eluido en el vaso de Virkon. 11. mojar el borde. Cerrar la tapa y centrifugar a 8000 rpm durante 1 minuto. Descartar el eluido en el vaso de Virkon. Se debe evitar el contacto entre la columna QIAamp MinElute (sobre todo el puerto de salida de la columna) y el líquido de desecho. Algunos rotores de centrífuga pueden vibrar al desacelerar, lo que hace que el que contiene etanol, entre en contacto con la columna QIAamp MinElute. Cuidado al retirar la columna QIAamp MinElute y el tubo de recogida del rotor, para que el líquido no entre en contacto con la columna QIAamp MinElute. 12. Centrifugar a máxima velocidad (14.000 rpm) durante 3 minutos para secar la membrana completamente. Este paso es necesario, ya que el arrastre de etanol en el eluido puede interferir con algunas aplicaciones posteriores. 13. Colocar la columna QIAamp MinElute en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml y desechar el tubo de recogida que contiene el desecho. Con cuidado, abrir la tapa de la columna QIAamp MinElute y aplicar 50 agua destilada [caliente] en el centro de la membrana. 14. Cerrar la tapa e incubar a temperatura ambiente (15-25°C) durante 5 min para despegar el ADN de la membrana. Centrifugar a velocidad máxima (14.000 rpm) durante 1 min para recoger el ADN eluido de la membrana. 15. Medir la calidad y cantidad de ADN presente en cada una de las muestras en el espectrofotómetro (Biodrop). Para la PCR se necesita una concentración mínima de ADN de 100 a 500 ng/ µl). El valor de pureza que se obtiene del nanodrop resulta de la relación de Absorbancia a 260/280 nm. La absorbancia a 260 nm mide ADN y ARN, y a 280 nm mide proteínas y restos de disolventes, de manera que el valor adecuado que indica que tenemos un ADN más o menos limpio para poder trabajar será 1,8-2,0 valores por debajo de 1,6 indican ADN de calidad insuficiente para trabajar con él, y valores elevados (>2,0) pueden indicar contaminación por alcoholes, y deben ser repurificados o desechados. PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 6 2. Amplificación de ADN mediante PCR Fundamento teórico: La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de mínimas cantidades de ADN molde, situado entre dos regiones cuyas secuencias son conocidas. Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que se unan en sus regiones complementarias unos fragmentos cortos de ADN de secuencia conocida, lo que reconoce la ADN polimerasa como estructura a la que añadir nuevos nucleótidos y completar la duplicación del fragmento deseado. desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos (generalmente Thermus aquaticus (polimerasa Taq)). En una reacción de PCR participan los siguientes elementos: - ADN bicatenario molde contiene la región amplificar) desnaturaliza a altas temperaturas , se por calor a. - Dos oligonucleótidos o cebadores, que flanquean el elemento a amplificarbi cebadores las secuencias los se unen a - ADN polimerasa termoestable b complementarias. fragmento polimerasa - MgCl2 cofactor ADN de ADN. > - de - dNTPs - Tampón con sales El ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar, se - Después de esto, se hace descender la temperatura para permitir la hibridación de los cebadores con sus secuencias complementarias. * primer Los dos cebadores (iniciadores o primers) son los responsables de la especificidad en la reacción. Son dos oligodeoxinucleótidos de cadena sencilla, complementarios cada uno a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos (normalmente de 18 a 22) que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia (100-1000bp). Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar. de nucleótidos hebra ADN partir preexistente. * encargada agregar los para crear una nueva de a de una La enzima ADN polimerasa (con temperatura óptima alrededor de 70°C) incorpora los cuatro dNTPs, utilizando la energía de los enlaces trifosfato para catalizar la reacción de síntesis en sentido 5’ 3’. La concentración de iones Mg2+ en forma de MgCl2 es fundamental. A concentraciones adecuadas, el Mg2+ actúa como cofactor de la ADN polimerasa. PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 7  La solución tampón (Tris) mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. Ciclo de amplificación: La reacción de amplificación se desarrolla en tres fases: desnaturalización, hibridación y elongación. ruptura de los enlaces * - Desnaturalización: Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de - °C (durante 30 segundos-2 minutos) para que se separen las dos hebras de ADN de las cuales está constituido. se incorpora el primer A - Hibridación, alineamiento, annealing o unión del cebador: el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C (durante 20-40 segundos), permitiendo así el alineamiento. