Il Genoma Umano PDF

IL GENOMA UMANO Il perfezionamento delle metodiche molecolari di analisi del DNA e dell' automazione del sequenziamento, in parallelo allo sviluppo di nuovi programmi informatici, ha permesso di concretizzarsi l'HUMAN GENOME PROJECT (HGP o Progetto Genoma Umano) ossia il sequenziamento completo...

IL GENOMA UMANO Il perfezionamento delle metodiche molecolari di analisi del DNA e dell' automazione del sequenziamento, in parallelo allo sviluppo di nuovi programmi informatici, ha permesso di concretizzarsi l'HUMAN GENOME PROJECT (HGP o Progetto Genoma Umano) ossia il sequenziamento completo del genoma umano. Tutto questo ha condotto quindi alla nascita della genomica, una branca della biologia molecolare che si occupa dello sviluppo e dell'applicazione di nuove procedure per la mappatura, il sequenziamento e l'analisi di interi genomi. Sulla scia del Progetto Genoma Umano sono partiti altri progetti mirati al sequenziamento del genoma di altri organismi geneticamente importanti: il batterio Escherichia coli il lievito Saccharomyces cerevisiae il moscerino della frutta Drosophila melanogaster, il nematode Caenorhabditis elegans il topo Mus musculus, il cui genoma per la sua complessità è paragonabile a quello umano. IL GENOMA UMANO  IL GENOMA UMANO Con il termine genoma umano si intende l'intero contenuto informazionale delle cellule umane. IL GENOMA UMANO In realtà esistono due genomi, ossia quello mitocondriale, abbastanza semplice, e quello nucleare, esteso e complesso. Il genoma mitocondriale è una singola molecola di DNA circolare di 16.569 basi e rappresenta lo 0,0005% del genoma umano. Una sua peculiarità è che i due filamenti componenti differiscono significativamente per la composizione in basi e quindi si distinguono un filamento pesante ed un filamento leggero. Consta di 37 geni, compatti, privi di introni e parzialmente sovrapposti, dei quali 13 codificano per polipeptidi specificamente mitocondriali e 24 codificano per RNA necessari per l'espressione del genoma mitocondriale stesso.  IL GENOMA UMANO Il genoma mitocondriale contiene due filamenti che differiscono significativamente per la composizione in basi e quindi si distinguono in: un filamento pesante un filamento leggero Consta di 37 geni, compatti, privi di introni e parzialmente sovrapposti, dei quali 13 codificano per polipeptidi specificamente mitocondriali e 24 codificano per RNA necessari per l'espressione del genoma mitocondriale stesso. Il genoma mitocondriale: si distinguono in due filamenti: ❖ filamento pesante (H-strand) ricco di guanina. ❖ filamento leggero (L-strand) ricco di citosina.  IL GENOMA UMANO Il genoma nucleare diploide è costituito all'incirca da 6,4 miliardi di coppie di basi, organizzate a costituire 46 cromosomi. Contiene sequenze codificanti (geni) e sequenze non codificanti, che rappresentano oltre il 90% del genoma. Il numero di geni è stato stimato intorno a 20.000, ma la loro distribuzione varia notevolmente a seconda delle regioni genomiche, con regioni eterocromatiche completamente prive di geni e regioni eucromatiche in cui i geni sono presenti, sebbene con una densità variabile da regione e regione.  IL GENOMA UMANO Il genoma nucleare diploide è costituito all'incirca da 6,4 miliardi di coppie di basi, organizzate a costituire 46 cromosomi (visibili in metafase). In esso si distinguono sequenze codificanti (geni) e sequenze non codificanti, che rappresentano oltre il 90% del genoma. Il numero di geni è stato stimato intorno a 20.000, ma la loro distribuzione varia notevolmente a seconda delle regioni genomiche, con regioni eterocromatiche completamente prive di geni e regioni eucromatiche in cui i geni sono presenti, sebbene con una densità variabile da regione e regione.  IL GENOMA UMANO Nell'ambito delle regioni codificanti sono presenti geni codificanti polipeptidi e geni codificanti RNA come rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, nonché RNA antisenso e micro-RNA, implicati nella regolazione dell'espressione genica. RNA genes Le sequenze codificanti RNA funzionali rappresentano il 5-10 % dei geni totali.  La Genetica La genetica è la scienza che studia i geni, l'ereditarietà e la variabilità genetica degli cromosomi. Il campo di studio della genetica si focalizza dunque sulla comprensione dei meccanismi alla base di questi fenomeni degli organismi, noti sin dall'antichità, assieme alla embriologia, ma non spiegati fino al XIX secolo. Grazie ai lavori pionieristici di Gregor Mendel, considerato per questo il padre della genetica. Gregor Mendel infatti per primo, pur non sapendo dell'esistenza dei cromosomi e della meiosi, attribuì ai "caratteri" ereditati in modo indipendente dai genitori, la proprietà di determinare il fenotipo dell'individuo.  La Genetica Le cellule somatiche sono le cellule che costituiscono il corpo di un organismo. Un insieme di cellule somatiche forma i vari tessuti che, in organismi complessi (l'uomo), vanno a costituire organi e a loro volta apparati (insieme di organi). Le cellule somatiche possono essere caratterizzate anche in base al numero di cromosomi contenuti, che, nella stessa specie, è sempre doppio rispetto a quello delle cellule della linea germinale. Queste cellule servono per il fenomeno di mitosi.  Cellule sessuali Le cellule sessuali, che nell'uomo corrispondono alle cellule germinali. Le cellule sessuali o gamete parola che deriva dal greco γαμέτης vuol dire "marito" e γαμετή che vuol dire "moglie". I cromosomi attaccati tra loro si dividono in modo tale che in ogni cellula sessuale possa andare meta dei cromosomi di una cellula somatica, ma non è che in due cellule figlie si hanno 23 cromosomi diversi tra loro in entrambe. Ognuna mantiene 23 cromosomi fratelli dei 46 complessivi che si avevano. L'unico cromosoma che fa differenza e che è diverso nella cellula sessuale è proprio quello sessuale che sono X e Y. Queste cellule servono per il fenomeno di meiosi.  Gli acidi nucleici Gli acidi nucleici portano le informazioni nelle cellule. I due principali tipi di acidi nucleici sono: ✓ l’acido desossiribonucleico (DNA) ✓ e l’acido ribonucleico (RNA) Il DNA contiene l’informazione genetica, l’RNA invece contiene copie a breve termine del informazione stessa. L’RNA viene usato per dirigere la sintesi proteica durante il processo di espressione dei geni. Gli acidi nucleici sono polimeri formati da nucleotidi. Gli acidi nucleici sono lunghi polimeri di subunità ripetute chiamate nucleotidi. Ogni nucleotide consiste di tre componenti: 1. Un zucchero pentoso quindi un zucchero con cinque atomi di carbonio ; ribosio nell’RNA e deossiribosio nel DNA 2. Un gruppo fosfato (-PO4) 3. Una base azotata  Gli acidi nucleici Quando si forma un polimero di acido nucleico, il gruppo fosfato di un nucleotide lega il gruppo ossidrile dello zucchero pentoso di un altro nucleotide rilasciando acqua e formando un legame fosfodiesterico mediante una reazione di disidratazione. Un acido nucleico è semplicemente una catena di zuccheri a cinque atomi di carbonio legati insieme da legami fosfodiesterici con una base azotata che protrude da ogni zucchero. La catena di nucleotidi chiamata polinucleotidi possiede estremità differenti: un fosfato su un lato e sull’altro un gruppo –OH di un zucchero. Nitrogenous base Convenzionalmente si riferisce a queste due estremità come: 5’ (cinque primo, -PO4) e 3’ (tre primo, -OH).  Gli acidi nucleici Nei nucleotidi si possono trovare due tipi di base azotate: La prima tipologia è rappresentata dalle grandi molecole aromatiche a doppio anello, le purine, trovate sia nel DNA che nell’RNA; i due tipi di purine sono l’adenina (A) e la guanina (G). Il secondo tipo di basi azotate sono piccole molecole aromatiche a singolo anello, le pirimidine che includono la citosina (C) presente sia nel DNA che RNA, la timina (T) presente solo nel DNA e l’uracile (U) solo nell’RNA.  Gli acidi nucleici Le molecole del DNA sono formate da due catene avvolte tra di loro in una lunga molecola lineare negli eucarioti e in una molecola circolare nei procarioti. I due filamenti di un polimero di DNA girano gli uni intorno agli altri. Prende una forma a spirale ed è chiamata elica e questa è composta di due catene essa è chiamata doppia elica. Ogni scalino della scala a chiocciola del DNA è rappresentato da una coppia di basi azotate mediante legami idrogeno. La regola della coppia di basi azotate è rigida: ✓ La adenina può legarsi solo con la timina (nel DNA) e con l’uracile (nell’RNA). ✓ La citosina può appaiarsi solo con la guanina. Le basi che possono essere appaiate sono dette complementari le une alle altre. Il DNA è ulteriormente legato a delle proteine in modo da formare le strutture chiamate cromosomi.  Gli acidi nucleici L’RNA ha molti ruoli all’interno di una cellula. Le molecole di RNA contengono zuccheri di ribosio. Nelle molecole di RNA è presente l’uracile (U). La trascrizione del DNA produce l’RNA che solitamente e composto da una filamento unico. Il ruolo dell’RNA all’interno di una cellula e vario: Trasporta informazioni nella forma di RNA messaggero (mRNA). Fa parte dei ribosomi nella forma di RNA ribosomiale (rRNA). Trasporta amminoacidi nella forma di RNA transfer (tRNA). DNA and RNA a confronto  Nucleotidi Altri nucleotidi sono componenti vitali delle reazione energetiche. L’adenina è un componente chiave della molecola adenosina trifosfato (ATP) la molecola che fornisce energia. E’ utilizzato per guidare reazioni chimiche energeticamente sfavorite, per potenziare il trasporto attraverso le membrane e permettere il movimento della cellula. L’ATP contiene: ✓ L’adenina ✓ Un zucchero a cinque atomi di carbonio ✓ Tre gruppi fosfato  La divisione cellulare batterica I batteri si dividono replicandosi. La divisione cellulare sia nei batteri sia negli eucarioti porta alla formazione di due cellule con la stessa informazione genetica della cellula di partenza. Le parti essenziali del processo sono: 1. La duplicazione 2. La segregazione dell’informazione genetica nelle cellule figlie 3. Divisione degli organelli La divisione cellulare nei batteri avviene per scissione binaria. La maggior parte dei batteri hanno una singola molecola circolare di DNA molto compatto all’interno della cellula localizzato nel nucleoide. Il compattamento e l’organizzazione del nucleoide coinvolge una classe di proteine chiamate proteine per il mantenimento strutturale del cromosoma o proteine SMC. Sono proteine importanti nella compressione e coesione del DNA.  