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. - Extensión o elongación de la cadena: aquí actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está a 72°C. El tiempo de extensión depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Gen a amplificar: GEN DEL CITOCROMO CYP3A5*3 El citocromo CYP3A5 pertenece a la familia del citocromo P450 (oficialmente abreviado como CYP) que es un grupo muy grande y diverso de enzimas, llamadas CITOCROMOS o CYPs. Los CYPs son proteínas asociadas a membranas, localizadas en la membrana interna de las mitocondrias o en el retículo endoplásmico celular. Su función es metabolizar compuestos endógenos y exógenos en el hígado entre los que se incluyen una enorme variedad de fármacos, drogas y compuestos tóxicos que entran en el organismo. Los citocromos son responsables del metabolismo del 40% de los fármacos más frecuentemente prescritos. Su función es principalmente detoxificadora llevando a cabo reacciones de hidroxilación sobre los sustratos, en lo que se conoce como metabolismo hepático fase I. De este modo, los productos hidroxilados son más fáciles de excretar al ser más solubles. El gen CYP3A5, en concreto, codifica para el citocromo CYP P450, familia 3, subfamilia A, polipéptido 5. Se encuentra situado en el cromosoma 7, en la región 7q21.1. Se han descrito muchas mutaciones en este gen que provocan un metabolismo nulo por parte de este citocromo. Una de las mutaciones más abundantes es el alelo 3 prevalencia menor en otros grupos poblacionales como, por ejemplo, en asiáticos (56- 88%) o en el África subsahariana (24%). El alelo 3 es una mutación de tipo SNP (single nucleotide polymorphism) consistente en una cambio de una Adenina por una Guanina PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 8 en la posición del gen. Esta sustitución provoca un cambio en el splicing del ARNm, generándose una enzima no funcional. En estas prácticas, vamos a amplificar mediante la técnica de la PCR un fragmento del gen CYP3A5, y mediante el corte con una enzima de restricción vamos a distinguir el alelo *1 (normal o wild type) del alelo *3, responsable de la síntesis de un enzima no funcional. Material y procedimiento: - Preparar la siguiente mezcla de reacción para cada muestra: (1 x) H2O 3.5 µl Tampón 2x con MgCl2 + dNTPs+ Taq 12.5 µl Primer forward 10 µM 2.5 µl 21 µl/ tubo Primer reverse 10 µM 2.5 µl - Secuencia de primers: CYP3A5*3-F: 5’-CATCAGTTAGTAGACAGATGA-3’ CYP3A5*3-R: 5’-GGTCCAAACAGGGAAGAAATA-3’ - Añadir la muestra correspondiente a cada tubo: 4µl ADN extraído (100-400 ng) o 4µl de agua estéril al tubo control (“blanco”) - Colocar los tubos en el termociclador y Activar el programa “CYP3A5-3” (±3 horas) cuyas condiciones son: 1- Desnaturalización inicial: minutos del ADNIde [ · separación las nebras) 2- Desnaturalización: 30 segundos alineamiento 3- 40 segundos 40 ciclos.. unión Polimerasa E 4- Extensión: 30 segundos del cebador. ADN · 5- Última 5 minutos 6- - Sacar los tubos del termociclador y conservarlos hasta su visualización en gel. 3. Electroforesis en gel de agarosa Fundamento teórico: Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño: típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los tamaño/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR. PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 9  La electroforesis en gel es una técnica que permite la migración de moléculas cargadas en un medio que contiene un tampón cuando se le aplica un campo eléctrico. Cuando se aplica un campo eléctrico a un gel de agarosa, los fragmento de ADN, cargados negativamente a pH neutro debido a sus grupos fosfato, migran hacia el polo positivo con una velocidad de migración inversamente proporcional a su tamaño. De esta forma, los fragmentos de ADN contenidos en una muestra se irán separando en su recorrido en función de la masa molecular que posean. La matriz que utilizaremos es la agarosa. Un aspecto importante es su estado físico: entre sí espacios donde se aloja el líquido y por los que van a migrar las moléculas cargadas. En función de la concentración de agarosa empleada, la densidad de la matriz será más o menos compacta y por lo tanto el tamaño del poro por el que migrarán las moléculas será más grande o pequeño. La concentración del gel de agarosa depende del tamaño