La divisione cellulare batterica Replicazione della molecola del DNA: 1 La replicazione del DNA inizia in un punto preciso chiamato origine di replicazione. Gli enzimi di replicazione si muovono in entrambi le direzioni attorno al DNA circolare fino ad un specifico sito di terminazione.  La divisione cellulare batterica Una volta che il DNA è replicato la cellula cresce tramite elongazione e la divisione avviene nella parte centrale della cellula. Inizia la formazione del setto e di una nuova membrana. Il setto si forma al centro della cellula una molecola proteica chiamata FtsZ facilita questo processo (punti arancioni). Più proteine FtsZ sono coinvolte nella formazione del setto. Questo processo viene definito separazione. La struttura della FtsZ ha mostrato un alto grado di affinità con la tubulina eucariotica. Quando il setto è completo la cellula si divide in due cellule figlie ciascuna contenente una molecola di DNA batterico.  I cromosomi eucariotici Le cellule umane ne hanno 46 cromosomi costituiti da 23 identiche coppie e ognuno di questi contiene centinaia di migliaia di geni. Monosomia è una condizione dove nell’embrione umano manca un solo cromosoma. Trisomia è una condizione dove un cromosoma e in più. I cromosomi sono composti da cromatina un complesso di DNA (40%) e proteine (60%). Una quantità significativa di RNA è inoltre associata ai cromosomi poiché questi stessi sono i siti di sintesi dell’RNA. Il DNA di un singolo cromosoma è molto lungo, e costituisce una fibra a doppio filamento che si estende senza interruzioni attraverso tutta la lunghezza del cromosoma. Un cromosoma umano contiene circa 140 milioni di nucleotidi nel suo DNA. Alcuni domini della cromatina chiamati eterocromatina non vengono espressi mentre altri domini della cromatina chiamati eucromatina sono espressi. Immagine dei cromosomi umani con un microscopio elettronico subito prima della divisione nucleare.  La struttura dei cromosomi I cromosomi hanno la forma di un bastoncino ma duplicati assumono la forma di un X. Ogni 200 nucleotidi del doppio filamento del DNA (duplex) viene avvolto attorno ad core di otto proteine istoniche. Gli istoni hanno una carica positiva e di conseguenza sono fortemente attratti dai gruppi fosfato carichi negativamente Fotografia al microscopio elettronico a trasmissione dei del DNA e promuove l’avvolgimento del DNA. nucleosomi derivanti da un nucleo Il complesso del DNA e proteine istoniche viene chiamato di una cellula nucleosoma. DNA doppia elica Nucleosoma (duplex) Nel nucleosoma sono presenti 2 molecole di ciascuno dei 4 istoni diversi (H2A, H2B, H3 e H4) mentre la quinta molecola di istone H1 si lega in prossimità della perla prende parte al successivo livello di impacchettamento del DNA.  La struttura dei cromosomi Avvolgimenti successivi avvengono quando il nucleosoma si organizza in avvolgimenti successivi chiamati solenoidi con l’aiuto del H1 e forma una fibra di cromatina di 30 nm. La fibra di cromatina di 30 nm forma a sua volta delle anse chiamate domini ad ansa con l’aiuto di proteine non istoniche che fungono da impalcatura (scaffold) e successivi avvolgimenti radiali attorno all’impalcatura proteica formano una struttura a rosetta. I domini di ansa si avvolgono e si ripiegano ulteriormente grazie ad un complesso di proteine dette condensine fino a formare il caratteristico cromosoma.  I cariotipi I cromosomi variano; in dimensione, localizzazione del centromero (un restringimento presente in tutti i cromosomi), lunghezza relativa delle due braccia in entrambi i lati rispetto al centromero e le posizione delle regioni ristrette lungo le braccia. Il particolare insieme di cromosomi di ogni individuo viene chiamato cariotipo. Immagine di un Una cellulache contiene due cariotipo umano cromosomi di ogni tipo è diploide: le cellule somatiche sono diploidi. I due cromosomi omologhi contengono i geni che controllano gli stessi caratteri ereditari nella stesa posizione o detta locus. Una cellula in cui è presente un cromosoma per ogni coppia è detta aploide: i gameti sono aploidi.  I cromosomi Prima di replicarsi ogni cromosoma è costituito da una singola molecola di DNA. Dopo la replicazione ogni cromosoma è composto da due molecole di DNA identiche legate assieme da un complesso di proteine chiamate coesine. Ogni cromosoma è costituito da due filamenti uniti insieme a livello del centromero quindi un cromosoma è costituito da due cromatidi fratelli. I cromosomi omologhi sono le coppie paterne e materne dello stesso cromosoma per esempio del cromosoma 16. I cromatidi sono fratelli e sono le due repliche di un singolo cromosoma tenuti assieme al loro centromero da proteine coesine dopo la replicazione del DNA. Il cinetocore è composto da proteine trovate al livello del centromero che si attaccano ai microtubuli durante la mitosi.  Ciclo cellulare degli eucarioti Il ciclo cellulare è una serie ordinata di eventi che portano alla divisione cellulare. Il ciclo cellulare si divide in cinque fasi: G1 (fase gap 1): è la fase primaria di crescita della cellula e la preparazione alla sintesi del DNA. S (sintesi): è la fase in cui la cellula copia il proprio genoma. G2 (fase gap 2): è la seconda fase di crescita di preparazione per la separazione del genoma neo- replicato. Durante questa fase i microtubuli iniziano ad assemblarsi a formare il fuso. La Mitosi (fase M): è la fase del ciclo cellulare in cui l’apparato del fuso si assembla, si lega ai cromosomi e separa i cromatidi fratelli. La mitosi è il passaggio fondamentale della separazione dei due genomi figli. E’ suddivisa in cinque fasi: profase, prometafase, metafase, anafase e telofase. La citodieresi o citochinesi: è la fase del ciclo cellulare in cui il citoplasma si divide, generando due cellule figlie. Nelle cellule il fuso mitotico agisce posizionando l’anello contratile di actina e costringe la cellula a dividersi. Nelle cellule vegetali che hanno la parete si forma una piastra tra le cellule.  Il centromero dei cromosomi Queste proteine formano una struttura simile ad un disco chiamata cinetocore. Questo disco funge da sito di attacco per i microtubuli necessari per separare i cromosomi durante la divisione cellulare. I due fratelli cromatidi sono tenuti insieme dalle coesine a livello del centromero e ogni cromatidio ha il suo cinetocore. Durante la fase G1 e G2 vengono prodotte proteine e organelli cellulari. Durante la fase G2 il DNA viene maggiormente avvolto.  Ciclo cellulare degli eucarioti L’interfase (G1, S, G2) Proteine motrici sono coinvolte alla condensazione finale dei cromosomi. Durante la fase G2 le cellule iniziano ad assemblare il macchinario usato successivamente nella mitosi. La rete normale di microtubuli del citoscheletro inizia a disassemblarsi. Nelle cellule animali un coppia dei centri di organizzativi del microtubulo chiamati centrioli si replicano producendone uno per ciascun polo. Tutte le cellule vanno incontro ad una intesa sintesi di tubulina, proteina che costituisce i microtubuli.  Ciclo cellulare degli eucarioti La fase M: Profase Durante la profase i cromosomi condensano e diventano visibili e sembrano dei filamenti sottili e appaiono abbastanza ingombranti. Inizia l’assemblaggio del fuso mitotico. Le due coppie di centrioli iniziano ad allontanarsi fra di loro formando un asse di microtubuli chiamate fibre del fuso mitotico. Quando i centriolo sono arrivati nei poli opposti hanno stabilizzato un ponte di microtubuli chiamato apparato del fuso tra loro. Nelle cellule vegetali si forma un ponte di fibre microtubulari anche se i centrioli sono assenti. Durante la mitosi i centrioli estendono una rete di microtubuli verso la membrana plasmatica questo arrangiamento si chiama aster serve per la retrazione del fuso. Le cellule vegetali non formano gli astri dovuta alla loro parete rigida. La membrana nucleare durante la formazione del fuso si rompe e i suoi componenti vengono riassorbiti dal reticolo endoplasmatico.  Ciclo cellulare degli eucarioti La fase M: Prometafase Durante la prometafase i cromosomi condensati si legano al fuso tramite il loro cinetocoro. Ciascun cromosoma contiene due cinetocori legato alla regione centromerica di ogni cromatidio fratello. Durante la prometafase un gruppo di microtubuli aggancia i cinetocori di ogni gruppo di cromatidi fratelli. Questo processo è importante per la separazione dei cromatidi. I cromosomi si muovono in prossimità dell'equatore della cellula.  Ciclo cellulare degli eucarioti La fase M: Metafase Durante la metafase i cromosomi si allineano lungo una immaginaria linea mediana (piastra metafasica) lungo il piano centrale della cellula. La piastra metafasica indica il futuro asse di divisione cellulare.  Ciclo cellulare degli eucarioti La fase M: Anafase Le proteine chiamate coesine che tengono uniti i cromatidi vengono rimose. I cromatidi fratelli sono spinti verso i poli opposti a cui i loro cinetocori sono legati. I movimenti sono guidati dai microtubuli. Si osservano due tipi di movimenti chiamati anafase A e anafase B. ✓ Durante l’anafase A i cinetocori vengono tirati ai poli opposti grazie all’accorciamento dei microtubuli a cui sono connessi. ✓ Durante l’anafase B i poli si allontanano dal centro della cellula e si osserva una struttura allungata.  Ciclo cellulare degli eucarioti La fase M: Telofase L’apparato del fuso si dissasembla e i microtubuli vengono scissi in monomeri di tubulina e verranno utilizzati per costruire il citoscheletro delle cellule figlie. Intorno ai cromosomi si forma il nuovo involucro nucleare. I cromosomi si disavvolgono per consentire l’espressione genica. I primi geni espressi sono quelli dei geni del rRNA che si manifesta con la comparsa del nucleolo. Gli organelli mitocondri o cloroplasti sono distribuiti nelle due future cellule.  Ciclo cellulare degli eucarioti La fase in cui la cellula si divide viene chiamata citodieresi o citochinesi. La cellula si divide in due metà pressoché uguali. La citodieresi è mediata da una cintura costrittiva di filamenti di actina. Quando questi filamenti scorrono uno sull’altro, il diametro di questo anello diminuisce stringendo la cellula e creando un solco di segmentazione attorno sua circonferenza e procede e la cellula si divide in due.  Il controllo del ciclo cellulare negli eucarioti unicellulari La scoperta delle cicline: Durante la divisione precoce degli embrioni di riccio di mare si è visto un incremento di espressione di alcune proteine e venero chiamate cicline. Si conoscono due forme di cicline che raggiungono i picchi della loro espressione nelle fasi di congiunzione G1/S e G2/M. La chinasi ciclina-dipendente (Cdk) 2 è una proteina chinasi che è attiva solo se scomplessata con una ciclina. Queste Cdk sono i fattori chiave che guidano il ciclo di divisione cellulare.  Il controllo del ciclo cellulare Le cellule controllano solo tre punti del ciclo cellulare che sono detti punti di controllo (checkpoints): G1/S, G2/M e la tarda metafase. Il punto di controllo G1/S: il primo punto dove la cellula "decide" se dividersi o no. Questo punto viene influenzato da segnali esterni come i fattori di crescita. Viene chiamato punto di restrizione (punto R) negli animali nei lieviti è chiamato START. Un danno nel DNA può bloccare il ciclo cellulare in questo punto, come una condizione di digiuno o assenza di fattori di crescita. Il punto di controllo G2/M: questo punto valuta l'avvenuta replicazione del DNA e può interrompere il ciclo nel caso il DNA non sia stato accuratamente replicato. Le proteine Cdk sono responsabili di questo controllo. Il punto di controllo del fuso; transizione tra metafase e anafase: controlla che tutti i cromosomi siano legati al fuso in preparazione per l'anafase. Controlla quindi che i cromosomi prima della separazione durante l'anafase siano arrangiati correttamente alla piastra metafasica.  Il controllo del ciclo cellulare Le chinasi cicline dipendenti (Cdk) Il meccanismo molecolare del controllo del ciclo cellulare è la fosforilazione che avviene da un'aggiunta di un gruppo fosfato agli amminoacidi serina, treonina e tirosina delle proteine. Gli enzimi che effettuano questa fosforilazione sono le Cdk. La prima e chiamata Cdc2 (lievito) adesso viene chiamata Cdk1. Le chinasi cicline dipendenti (Cdk) sono delle Non attivata proteine che guidano il ciclo cellulare, è un enzima (proteina) che dopo fosforilazione di un sito si attiva mentre la fosforilazione di un altro sito la inattiva. Le cicline sono proteine regolatrici che servono per attivare la Cdk. Il complesso Cdk/cicline è anche chiamato fattore che promuove la mitosi (MPF). Attivata  Il controllo del ciclo cellulare Il complesso che promuove l'anafase La presenza di tutti i cromosomi sulla piastra metafasica e la tensione su i microtubuli tra i poli opposti sono due fattori importanti è questo segnale viene trasmesso attraverso il complesso che promuove l'anafase chiamato anche ciclosoma (APC/C). La funzione dell'APC/C è di innescare l'anafase stessa controllando la distruzione delle coesine tramite la sua azione su altre proteine (proteasi). Responsabili della distruzione delle coesine. Svolge un ruolo importante nella distruzione delle cicline mitotiche per guidare la cellula fuori dalla mitosi.  Il controllo del ciclo cellulare negli eucarioti multicellulari Abbiamo la partecipazione di una quantità di maggiore di Cdk e cicline che controllano il ciclo cellulare. I fattori di crescita agiscono attivando i sistemi di segnalazione intracellulari (NGF, EGF). Specifici recettori superficiale di membrana riconoscono i fattori di crescita e inducono l'attivazione di fattori chiamati fattori di promozione della fase M (MAP) che sono delle MAP chinasiche. Questi fattori stimolano la produzione di cicline G1 e delle proteine per la progressione del ciclo cellulare.  Il controllo del ciclo cellulare Le cicline G1/S attivano le Cdk alla fine di G1 e aiutano ad innescare la progressione attraverso Start portando all'impegno a entrare nel ciclo cellulare. Le cicline S legano Cdk subito dopo il passaggio attraverso Start e aiutano a stimolare la duplicazione dei cromosomi. Le cicline S restano a livelli alti fino alla mitosi. Le cicline M attivano Cdk che stimolano l'ingresso in mitosi in corrispondenza del punto di controllo G2/M. Il livello della ciclina M crolla dopo lo stadio centrale della fase M.  Il controllo del ciclo cellulare Il cancro è la mancanza del controllo del ciclo cellulare Il gene p53 ha un ruolo chiave nel punto di controllo G1 della divisione cellulare. Il prodotto del gene p53 è la proteina p53 monitora l’integrità dl DNA assicurandosi che non sia danneggiato. Se la proteina p53 rileva un danno al DNA arresta la divisione e richiama enzimi per la riparazione. Nel caso il danno sia irreversibile dirige la cellula verso la morte.  Il cancro è la mancanza del controllo del ciclo cellulare Il logene p53 previene lo sviluppo di cellule mutate per questo motivo viene considerato un gene oncosoppressore. Studi hanno dimostrato che nelle cellule tumorali contengono un gene p53 assente o danneggiato. Una volta che il p53 non è funzionante le cellule cancerogene sono capaci di andare incontro ad una ripetuta ed incontrollata divisione cellulare e quindi senza essere fermate nel punto di controllo G1.  Il cancro è la mancanza del controllo del ciclo cellulare I proto-oncogeni I ricercatori hanno identificato numerosi oncogeni, geni che quando vengono introdotti nella cellula la trasformano in cellula tumorale. Questa identificazione ha portato alla identificazione dei proto-oncogeni che sono dei geni cellulari che diventano oncogeni quando mutati. L'azione dei proto-oncogeni è spesso legata alla segnalazione ad opera di fattori di crescita e la loro mutazione può portare alla perdita di controllo della divisione cellulare. Alcuni di loro, proto-oncogeni, codificano per recettori di fattori di crescita e altri che codificano per proteine coinvolte nella trasduzione del segnale. Se un recettore di un fattore di crescita diviene mutato in modo tale che sia permanentemente attivo la cellula non viene più dipendente dalla presenza del fattore di crescita e quindi continua dividersi.  Il cancro è la mancanza del controllo del ciclo cellulare I geni oncosoppressori: dopo il p53 abbiamo il gene della suscettibilità al retinoblastoma (Rb). Rb è una forma di cancro molto rara che colpisce la retina degli occhi. La mutazione viene trasmessa come mutazione dominante. Il ruolo della proteina RB nel ciclo cellulare è l'integrazione di segnali provenienti da fattori di crescita. La Rb viene fosforilata da Cdck è una volta fosforilata causa il rilascio di proteine regolatori e la produzione di cicline della fase S e quindi alla continua stimolazione della divisione cellulare. Le proteine chiave associate ai tumori umani.  Riproduzione sessuata e Meiosi Il punto fondamentale che sta alla base della riproduzione sessuata è il contributo genetico di due diverse cellule. Le cellule che andranno incontro a meiosi per produrre i gameti si differenziano dalle cellule somatiche , queste cellule prendono il nome di cellule della linea germinale. Le cellule della linea germinale che produrranno i gameti andranno incontro a meiosi per produrre gameti (ovuli e spermatozoi) con assetto cromosomico aploide. La meiosi degli organismi diploidi consiste in due passaggi di divisione chiamati meiosi I e meiosi II ciascuno dei quali è suddiviso in quattro altri stadi chiamati profase, metafase, anafase e telofase. Quando due gameti si fondono (fecondazione ) si forma una cellula con due coppie di ciascun cromosoma chiamato zigote. Il tipo di riproduzione che alterna meiosi e fecondazione è chiamato riproduzione sessuata. Questa porta la progenie a ereditare i cromosomi dei due genitori.  Riproduzione sessuata e Meiosi La meiosi e un meccanismo di riduzione del numero di cromosomi Negli animali il singolo zigote diploide va incontro a mitosi per dare origine a cellule diploidi.  Caratteristiche della meiosi Durante le fasi precoci della profase I della meiosi i cromosomi omologhi si trovano l’un l’altro e si associano questo processo è chiamato appaiamento dei cromosomi omologhi o sinapsi. Quando sono appiatti formano una struttura molto complessa chiamata complesso sinaptonemico. I cromosomi sono appaiati mediante un reticolo proteico una isoforma della coesina. Tutti e quattro i cromatidi sono strettamente associati. Questa struttura viene chiamata tetrade o bivalente.  Caratteristiche della meiosi Ricombinazione genica Durante la profase I mentre i cromosomi omologhi sono appaiati interviene un altro processo la ricombinazione genetica o crossing over. Questo processo permette ai cromosomi di scambiarsi materiale genetico. I siti dove avviene il crossing over sono chiamati chiasmi. I chiasmi tengono i cromosomi omologhi uniti assieme. I bivalenti vengono catturati dal fuso e gli muovono verso il centro della (zona equatoriale) cellula dove si allineano sotto formo di omologhi appaiati (piastra metafasica). L’orientamento di ciascuna coppia sull‘asse del fuso e casuale.  Meiosi I DNA è stato I cromosomi I microtubuli I cromosomi replicato omologhi si si accorciano omologhi separati I cromosomi allineano Tirano ai poli i formano un condensano I cromosomi sono cromosomi gruppo a ciascun Si forma il fuso di tenuti dai chiasmi omologhi polo microtubuli Un cinetocoro si si separano le Si riforma il nucleo Crossing over attacca al coppie di Citochinesi Si formano i cromosoma cromosomi I cromatidi fratelli chiasmi omologo omologhi non sono identici  Meiosi II Interfase breve I cromosomi sono I microtubuli Si riforma la senza fase S costituiti da i cromatidi si accorciano membrana Si forma un nuovo fratelli I centromeri nucleare fuso meiotico Allineamento dei sono scissi Citochinesi Si rompe la cromosomi nella I cromatidi Si formano 4 membrana piastra di metafase fratelli cellule nucleare ogni cromatide fratello vengono tirati ha il suo cinetocoro ai poli  Necrosi Per necrosi si intende la morte cellulare accidentale, che coinvolge contemporaneamente gruppi più o meno estesi di cellule, facenti parte di un tessuto o di un organo. Le cause sono di vario tipo: ipertermia, sostanze chimiche (veleni o tossine), traumi, mancanza di ossigeno, carenze di nutrienti ecc. La necrosi rappresenta sempre l'evoluzione irreversibile di un danno cellulare ed è invariabilmente dannosa all'organismo. Questo processo solitamente porta all’innesco di un processo infiammatorio. In una cellula che va incontro a necrosi accade: ✓ La sintesi di ATP mitocondriale si arresta. ✓ Le pompe di membrana ATP dipendenti si bloccano. ✓ Entra sodio e acqua nella cellula. ✓ La cellula e gli organelli si gonfiano. ✓ La cellula avvia la risposta heat shock con la produzione delle proteine heat shock proteins che cercano di contrastare la denaturazione delle proteine.  