de los fragmentos de ADN a separar, siendo la concentración mínima el 0.7% (fragmentos grandes de varias kpb) y la máxima el 4% (fragmentos de 50-150 pb). Para un gel al 1%, se pesa 1g de agarosa por 100 ml de volumen de gel. La electroforesis en gel de agarosa se hace en el plano horizontal con éstos sumergidos en un tampón, con lo que las muestras de ADN deben de tener una elevada densidad para que permanezcan en el interior del pocillo durante el proceso de carga. Por ello las muestras se mezclan con un tampón de carga que contiene glicerol (incrementa la densidad) y uno o dos colorantes visibles cargados negativamente (azul de bromofenol y/o xylen cyanol) que con su migración actúan de indicadores del avance de las muestras. Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán calcular el peso molecular de las muestras de ADN problema. Normalmente se utilizan fragmentos procedentes de ADN virales o de plásmidos digeridos con alguna enzima de restricción que generan fragmentos de ADN conocidos. La visualización del ADN en los geles se hace mediante tinción con el colorante fluorescente gel red, que tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de ADN aplicado y los marcadores de peso molecular. Material y procedimiento: - Preparar un gel de Agarosa al 1,2%: pesar 1 g de Agarosa y llevarlo a un erlenmeyer conteniendo 80 ml TBE 1x (o TAE 1x). Calentar en microondas hasta que la agarosa se disuelva homogéneamente. o TBE 10x: 1 litro, para los geles: o 108 gr. Tris o 55 gr. Ácido bórico o 40 ml EDTA 0,5M pH8 - Añadir 1,6 de GelRed 20000x como agente intercalante en el ADN y fluorescente para su posterior visualización. - Preparar la bandeja portageles donde gelificará el gel, sellando bien con cinta adhesiva el perímetro de la bandeja portageles o utilizando selladores de silicona. - Colocar los peines que servirán como molde para delimitar los pocillos donde se cargarán las muestras en el gel. - Verter la agarosa evitando la formación de burbujas y dejar solidificar. PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 10  formado por tris , borato * Y EDTA - Colocar el soporte con el gel sobre la cubeta de electroforesis y cubrirlo con tampón TBE. - Cargar en los pocillos: Marcador: 1 µl buffer de carga + 1 µl marcador Ladder 100 + 4 µl H2O estéril Muestras PCR: 1 µl buffer de carga + 5 µl muestra PCR - Conectar los cables desde la fuente de alimentación a cada extremo de la cubeta. Fijar el voltaje: 120 voltios durante 30 minutos - Cuando ha terminado el proceso, apagar la fuente y retirar los cables. Poner el gel sobre la pantalla del transiluminador de luz UV y analizar los resultados El producto amplificado es de Ladder 100 4. Análisis de polimorfismos genéticos Fundamento teórico: En los últimos años ha sido objeto de análisis y debate la enorme variabilidad interindividual existente en la eficacia y toxicidad de muchos fármacos. Muchos son los factores personales y ambientales que han sido asociados a la respuesta a fármacos, pero, entre todos ellos, las diferencias genéticas interindividuales en el transporte, metabolismo y dianas de ciertas drogas parecen jugar un papel relevante en el éxito o fracaso de algunos fármacos conocidos. Variaciones a nivel de ADN son las responsables de la diferente respuesta que presentan diferentes individuos ante un mismo fármaco, lo cual comienza a plantear la necesidad de llevar a cabo un estudio genético previo antes de seleccionar la dosis que debe ser administrada al paciente, según su perfil metabolizador. Procedimiento experimental: Uno de los métodos empleados para la caracterización de fragmentos de ADN amplificados por PCR es sometiéndolo a digestión por enzimas específicas. PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 11  La enzima comúnmente utilizada para el genotipado del CYP3A5*3 es la enzima SspI, que reconoce la diana de restricción AATATT y corta donde señalan las flechas: 5´…AATATT…3´ 3´…TTATAA…5´ Para ello, se añade la enzima al producto de PCR junto con tampón NEB según el protocolo abajo indicado: Mix reacción: 1x H2O 7.6 µl VF=10µl Tampón CutSmart (10x) 2 µl SspI (20U/ µl) 0.4 µl Añadir de producto de PCR a cada tubo y se deja incubar 1,5horas a De nuevo, para poder analizar los resultados se realizará una electroforesis sobre un gel donde se separarán los distintos fragmentos. En esta ocasión, se preparará un gel de agarosa al 3% para poder diferenciar bien los fragmentos de tamaños más parecidos. Las condiciones de la electroforesis del producto de digestión serán: - Cargar en