Apoptosi L'apoptosi e il processo di morte cellulare programmata. L'apoptosi è un processo attivo durante il quale la cellula stessa accende uno specifico programma che ne determina la morte, una sorta di suicidio. Gli enzimi litici digeriscono proteine ed acidi nucleici all'internodella cellula i prodotti della digestione vengono impacchettati in vescicole chiamate corpi apoptotici. Una volta liberati i corpi apoptotici vengono riconosciuti e fagocitati dai macrofagi che ne ricicleranno i costituenti. L’apoptosi interviene in diversi importanti processi fisiologici quali lo sviluppo embrionale, che spesso produce cellule in sovranumero da eliminare; oppure in tessuti altamente proliferanti, per mantenerne costanti le dimensioni dell’organo; infine per eliminare cellule potenzialmente pericolose.  Le caratteristiche di base della replicazione del DNA Il modello della doppia elica del DNA di Watson e Crick suggerì che la base per copiare l'informazione genetica doveva essere la complementarietà. Una catena del DNA può avere una qualsiasi sequenza, ma questa determina la sequenza dell'altra elica nella doppia elica. Sono possibili tre modelli di replicazione del DNA: Nel modello conservativo si produce una molecola di DNA complementare nuova e ne conserva una vecchia. Nel modello dispersivo si producono molecole di DNA ibride di filamenti parentali e di nuove molecole. Nel modello semiconservativo della replicazione del DNA un filamento della doppia elica parentale rimane intanto nella doppia elica (semiconservativo) e un nuovo filamento viene sintetizzato per ogni filamento parentale costituito da nuove molecole. La doppia elica figlia dovrebbe consistere di un filamento parentale e di un filamento parentale costituito da nuove molecole.  L'esperimento di Meselson e Stahl 1958 Viene utilizzato del azoto radioattivo 15N quindi ha una densità superiore rispetto l'isotopo normale 14N. Utilizzando una ultracentrifuga si possono separare molecole di densità diversa. ✓ I batteri vengono coltivati in un mezzo contenente 15N che inserisce nel suo DNA. ✓ Dopo alcune generazioni il DNA di questi batteri risulta essere più denso di quello dei batteri cresciuti nel 14N. ✓ Successivamente i batteri 15N vengono spostati in un terreno con 14N e raccolto il DNA a vari tempi. ✓ Il DNA viene poi sciolto in una soluzione che contiene un sale pesante di cloruro di cesio.  L'esperimento di Meselson e Stahl 1958 ✓ Ultracentrifugato si forma un gradiente di densità dovuto al cloruro di cesio e quindi di densità. ✓ Il DNA migrerà in base al gradiente di densità dovuto al cloruro di cesio. ✓ I batteri subito dopo trasferiti nel terreno che contiene 14N erano di una densità uguale a quella che conteneva solo 15N. ✓ Dopo un primo ciclo di replicazione del DNA, la densità del DNA batterico era scesa a un valore intermedio tra quello del DNA contenete 15N e quello che contiene 14N. ✓ Dopo un secondo ciclo sono state osservate due classi di DNA di densità diversa una intermedia ed una uguale a quella del DNA 14N.  Le caratteristiche di base della replicazione del DNA La replicazione del DNA richiede tre cose: ✓ qualcosa da copiare ✓ qualcosa che sia in grado di fare la copia ✓ le unità di costruzione per fare la copia Quindi servono tre cose: ❖ Le molecole di DNA parentale che servono da stampo ❖ gli enzimi che eseguono la coppia del modello ❖ e gli elementi costitutivi che sono i nucleosidi trifosfato. Nel processo della replicazione del DNA ci sono tre passaggi fondamentali: ▪ Inizio ▪ Allungamento ▪ Terminazione  Le caratteristiche di base della replicazione del DNA Un certo numero di enzimi devono lavorare insieme per realizzare l'assemblamento di un nuovo filamento, ma l'enzima che unisce le basi del DNA esistente con i nucleotidi complementari e che quindi collega i nucleotidi insieme per sintetizzare il nuovo filamento è la DNA polimerasi. DNA polimerasi: caratteristiche in comune ❖ Le DNA polimerasi aggiunge nucleotidi all'estremità 3' di un filamento in crescita. Cioè esse sintetizzano in direzione 5'-3'. ❖ Il nucleotide che si incorpora dipende dalla base che si trova nel filamento stampo. ❖ Ogni nuova base deve essere complementare alla base del filamento stampo. ❖ Con l'aggiunta di ogni nuovo nucleotide trifosfato due dei suoi fosfati sono tagliati ed escono fuori come pirofosfati.  Le caratteristiche di base della replicazione del DNA Tutte le DNA polimerasi richiedono un innesco per iniziare la sintesi non possono iniziare la sintesi senza un filamento di RNA o DNA associato al filamento stampo. Le RNA polimerasi non richiedono questo requisito di solito sintetizzano esse stesse l'innesco.  La replicazione nei procarioti La replicazione del DNA nei procarioti inizia da una sola origine. La replicazione si avvia a partire da un sito specifico, l'origine chiamata oriC e termina in un sito specifico, sito di terminazione. La sequenza di oriC è composta di nucleotidi ripetuti che legano una proteina iniziatrice e una sequenza ricca in AT che può essere aperto facilmente durante l'inizio della replicazione. La replicazione procede bidirezionalmente dal sito unico di origine fino al sito unico di terminazione. Il DNA controllato da un origine viene chiamato replicone. In questo caso il cromosoma più l'origine forma un singolo replicone. Batterio E. coli come modello. Replication is bidirectional from a unique origin. Replication initiates from a unique origin. Two separate replisomes are loaded onto the origin and initiate synthesis in the opposite directions on the chromosome. These two replisomes continue in opposite directions until they come to a unique termination site.  La replicazione nei procarioti DNA polimerasi si riferisce ad un gruppo di enzimi responsabile della sintesi di un nuovo filamento di DNA dal filamento stampo. In E. coli sono state identificate tre DNA polimerasi: ✓ DNA polimerasi I (Pol I) agisce sul filamento in ritardo per rimuovere gli innesco e li sostituisce con DNA. ✓ DNA polimerasi II (Pol II) è coinvolta nei processi di riparazione del DNA. ✓ DNA polimerasi III (Pol III) enzima principale della replicazione è responsabile della maggior parte della sintesi del DNA. ✓ Tutte e tre questi enzimi sintetizzano filamenti polinucleotidici solo in direzione 5'-3' e richiedono un innesco. Ci sono alcune polimerasi che possono rimuovere nucleotidi quindi agire da nucleasi. Gli enzimi che tagliano internamente il DNA sono chiamate endonucleasi. Gli enzimi che tagliano nucleotidi alla fine del DNA sono chiamate esonucleasi. Le tre DNA polimerasi hanno anche un'attività esonucleasica in direzione 3'-5', che serve come una funzione delle correzioni delle bozze perché permette all'enzima di "fare un passo indietro" e rimuovere una base appaiata in maniera non corretta. La DNA Pol I ha anche attività esonucleasica 5'-3‘.  La replicazione nei procarioti - Svolgimento del DNA Un enzima con attività di apertura della doppia elica del DNA è chiamato elicasi. Tale processo richiede energia sotto forma di ATP è può svolgere progressivamente il DNA, formando filamenti singoli. Tali filamenti singoli non sono stabili perché le basi azotate idrofobiche sono esposte all'acqua. Un'altra proteina lega il DNA a singolo filamento chiamata SSB: single-strand-binding detta anche proteina che lega DNA a singolo filamento. L'allentamento dei due filamenti provoca tensione torsionale nella molecola del DNA questo e chiamato superavvolgimento viene anche descritto come lo stato topologico.  La replicazione nei procarioti - Svolgimento del DNA Gli enzimi che possono alterare lo stato topologico del DNA sono chiamati topoisomerasi. Le topoisomerasi agiscono allo scopo di allievare la tensione torsionale e cosi previene il superavvolgimento. La DNA girasi è la topoisomerasi coinvolta nella replicazione del DNA.  La replicazione nei procarioti La necessità della presenza di un innesco affinché la DNA polimerasi possa sintetizzare il DNA significa che deve essere aggiunto un innesco quando la elica si pare. Un filamento può essere sintetizzato in modo continuo con un innesco iniziale, mentre l'altro filamento deve essere sintetizzato in modo discontinuo con più eventi di innesco e si formano brevi tratti di DNA che vengono poi uniti gli uni agli altri. Il filamento che è continuo è chiamato filamento leader (leading strand). Il filamento che è discontinuo è il filamento in ritardo (lagging strand). I frammenti di DNA sintetizzati sul filamento in ritardo vengono chiamati frammenti di Okazaki.  La replicazione nei procarioti L'apertura parziale di un elica di DNA per formare due filamenti singoli ha una forma biforcuta ed è quindi chiamata la forcella di replicazione. Gli inneschi sono sintetizzati dall'enzima DNA primasi. Questo enzima è una RNA polimerasi che sintetizza brevi tratti di RNA 10-20 bp (paia di basi) di lunghezza che funzionano come inneschi per la DNA polimerasi. Sintesi del filamento leader Richiede un unico innesco è poi il filamento può essere sintetizzato per tutta la lunghezza con l'azione della DNA Pol III. La capacità di una polimerasi di rimanere attaccata al filamento stampo si chiama processività dell'enzima. La DNA Pol III è formata da tante subunità. La subunità β (pinza β) è costituita da due catene che si uniscono per formare un cerchio. Questo cerchio si attacca nel filamento stampo come una pinza per tenere l'enzima DNA Pol III sul DNA. Questa struttura è indicata come "pinza scorrevole". Perché la "pinza scorrevole" funzioni deve essere aperta e poi chiusa intorno al DNA. Una proteina costituita da più subunità chiamata "caricatore della pinza" esegue questo compito. Questa funzione è presente anche negli eucarioti.  Sintesi del filamento in ritardo La replicazione del filamento in ritardo è discontinua sono necessari più passaggi per replicare questo filamento. La primasi è necessaria per sintetizzare gli inneschi per ogni filamento di Okazaki che poi successivamente questi inneschi verranno sostituiti da DNA, e alla fine uniti tra loro. I frammenti di Okazaki sono sintetizzati dalla DNA Pol III. Gli inneschi sono eliminati e rimpiazzati con DNA dalla DNA Pol I. La DNA Pol I con la sua attività di esonucleasi 5’-3’ rimuove gli inneschi e gli sostituisce con DNA con la sua attività polimerasica 5’-3’. Lascia solo un ultimo legame da formare una volta che la sintesi da parte della DNA Poli I termina. Questo legame viene formato dalla DNA ligasi. Sintesi del filamento in ritardo  Terminazione della replicazione La terminazione avviene in un sito specifico opposto al sito OriC sul cromosoma circolare. Le ultime fasi della replicazione portano alla produzione di due molecole figlie che si intrecciano come due anelli di una catena. Queste molecole vengono scollegate dallo stesso enzima che allevia la tensione torsionale a livello della forca la DNA girasi.  