los pocillos: Marcador: 1 µl buffer de carga + 1 µl marcador Ladder 100 + 4 µl H2O estéril Muestras digestión: 4 µl buffer de carga + 20 µl muestra digestión - Conectar los cables desde la fuente de alimentación a cada extremo de la cubeta. Fijar el voltaje: voltios durante 50 minutos En el caso del CYP3A5, el alelo *1 es el resultado de dos cortes con la enzima de restricción, debido a la existencia de dos dianas. Dicho alelo *1 es el producto normal del gen, que codifica para una proteína perfectamente funcional para hidroxilar sustancias a nivel hepático. ¿Cómo se genera el alelo *3? Una sustitución de una A por una G en una de las dos dianas de restricción provoca la desaparición de esa diana y, por tanto, el ADN producto de PCR será cortado solo en una de las dianas. La mutación genera una proteína que no será funcional. 125 20 148 GENOTIPO 1/1 3/3 pb 125 125 pb 148 168 pb 20 En la tabla se observa el tamaño de las bandas que se observarán en un homocitogo 1/1 (con 2 dianas de restricción) y un homocigoto 3/3 (con una sola diana de restricción). El heterocigoto presentará todas las bandas (168 + 148 + 125 + 20). La siguiente figura corresponde a una fotografía de un gel en que se aprecian los distintos posibles genotipos del gen CYP3A5 con un marcador de peso molecular PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 12 conocido. En la figura se observa el patrón de bandas de izda a dcha de: un marcador de tamaño (la banda más intensa corresponde a un fragmento de 500 pb), un individuo 1/1 (homocigoto wt), un individuo 1/3 (heterocigoto) y un individuo 3/3 (homocigoto para la mutación). M 1/1 1/3 3/3 200bp 150bp 100bp 50bp Nota: el fragmento de 20 pb no se observa debido a su pequeño tamaño 5. Análisis de los resultados: En función de la digestión realizada halla la frecuencia de los alelos *1 y *3 del gen CYP3A5 en la muestra de individuos analizada. PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 13 CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA EXTRACCIÓN DE ADN PARA LA REALIZACIÓN DEL GENOTIPADO DEL GEN CYP3A5*3. PRÁCTICAS DOCENTES DE LA ASIGNATURA DE GENÉTICA DEL GRADO DE MEDICINA, FARMACIA O INGENIERÍA BIOMÉDICA DE LA UEM (DPTO. MEDICINA Y CC. DE LA SALUD) 1. INFORMACIÓN GENERAL La forma en que el organismo humano responde al tratamiento de determinados fármacos presenta una gran variación interindividual debida, en parte, a variaciones en el propio metabolismo que sufren estos compuestos. Algunas de estas variaciones son consecuencia de polimorfismos genéticos que provocan distintas capacidades en la formación de metabolitos. Una de las enzimas mas importantes en el metabolismo de compuestos es el citocromo P450 3A5 (CYP3A5) en el que se han descrito polimorfismos concretos relacionados con metabolismos ultrarrápidos, normales o lentos. Como parte de las prácticas de genética se va a llevar a cabo la toma de una muestra biológica de mucosa bucal, para llevar a cabo la extracción de ADN y posterior genotipado del alelo 3 del gen CYP3A5 2. PROCEDIMENTO Toma de una muestra de mucosa bucal para la extracción y aislamiento de ADN. El genotipado del alelo 3 del gen CYP3A5 se llevará a cabo mediante las técnicas de PCR y posterior digestión con enzimas de restricción. La muestra una vez extraída será codificada dando un carácter anónimo al estudio y garantizando la confidencialidad de la información. 3. REACCIONES ADVERSAS Ninguna. Puede apreciarse una leve molestia en la mucosa bucal tras la extracción. CUADRO DE RIESGOS: NOMBRE ELIMINACION RIESGOS MEDIDAS DE PREVENCIÓN (E Pis) ACTUACION EN CASO DE ACCIDENTE DISOLUCIONES AGAROSA ACUOSAS 0 USO DE GUANTES SIN INDICACIONES PARTICULARES ORGANICAS POR SU USO A CONTACTO CON PIEL U OJOS LAVAR CON AGUA AGENTE INTERCALANTE 0 GUANTES DE NITRILO BIOLOGICO ABUNDANTE MINIMO 15 MINUTOS. DISOLVENTES SIN INDICACIONES GUANTES DE NITRILO, GAFAS DE ETANOL ABSOLUTO ORGANICOS NO SIN INDICACIONES PARTICULARES ESPECIALES PROTECCION HERMETICAS HALOGENADOS INCOMPATIBLES CON AGENTES OXIDANTES FUERTES. NO SE HAN CONTACTO CON PIE LLAVAR CON AGUA ABUNDANTE Y DISOLUCIONES NO INVESTIGADO GEL LOADING BUFFER SIN INDICACIONES PARTICULARES JABON MINIMO 15 MINUTOS, CONTACTO CON OJOS HALOGENADAS SUFICIENTEMENTE SUS ACLARAR. CARACTERISTICAS FISICAS, QUIMICAS Y TOXICOLOGICAS. IRRITANTE OCULAR CONTACTO CON PIEL LAVAR CON AGUA ABUNDANTE Y DISOLUCIONES NO INCOMPATIBLE CON AGENTES TBE 10X GUANTES DE NITRILO JABON MINIMO 15 MINUTOS, CONTACTO CON OJOS HALOGENADAS OXIDANTES FUERTES ACLARAR PRÁCTICAS GENÉTICA. 2023-2024. S2 Página 14