Il replisoma Gli enzimi coinvolti nella replicazione del DNA formano un gruppo macromolecolare chiamato replisoma. Questo assemblaggio di macromolecole può essere pensato come l’organulo di replica. Il replisoma ha due componenti principali: ✓ Un complesso di due enzimi di DNA Pol III, uno per ciascuna sezione. ✓ Il primosoma è composto da primasi ed elicasi.  Sintesi del DNA da parte del replisoma L’intero complesso del replisoma è tenuto insieme da una serie di proteine che comprendono il "caricatore della pinza" (clamp loader). Una volta finito un frammento di Okazaki il caricatore della pinza carica una subunità β in un altro innesco e trasferisce la Pol III nella nuova subunità β. Sintesi del DNA da parte del replisoma  La replicazione negli eucarioti La replicazione del DNA è uguale a quella dei procarioti tranne per alcuni aspetti. Ci sono molteplici origini di replicazione di ogni cromosoma con conseguente formazione di repliconi multipli. Le origini non sono una sequenza semplice ma dipende dalla struttura della cromatina e dalla sequenza. La primasi è un complesso costituito sia di una RNA polimerasi che da una DNA polimerasi. Sintetizza gli RNA innesco ed estende questi inneschi con il DNA per produrre l’innesco finale. Replicazione del DNA: procarioti vs eucarioti  La replicazione negli eucarioti La DNA polimerasi è un complesso di due enzimi diversi che lavorano insieme. Uno si chiama DNA polimerasi epsilon (pol ε) e l’altra DNA polimerasi delta (pol δ). La subunità a pinza scorrevole che consente al complesso di rimanere attaccato al filamento stampo si chiama PCNA (antigene nucleare della proliferazione cellulare). La subunità "caricatore della pinza" chiamata Complesso di Protezione della Forcella (FPC; Fork Protection Complex) e simile a quella dei procarioti ma contiene anche altre proteine come il Caricatore a pinza con fattore di replica C (FRCF; Replication Factor C clamp loader) insieme ad altre proteine.  La replicazione negli eucarioti Le strutture specializzate alle estremità dei cromosomi eucariotici vengono chiamate telomeri. I telomeri sono composti da 6 nucleotidi di 5'-TTAGGG-3', ripetuti per una lunghezza che va da 3 a 20 kilobasi. Queste strutture proteggono le estremità dei cromosomi dalle nucleasi e mantengono l’integrità dei cromosomi lineari. I telomeri sono formati da un enzima chiamato telomerasi che utilizza un filamento di RNA interno come stampo per la replicazione e non il DNA stesso. I telomeri sono estesi dall'enzima telomerasi, agisce come una retrotrascrittasi inversa.  La replicazione negli eucarioti I telomeri Un ulteriore estensione dell'estremità 3' del filamento principale fornisce il modello necessario per la DNA polimerasi per completare la sintesi del filamento in lagging (in ritardo) a partire da ulteriori primers. Questo meccanismo lascia comunque a livello del telomero un filamento sporgente all'estremità 3'.  La replicazione negli eucarioti I telomeri Alla fine di un cromosoma il singolo filamento serve per formare un loop, producendo una struttura a tripla elica simile al D-loop che viene stabilizzata da atre proteine che agiscono alla fine dei telomeri. Il premio Nobel 2009 per la medicina è andato a tre ricercatori statunitensi, Elizabeth H. Blackburn, Carol W. Greider e Jack W. Szostak per la scoperta dei telomeri e la loro azione.  Riparazione del DNA "Correzione delle bozze/Proofreading" Una inserzione incorretta di un nucleotide può essere riconosciuto e rimosso e sostituito con il corretto nucleotide tramite una reazione energeticamente favorevole. La correzione avviene grazie alla attività esonucleasica delle DNA polimerasi che toglie base non corretta.  Riparazione del DNA "Mismatch repair /riparazione delle anomalie di appaiamento! Errori che non vengono corretti durante la "correzione delle bozze" ma che rimangono dopo che il nuovo filamento è stato creato vengono corretti da parte di un altro gruppo di proteine. Il DNA viene analizzato per la presenza di distorsioni strutturali nella sua elica. Come possono sapere quale base è quella corretta da inserire? Il DNA una volta duplicato subisce dei cambiamenti chimici. Nei procarioti alcune A vengono metilate nella sequenza GATC (aggiunta di un gruppo –CH3). Subito dopo la duplicazione il filamento neoformato che contiene l'errore non è ancora metilato ed è quindi riconoscibile dal meccanismo di riparazione.  Riparazione del DNA "Fotoriparazione" Fotoriparazione: un meccanismo di riparazione specifica. La fotoriparazione e specifica per danni prodotti da reazioni fotochimiche del DNA e dalla luce UV. Il fotoprodotto coinvolge due T (timine) adiacenti che vengono legate assieme in modo covalente formando un dimero di timina. Questi dimeri possono essere riparati da un enzima chiamato fotoliasi. Questo enzima utilizza l’energia della luce visibile per tagliare il dimero e ripristinare il danno.  Riparazione del DNA "Riparazione per escissione" Riparazione per escissione: un meccanismo di riparazione non specifico. Una regione danneggiata viene rimosa o asportare e viene sostituita da sintesi di nuovo DNA. La riparazione per escissione segue tre fasi: 1. Riconoscimento del danno. 2. La rimozione della regione danneggiata. 3. Nuova sintesi di DNA. Il riconoscimento e la escissione vengono eseguiti dal complesso urvABC. Nella fase di sintesi la DNA pol I o pol II sostituisce il DNA danneggiato.  Amplificazione del DNA mediante la Reazione a Catena della Polimerasi Polymerase Chain Reaction (PCR) Introdotta da Kary B. Mullis alla metà degli anni ‘80 ha rivoluzionato la genetica molecolare. La PCR mima il processo di replicazione del DNA. Processo di Amplificazione del DNA. Si può scegliere l'esatta sequenza di DNA da amplificare. Cosa serve per fare la PCR? ❖ Primer: due sequenze complementari alle due estremità della sequenza che vogliamo amplificare lunghe 20-25 nucleotidi. ❖ La DNA polimerasi che dopo i primer continua la replicazione per produrre i due filamenti complementari. ❖ Nucleotidi. ❖ Questo processo viene ripetuto più volte ottenendo un numero esponenziale di molecole di DNA.  Polymerase Chain Reaction (PCR) La reazione della PCR mima la replicazione del DNA che viene ripetuta ciclicamente attraverso una serie di passaggi: 1. Denaturazione: si usa il calore per separare i filamenti della doppia elica del DNA 2. Ibridazione dei primer (annealing): i primer forniscono il Ciclo gruppo 3'-OH necessario per l'allungamento da parte della DNA polimerasi. 3. Sintesi: la DNA polimerasi sintetizza nuovo DNA. La PCR è la base di molte tecniche di sequenziamento genico  Le tre principali fasi della PCR Denaturazione del DNA (Melting): il DNA viene scaldato a 94°C e i due filamenti del DNA vengono separati, questa temperatura viene chiamata "Temperatura di Melting". Ibridazione (Annealing): I primers (forward e reverse) si appaiono (si ibridano) alla sequenza scelta in base alla complementarità. Questo processo avviene a temperatura più bassa quindi intorno ai 40-65°C si chiama "Temperatura di Annealing". I primers sono lunghi intorno ai 20 nucleotidi. La temperatura di annealing dipende da quanto ricchi sono i primers di CG e di AT. Allungamento (Extension): la Taq polimerasi (Thermus aquaticus) aggiunge i nucleotidi (desossinucleotidi trifosfati) dopo i primers. Questo processo avviene ad una temperatura intorno i 68 e 72 °C detta "Temperatura di Extension".  Polymerase Chain Reaction (PCR) Se vengono ripetuti questi passaggi si sintetizzano nuove molecole del DNA: 25 cicli vuol dire 225 a partire da una singola molecola. La DNA polimerasi chiamata Taq polimerasi ed è termostabile.  Il Sequenziamento dei Genomi Genomes Sequencing Tecnica sviluppata da Fred Sanger nel 1970. L'utilizzo di dideossinucleotidi resta importante nel sequenziamento di genomi. I dideossinucleotidi agiscono come dei terminatori e interrompono la replicazione. Tutti i nucleotidi del DNA mancano di un gruppo ossidrile al carbonio 2' dello zucchero, ma i dideossinucleotidi sono anche privi di un OH al carbonio 3'. Un dideossinucleotide può essere incorporato ma impedisce l'aggiunta di altri nucleotidi in quanto manca del gruppo OH al 3' e quindi termina la crescita del filamento. Si usano quattro dideossinucleotidi per ogni base. Quando un dideossinucleotide viene incorporato alla catena di DNA in crescita la reazione si interrompe a quella specifica base. Vengono così prodotti una serie di frammenti che terminano ad una specifica base. Le quattro reazioni insieme contengono frammenti ad ogni possibile base.  Il Sequenziamento dei Genomi Genomes Sequencing Si producono quindi una scala di frammenti che possono essere separati per elettroforesi anche se differiscono per una singola base. Ogni dideossinucleotide è marcato con un colorante fluorescente e tutti e quattro sono aggiunti a una sola reazioni di sintesi del DNA. I frammenti marcati vengono separati in un tubo capillare per elettroforesi e vengono eccitati da un raggio laser e quindi emettono fluorescenza. Il tipo di nucleotidi al livello del quale si è interrotta la reazione viene identificato in base al colore e registrato dal computer.  Il Sequenziamento dei Genomi Genomes Sequencing Attualmente i 4 dideossinucleotidi vengono marcati con quattro coloranti fluorescenti diversi uno per ciascuna base azotata quindi si può fare una miscela di reazione e una reazione di sequenziamento. Elettroforesi Capillare Picchi di fluorescenza rispetto al tempo  La trascrizione La trascrizione crea una coppia di RNA del DNA questo avviene da parte del enzima RNA polimerasi. Viene utilizzato il DNA come stampo per fare RNA. Solo uno dei due filamenti del DNA viene copiato denominato filamento stampo o filamento antisenso. Il filamento del DNA che non viene copiato viene denominato filamento codificante o filamento senso. L’RNA trascritto viene utilizzato per dirigere la sintesi dei polipeptidi e viene chiamato RNA messaggero (mRNA) perché porta il messaggio contenuto nel DNA ai ribosomi.  La trascrizione nei procarioti I procarioti hanno una singola RNA polimerasi. Esiste in due forme la polimerasi core e l’oloenzima. La polimerasi core è in grado di sintetizzare RNA utilizzando un modello di DNA ma non può iniziare la sintesi con precisione. L’oloenzima può iniziare con precisione la sintesi. La polimerasi core è composta da due subunità identiche α, una subunità ϐ e una subunità ϐ’. Le due subunità α aiutano a tenere il complesso insieme e possono legarsi alle molecole regolatorie. Il sito attivo sono le due subunità ϐ e ϐ’ che si legano al DNA stampo e ai precursori ribonucleotidi trifosfato. L’oloenzima è formato dall’aggiunta della subunità σ alla polimerasi core. Ha la capacità di riconoscere i segnali specifici nel DNA.  La trascrizione nei procarioti Per iniziare la trascrizione sono necessari due siti specifici nel DNA: uno chiamato promotore sito di riconoscimento per il legame della RNA polimerasi. Un sito di inizio per la trascrizione. La polimerasi ha anche bisogno di un segnale di fine trascrizione chiamato terminatore. La regione dal promotore al sito del terminatore viene chiamata unità di trascrizione. Il sito a monte dell’unità di trascrizione viene numerata come -1 mentre la prima base trascritta ( a valle dell’unita di trascrizione) viene numerata come +1.  La trascrizione nei procarioti Promotore Il promotore è una breve sequenza che si trova a monte del sito di inizio e quindi non viene trascritto. Due sequenze con 6 paia di basi sono comuni ai promotori batterici: una è situata a 35 nt (nucleotidi) a monte del sito di inizio (-35) e l’altra si trova a 10 nt a monte (- 10). Sono asimmetrici e indicano il sito d’inizio e la direzione della trascrizione. Il legame della RNA polimerasi al promotore è il primo passo nella trascrizione ed è controllato dalla subunità σ che riconosce la sequenza -35 e la orienta verso la direzione corretta della trascrizione. Una volta attaccata al promotore comincia rilassare l'elica dalla posizione -10.  La trascrizione nei procarioti L'allungamento aggiunge nucleotidi successivi. La trascrizione comincia con una molecola di ATP o GTP. Ad una di queste molecole che rappresenta l'estremità 5' della catene che cresce 5'-3' vengono aggiunti i ribonucleotidi. La molecola di RNA lascia a questo punto il promotore e la subunità σ lascia la polimerasi. La regione contenente l'RNA polimerasi, lo stampo di DNA e RNA trascritto viene chiamata bolla di trascrizione perché contiene localmente una bolla aperta di DNA.  La trascrizione nei procarioti La fine della trascrizione è caratterizzata da sequenze di terminazione che danno il segnale di stop alla polimerasi. La sequenza di terminazione consiste in una serie di paia di basi G-C seguite da una serie di paia di basi A-T. La trascrizione di questa regione può formare una struttura a doppio filamento nella regione GC chiamata forcina che è seguita da quattro o più nucleotidi U. la formazione della forcina blocca la RNA polimerasi. Le basi di U formano un legame debole con l'A e cosi la polimerasi si stacca.  La traduzione nei procarioti Nei procarioti l'mRNA prodotto comincia essere tradotto prima che la trascrizione sia finita quindi la trascrizione e traduzione sono accoppiate. Appena l'estremità 5' dell'mRNA si libera i ribosomi si attaccano e per iniziare la traduzione. I geni sono spesso organizzati in modo tale che i geni che codificano per funzioni correlate siano raggruppati insieme, questo gruppo di geni funzionalmente collegati viene definito come un operone. Un operone è un unità di trascrizione unica che codifica diversi enzimi necessari per una via biochimica.  L'RNA Tutti gli RNA vengono sintetizzati a partire da uno stampo di DNA da parte della trascrizione. RNA messaggeri (mRNA). La trascrizione converte le informazioni contenute nel DNA a un trascritto di RNA chiamato mRNA. E' la forma intermedia delle informazioni contenute nel DNA che vengono portate fuori dal nucleo ed elaborate nei ribosomi. RNA ribosomiale (rRNA). La classe di RNA trovato nei ribosomi è chiamata RNA ribosomiale (rRNA) e si trovano in entrambi le subunità. RNA transfer (tRNA). Le molecole adattatore intermediario tra mRNA e amminoacidi è l'RNA transfer. Le molecole di tRNA hanno ad una estremità gli amminoacidi legati covalentemente è all'altra estremità un anticodone che può appaiarsi con un codone di mRNA. I tRNA sono in grado di interpretare le informazioni contenute nell'mRNA per posizionare gli amminoacidi sul ribosoma. Piccoli RNA nucleari (snRNA). I snRNA fanno parte dell'apparato che è coinvolto nella maturazione del "pre-mRNA" nucleare eucariotico. SRP RNA. Negli eucarioti in cui vengono sintetizzate alcune proteine dai ribosomi sul reticolo endoplasmatico rugoso, questo processo è mediato dalla particella di riconoscimento del segnale o SRP. L'SRP contiene sia RNA che proteine. miRNA e siRNA. Questa classe di RNA include sia i microRNA (miRNA) che gli small interfering RNA (siRNA). Tali RNA sono coinvolti nel controllo dell'espressione genica.  Il Codice Genetico In che modo l'ordine dei nucleotidi nella molecola di DNA codifica per l'informazione che regola l'ordine degli amminoacidi in un polipeptide? Il codice genetico consiste in una serie di blocchi d'informazioni chiamati codoni. Ognuno corrisponde ad un amminoacido nella proteina codificante. Il codice genetico viene letto in gruppi di tre nucleotidi (codice a triplette) e che la lettura avviene in modo continuo senza spazi tra le unità di tre nucleotidi. Il quadro di lettura stabilito dal primo codone nella sequenza determina il modo in cui tutti i codoni successivi vengono letti.  Il Codice Genetico 1961-1966 Nirenberg e altri ricercatori decifrano il codice genetico. Khorana un chimico organico utilizzando la sintesi organica per la produzione di molecole di RNA artificiale di sequenza definita e quindi quali polipeptidi venivano codificati in un sistema in vitro ha consentito la determinazione di tutte le 54 delle possibili sequenze di tre nucleotidi e alla fine tutto il codice genetico.  Il Codice Genetico è Degenerato Tre codoni UAA, UGA e UAG codificano per un segnale di "stop" e sono riconosciuti come codoni di stop. Il codone di AUG è usato per il segnale "di inizio" e quindi è il codone di inizio. In questo caso il codone ha una duplice funzione perché codifica anche per l'aminoacido metionina (Met).  Il Codice Genetico è Degenerato 61 codoni per 20 aminoacidi. Tutti i 61 codoni vengono utilizzati quindi alcuni aminoacidi sono specificati da più codoni per questo si dice che il codice genetico e degenerato. Il codice genetico è Universale ma non del tutto. Nel genoma mitocondriale l'UGA non è un codone di stop ma codifica per il triptofano; AUA viene letto come l'aminoacido metionina piuttosto come isoleucina, invece AGA e AGG sono letti come codoni di stop invece che arginina. Differenze sono state trovate anche nei cloroplasti.  La trascrizione degli eucarioti Gli eucarioti hanno tre diverse RNA polimerasi che differenziano per struttura e funzione. 1. L'RNA polimerasi I trascrive l'rRNA. 2. L'RNA polimerasi II trascrive l'mRNA e alcuni piccoli RNA nucleari. La maggior parte dei geni eucariotici cominciano la trascrizione da una sequenza chiamata TATA box a monte dell'inizio della trascrizione. 3. L'RNA polimerasi III trascrive il tRNA e alcuni altri piccoli RNA. Promotori delle RNA polimerasi L'esistenza di tre diverse polimerasi richiede diversi segnali che permettono alle polimerasi di capire da dove cominciare la trascrizione. Ogni polimerasi conosce il suo promotore. I promotori della RNA polimerasi I: specifici per ciascuna specie. I promotori della RNA polimerasi II: a monte del sito di inizio si trova una sequenza denominata TATA (TATA box). La somiglianza del TATA box con la sequenza -10 dei procarioti portò all'ipotesi che fosse il promotore degli eucarioti. I TATA box sono una piccola parte del promotore chiamato "promotore minimo" (core promoter) insieme ad altri elementi distinti. I promotori della polimerasi III: sono all'interno del gene stesso.  La trascrizione negli eucarioti L'inizio della trascrizione a livello dei promotori della RNA polimerasi II è simile all'inizio della trascrizione nei procarioti. Invece di un singolo fattore che consente il riconoscimento del promotore gli eucarioti utilizzano una serie di fattori di trascrizioni. Questi fattori agiscono cooperativamente per reclutare l'RNA polimerasi II su di un promotore. I fattori di trascrizione interagiscono con l'RNA polimerasi II per formare un complesso di inizio a livello del promotore.  La trascrizione negli eucarioti Le molecole di mRNA eucariotiche vengono modificate nel nucleo. Quando il trascritto ha 20 nucleotidi viene aggiunta una GTP al gruppo fosfato al 5' noto come cappuccio 5'. Questo cappuccio viene legato al mRNA mediante la sua estremità 5' formando l'unico legame 5'-5' ritrovato negli acidi nucleici. La guanina del GTP viene mondificata mediante aggiunta di un gruppo metile spesso chiamato cappuccio di metil-G. Questa struttura è importante per la traduzione e per la stabilità dell'RNA.  La trascrizione negli eucarioti Il complesso di allungamento della trascrizione contiene fattori che si associano dopo l'inizio. Negli eucarioti la fine della trascrizione non è la fine dell'mRNA. Il trascritto viene tagliato a valle di un sito specifico di poliadenilazione (AAUAAA) mentre la polimerasi stà allungando il trascritto. Una serie di 100-200 residui di adenina denominata coda di poli-A al 3' viene aggiunta dopo la scissione da parte dell'enzima poli-A polimerasi. Dopo la reazione di taglio una esonucleasi gradualmente taglia l'RNA a vale del sito di taglio portando al distacco dal DNA del complesso di trascrizione. La coda di poli-A sembra proteggere dalla degradazione gli mRNA.  La trascrizione negli eucarioti e i GENI I geni degli eucarioti possono contenere sequenze non codificanti le quali devono essere rimosse per produrre l'mRNA maturo. Questo processo viene chiamato splicing del pre-mRNA è eseguito da un organello chiamato spliseosoma e avviene nel nucleo. Il DNA non codificante che interrompe la sequenza del gene vengono chiamate "sequenze interposte" o introni mentre le sequenze codificanti e quindi espresse esoni. Negli esseri umani solo dall'1 all'1.5% del genoma è formato da esoni che codificano per le proteine, il 24% è formato da introni non codificanti all'interno dei quali sono inseriti questi esoni.  La trascrizione negli eucarioti e i GENI Nel processo di splising del pre-mRNA vengono eliminati l'introni e rimesse assieme gli esoni per formare il maturo mRNA. Le giunzioni esone-introne sono riconosciute da piccole particelle nucleari ribonucleoproteine chiamate snRNP. Le snRNP sono complessi composti da snRNA e proteine e si associano assieme ad altre proteine a formare un complesso più ampio chiamato spliseosoma responsabile dello splicing e l'eliminazione degli introni.  La trascrizione negli eucarioti e i GENI Gli introni iniziano tutti con la stessa sequenza di 2 paia di basi e terminano con un'altra sequenza di 2 paia di basi che gli etichetta per la rimozione. All'interno del introne ce anche un nucleotide di A conservato chiamato punto di ramificazione che è importante per il splicing. Il processo di splicing inizia con il taglio alla giunzione di 5' dell'introne e si libera l'estremità e si attacca al 2' OH della A della sequenza del punto di ramificazione formando una struttura ad occhiello chiamato laccio. L'estremità al 3' del primo esone viene utilizzata per spostarla al 3' dell'introne rilasciando alla fine l'introne ancora ala forma di laccio. Una conseguenza dello splicing e che un singolo trascritto può dare alla formazione di due mRNA diversi con l'inserimento di diversi esoni un processo chiamato splicing alternativo.  La struttura del tRNA e dei ribosomi Ogni aminoacido deve essere collegato ad un tRNA con l'anticodone corretto perché la sintesi proteica possa procedere. Questo legame covalente viene eseguito dal enzima chiamato aminoacil-tRNA sintetasi. E' presente uno di questi enzimi per ciascuno dei 20 aminoacidi. Il tRNA è una molecola che ha due funzioni e deve essere in grado di interagire sia con l'mRNA che con gli aminoacidi. Può assumere la configurazione a trifoglio fondata sugli accoppiamenti intramolecolari delle basi che producono le regioni a doppio filamento. Questa struttura viene poi ripiegata nello spazio a formare una forma a L che ha due estremità funzionali: lo stelo accettore e l'ansa dell'anticodone. Lo stelo accettore è formato dall'estremità al 3' della molecola che si conclude sempre con la sequenza 5' CCA 3'. L'aminoacido è sempre attaccato a questa sequenza. L'ansa dell'anticodone è l'anello inferiore del trifoglio e si può appaiare con i codoni dell'mRNA.  La struttura del tRNA e dei ribosomi L'enzima aminoacil-tRNA sintetasi deve essere in grado di riconoscere specifiche molecole di tRNA cosi come i loro aminoacidi corrispondenti. Alcuni aminoacil-tRNA sintetasi devono essere in grado di riconoscere più di un singolo RNA. La reazione catalizzata di tali enzimi è chiamata reazione di caricamento del tRNA e il risultato è un aminoacido legato ad un tRNA chiamato tRNA caricato. Una molecola di ATP fornisce l'energia per questa reazione endoergonica. Il tRNA caricato prodotto dalla reazione è un intermedio attivato che può subire la reazione di legame del peptide di formazione senza un ulteriore utilizzo di energia. La reazione di caricamento unisce lo stelo accettore all'estremità carbossilica di un amminoacido.  I ribosomi La sintesi di ogni biopolimero può essere divisa in inizio, allungamento e terminazione tutti questi tre passaggi avvengono nel ribosoma. Perché il ribosoma funzioni deve essere in grado di legarsi a due tRNA in modo che possa essere formato un legame peptidico tra i loro amminoacidi. Il ribosoma contiene tre siti di legame: Il sito P (peptidil) che si lega al tRNA attaccato alla catena peptidica. Il sito A (aminoacil) che si lega al tRNA che trasporta l'aminoacido successivo da aggiungere. Il sito E (exit) che si lega al tRNA che trasportava l'aminoacido precedente aggiunto. Rispetto all'mRNA i siti sono disposti da 5' a 3' in ordine E, P ed A. Il successivo tRNA caricato si lega nel sito A, transita attraverso il sito P e quindi lascia il ribosoma passando dal sito E. Le due funzioni del ribosoma sono quella di decodificare il messaggio trascritto e quella di formare i legami peptidici. La funzione di decodificare risiede principalmente nella subunità minore del ribosoma. La formazione di legami peptidici è nella subunità maggiore è richiede l'enzima peptidil transferasi.  La traduzione nei procarioti Il codone di inizio della traduzione è AUG che codifica anche l'aminoacido metionina. Il ribosoma usa il primo AUG che incontra in un filamento di mRNA per segnalare l'inizio della traduzione. Nei procarioti il complesso di inizio della traduzione comprende uno speciale tRNA iniziatore caricato con una metionina modificata chimicamente la N-formilmetionina. Il tRNA iniziatore è indicato come tRNAfMet. Il complesso d'inizio comprende anche la subunità ribosomiale minore e il filamento mRNA. La subunità ribosomiale minore è posizionata correttamente sull'mRNA grazie ad una sequenza in 5' dell'mRNA chiamata sequenza che lega i ribosomi (ribosome binding sequence o RBS) che è complementare al 3' della subunità minore del rRNA. Una volta formato il complesso di inizio di mRNA, tRNA iniziatore e subunità ribosomiale minore viene aggiunta la subunità maggiore e la traduzione può cominciare. Il tRNA è legato al sito P con il sito A ancora vuoto.  La traduzione negli eucarioti Negli eucarioti l'aminoacido d'inizio è la metionina. Il complesso d'inizio è molto più complesso. La subunità minore si lega all'mRNA inizialmente legandosi al cappuccio al 5' dell'mRNA. L'allungamento Quando l'intero ribosoma è assemblato intorno al tRNA il secondo tRNA caricato può essere portato al ribosoma e può legarsi al sito A vuoto. Ciò richiede un fattore di allungamento chiamato EF-Tu che si lega al tRNA caricato e al GTP. Successivamente si forma il legame peptidico tra i due tRNA. Ogni nuovo tRNA caricato arriva al ribosoma legato al fattore EF-Tu e al GTP. Formazione del legame peptidico: la peptidil transferasi che si trova nella subunità maggiore catalizza la formazione di un legame peptidico tra il gruppo amminico degli aminoacidi nel sito A e il gruppo carbossilico della catena in crescita. L'allungamento della catena polipeptidica continua in questo modo fino a quando viene raggiunto un codone di stop della catena. I codoni di stop non si legano al tRNA vengono riconosciuti da fattori di rilascio. Sono proteine che liberano il nuovo polipeptide dal ribosoma.  La traduzione negli eucarioti I legami peptidici si formano tra un nuovo tRNA caricato nel sito A e la catena nascente fissata per il tRNA nel sito P. Si forma un legame tra il gruppo amminico del nuovo aminoacido e il gruppo carbossilico della catena nascente. Questa reazione rompe il legame tra la catena nascente e il suo tRNA: la catena nascente viene trasferita al sito di A, mentre il nuovo aminoacido rimane attaccato al suo tRNA.  La traduzione negli eucarioti. Ciclo di allungamento Il ciclo inizia quando un nuovo tRNA carico con un anticodone corrispondente al codone dell'mRNA in A arriva con un EF-Tu. L'EF-Tu idrolizza GTP e si dissocia dal ribosoma. Si forma un legame peptidico tra l'aminoacido nel sito A e la catena nascente nel sito P; a questo punto la catena nascente si trasferisce nel sito A lasciando il tRNA nel sito P vuoto. La traslocazione del ribosoma richiede un altro fattore di allungamento e l'idrolisi di GTP. Questo sposta il tRNA nel sito A al sito P il codone successivo dell'mRNA nel sito A, il tRNA vuoto nel sito E.  La traduzione negli eucarioti Quando un ribosoma incontra un codone di terminazione per esempio il codone UAA esso blocca la traslocazione.  IL GENOMA UMANO Il perfezionamento delle metodiche molecolari di analisi del DNA e dell' automazione del sequenziamento, in parallelo allo sviluppo di nuovi programmi informatici, ha permesso ha permesso di concretizzarsi dell'HUMAN GENOME PROJECT (HGP o Progetto Genoma Umano) ossia il sequenziamento completo del genoma umano. Tutto questo ha condotto quindi alla nascita della GENOMICA, una branca della biologia molecolare che si occupa dello sviluppo e dell'applicazione di nuove procedure per la mappatura, il sequenziamento e l'analisi di interi genomi. Sulla scia del Progetto Genoma Umano sono partiti altri progetti mirati al sequenziamento del genoma di altri organismi geneticamente importanti: il batterio Escherichia coli il lievito Saccharomyces cerevisiae il moscerino della frutta Drosophila melanogaster il nematode Caenorhabditis elegans il topo Mus musculus, il cui genoma per la sua complessità è paragonabile a quello umano.  IL GENOMA UMANO Il genoma nucleare diploide è costituito all'incirca da 6,4 miliardi di coppie di basi, organizzate a costituire 46 cromosomi. Contiene sequenze codificanti (geni) e sequenze non codificanti, che rappresentano oltre il 90% del genoma. Il numero di geni è stato stimato intorno a 20.000, ma la loro distribuzione varia notevolmente a seconda delle regioni genomiche, con regioni: eterocromatiche completamente prive di geni eucromatiche in cui i geni sono presenti, sebbene con una densità variabile da regione e regione.  IL GENOMA UMANO STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI Nella genetica molecolare, per gene si intende una sequenza di DNA potenzialmente trascrivibile in un RNA funzionante attivo. Tale RNA può svolgere direttamente: Una funzione strutturale e/o catalitica come ad esempio gli rRNA, tRNA ecc. Avere la funzione di trasportare l'informazione per la sintesi di una proteina quindi formare un mRNA. Nel genoma umano si stima che siano presenti circa 21.000 geni codificanti proteine e almeno altrettanti geni che vengono trascritti in RNA non codificanti (ncRNA), che svolgono un ruolo importante nella regolazione della conformazione della cromatina e della trascrizione degli stessi geni codificanti proteine.  IL GENOMA UMANO Nell'ambito delle regioni codificanti sono presenti geni codificanti polipeptidi e geni codificanti RNA; rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, RNA antisenso e micro-RNA, implicati nella regolazione dell'espressione genica. I base alla loro funzione che svolgono vengono classificati in tre classi di geni: ✓Geni della I classe RNA ribosomiale (rRNA) ✓Geni della II classe RNA messaggero (mRNA) Piccoli RNA nucleari (snRNA) Micro RNA (miRNA) ✓Geni della III classe RNA transfer (tRNA) Piccoli RNA nucleolari (snoRNA) “RNA genes” Le sequenze codificanti Piccoli RNA citoplasmatici (scRNA) RNA funzionali rappresentano il 5-10% dei geni totali.  RNA CODIFICANTI Gli RNA messaggeri (mRNA) sono gli unici tipi di RNA codificante. ❖Vengono trascritti dei geni che codificano proteine. ❖Trasportano l'informazione genica nel citoplasma, dove tale informazione viene tradotta nella sintesi delle proteine. ❖Costituiscono solo il 4% circa degli RNA totali della cellula ed hanno vita breve perché degradati subito dopo la sintesi proteica.  RNA NON CODIFICANTI RNA ribosomiali (rRNA) Sono i più abbondanti nelle cellule. Fanno parte integrante dei ribosomi, le proteine dove ha luogo la sintesi proteica. Genesi dei ribosomi  RNA NON CODIFICANTI RNA transfer (tRNA) Sono piccole molecole coinvolte nella sintesi proteica. Trasportano gli specifici aminoacidi ai ribosomi in base alla sequenza nucleotidica dell'mRNA in modo tale da sintetizzare la proteina corretta.  RNA NON CODIFICANTI Piccoli RNA nucleari (snRNA) Sono coinvolti nella maturazione degli mRNA. Piccoli RNA nucleolari (snoRNA) Svolgono un ruolo cruciale nella maturazione delle molecole rRNA. Sono associati ad alcune proteine e prendono parte ad alcune modificazioni chimiche dell'RNA ribosomiale, esempio la metilazione, e dei trascritti di altri geni che codificano per molecole di RNA. Piccoli RNA citoplasmatici (scRNA) Gruppo eterogeneo che comprende molecole di RNA con una varietà di funzioni diverse, alcune ancora sconosciute. microRNA (miRNA) Sono piccole molecole di RNA che regolano l'espressione genica a livello post-trascrizionale. Dal cromosoma al DNA  Il controllo della espressione genica La capacità di certe proteine di legare specifiche sequenze regolatrici del DNA e o bloccare la trascrizione o facilitare il legame della RNA polimerasi è la chiave che rende possibile il controllo trascrizionale. Proteine regolatorie: sono proteine che agiscono modulando la capacità dell'RNA polimerasi di legarsi al promotore. Queste proteine si legano a specifiche sequenze nucleotidiche sul DNA che generalmente sono lunghe solo 10-15 nucleotidi. Il legame della proteina blocca la trascrizione ostacolando l'RNA polimerasi oppure stimola la trascrizione facilitando il legame dell'RNA polimerasi al promotore.  Il controllo della espressione genica Eucarioti L'omeostasi quindi il mantenimento di un costante ambiente cellulare interno è considerato di essere la caratteristica principale degli organismi multicellulari. Le cellule rispondono ai segnali del loro ambiente circostante (fattori di crescita, ormoni) alterano l'espressione genica. Regola e controlla lo sviluppo dell'organismo stesso.  Il controllo della espressione genica L’insieme dei geni di un individuo è detto genotipo; quindi il genotipo e tutto quello che si trova nei cromosomi. Il genotipo è la costituzione genetica di un individuo. Invece, l’insieme dei caratteri di un individuo è detto fenotipo; quindi il fenotipo è tutto ciò che possiamo osservare di un individuo, come altezza, colore degli occhi ecc. Carattere corrispondente a un determinato genotipo.  Il controllo della espressione genica Non è necessario che l'elica di DNA si svolga affinché le proteine regolatorie riescano interagire con le sequenze specifiche di basi. L'elica del DNA genera due solchi nella struttura cilindrica dell'elica: Un solco più ampio chiamato solco maggiore Un solco più piccolo chiamato solco minore Nel solco maggiore i donatori e accettori di legami idrogeno dei nucleotidi sono accessibili. Le proteine riescono inserirsi nel solco e leggere la sequenza delle basi.  Il controllo della espressione genica Una proteina regolatrice può identificare l'arrangiamento delle basi Lettura del solco maggiore del DNA: Osservando dentro il solco maggiore di un elica di DNA si può osservare le estremità delle basi che protrudono nel solco. Ciascuno dei quattro arrangiamenti di basi offre una combinazione unica di gruppi chimici nel solco.  Il controllo della espressione genica Le proteine regolatrici devono essere in grado di interagire con l'apparato trascrizionale. Diversi comuni motivi di legame al DNA sono condivisi da molte proteine. Motivi strutturali di legame al DNA Il motivo elica-giro-elica (helix-turn-helix): Costituito da due segmenti di α (alpha)-elica della proteina legati da un segmento corto non elicoidale (giro). Interagisce con il solco maggiore del DNA. I segmenti elicoidali del motivo interagiscono tra loro in modo che essi sono tenuti insieme perpendicolarmente. Quando questo motivo e premuto contro il DNA uno dei seguenti elicoidali chiamato elica di riconoscimento si adatta perfettamente al solco maggiore della molecole dell'DNA e l'altro urta contro la parte esterna del DNA e in questo modo vengono riconosciute le basi regolatorie.  Il motivo elica-giro-elica Motivo elica-giro–elica si lega al DNA usando l'α-elica chiamata elica di riconoscimento e interagisce con il solco maggiore. L'altra elica posiziona l'elica di riconoscimento. Queste proteine normalmente sono dimeri con due subunità identiche ciascuna contenente il motivo di legame al DNA.  Il motivo a ditta di zinco ❖Si utilizzano una o più atomi di zinco per coordinare il legame con il DNA. Proteina chiamata a dita di zinco (zinc fingers). ❖Un atomo di zinco lega un segmento ad α-elica ad un segmento a foglietto β (beta) in modo che il segmento elicoidale si adatti al solco maggiore del DNA. ❖Questo tipo di motivo spesso si verifica in cluster. ❖I foglietto β spaziano i segmenti elicoidali affinché ogni elica contati i solco maggiori. ❖L'effetto è come una mano avvolta attorno al DNA con le dita distese nel solco maggiore. ❖Più dita di zinco ci sono nel cluster più forte la proteina si lega al DNA.  Il motivo a cerniera di zinco ( leucine zipper) Il motivo a cerniera di leucina in questo motivo due diverse subunità della proteina cooperano per creare un singolo sito di legame al DNA chiamata cerniera di leucina. Una subunità contenente diversi amminoacidi idrofobici di leucine interagisce con una regione simile sull'altra subunità. Questa interazione tiene insieme le due subunità e crea una struttura a forma di Y con i due bracci della Y che, essendo regioni elicoidali, si adattano al solco maggiore del DNA. Tengono così il DNA come un paio di pinze.  Dal cromosoma al DNA alla Proteina L'inizio della trascrizione avviene a livello del promotore Il trasferimento dell'informazione genetica dal DNA all'RNA è detto trascrizione. Durante questo processo un complesso proteico comprendente l'enzima RNA polimerasi sintetizza le molecole di mRNA sullo stampo delle sequenze di DNA. La trascrizione richiede due siti nel DNA uno chiamato promotore che forma un sito di riconoscimento del sito di legame per l'RNA polimerasi, è il sito di inizio della trascrizione effettivo. L'RNA polimerasi II usa uno dei due filamenti di DNA (filamento antisenso) e sintetizza una molecola di mRNA in direzione 5'-3' catalizzando il legame fosfodiestere tra il gruppo ossidrilico legato al carbonio 3' del ribonucleotide Solo uno dei due filamenti del precedente e il fosfato del nuovo DNA viene copiato denominato filamento nucleotide. stampo o filamento antisenso. Il filamento del DNA che non viene copiato La polimerasi continua la trascrizione viene denominato filamento finche non trova un segnale di fine codificante o filamento senso. trascrizione chiamato terminatore. La regione dal promotore al sito di terminazione vengono definiti unità di trascrizione.  IL GENOMA UMANO STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI Il promotore I fattori della trascrizione reclutano l'RNA polimerasi II al sito giusto per iniziare la trascrizione grazie all'interazione del mediator complex, un complesso di circa 30 proteine, chiamati fattori di trascrizione. Questi fattori agiscono cooperativamente per reclutare la RNA polimerasi II su di un promotore. I fattori di trascrizione interagiscono con l'RNA polimerasi II per formare un complesso di inizio a livello del promotore. Il mediator complex è assolutamente necessario non solo per l'inizio della sintesi dell'RNA ma anche per tutta la fase della trascrizione. I geni che presentano elevati livelli di trascrizione come gli istoni o la betta-globina, hanno specifici elementi nel promotore che includono sempre un TATAbox circa -25 bp dal sito di inizio della trascrizione. I promotori di altri geni tra cui i geni housekeeping, geni che servono al funzionamento generale della cellula, sono trascritti tanto dalle cellule, non hanno i TATAbox ma contengono sequenze ricche di GCbox.  IL GENOMA UMANO STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI I fattori di trascrizione generali sono nominati con designazione letterali che seguono l'abbreviazione TFII per " fattore di trascrizione dell'RNA polimerasi II". Il più importante di questi fattori il TFIID contiene la proteina di legame TATA che riconosce la sequenza TATA box trovata in molti promotori eucariotici. Il legame di TFIID è seguito dal legame di TFIIE, TFIIF, TFIIA, TFIIB e TFIIH e una schiera di fattori accessori chiamati fattori associati alla trascrizione, TAF. Tutti questi fattori reclutano insieme la RNA polimerasi II al core del promotore. Formazione di un complesso di inizio eucariotico.  IL GENOMA UMANO STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI Il promotore Complesso di inizio eucariotico. La trascrizione eucariotica richiede il legame di fattori di trascrizione al promotore prima che l'RNA polimerasi II si leghi al DNA. L'associazione di fattori di trascrizione e RNA polimerasi II al promotore è chiamato complesso di iniziazione.  Dal cromosoma al DNA alla Proteina I precursori degli mRNA neosintetizzati dalla RNA polimerasi II vengono chiamati trascritti primari o pre-mRNA e devono subire una serie di modificazioni prima di essere trasferiti nel citoplasma per venire tradotti sui ribosomi. Questo processo di maturazione degli mRNA include le seguenti modificazioni: Aggiunta all'estremità 5' di un cap o cappuccio. Al primo nucleotide all'estremità 5' della molecola di RNA nascente viene rimosso il fosfato terminale e viene aggiunta una molecola di guanosina monofosfato (GMP) metilata in posizione 7'. Il capping serve per proteggere il trascritto dall'attacco delle esonucleasi che lo degraderebbero e per facilitare il trasporto dal nucleo al citoplasma. Aggiunta all'estremità 3' di una coda di poli-A. Sono brevi sequenze (AATAAAA) che specifica il sito di terminazione della trascrizione. La coda poli-A ha lo scopo di stabilizzare le molecole degli mRNA maturi e di facilitare il trasporto dal nucleo al citoplasma.  Dal DNA alla Proteina Rimozione di alcune sequenze che non vengono tradotte tramite il processo di splicing. Quasi tutti i geni eucariotici sono divisi in sequenze codificanti chiamate esoni e sequenze non codificanti chiamate introni. Questi ultimi vengono rimossi dai trascritti primari mediante il processo di splicing.. Gli introni cominciano sempre con i nucleotidi GT e terminano con i nucleotidi AG (regola GT-AG). Quindi i due esoni si uniscono mentre gli introni vanno persi. La struttura che promuove le reazioni dello splicing è detta spliceosoma. Questo complesso comprende varie subunità snRNA e altre proteine.  IL GENOMA UMANO STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI Pre-mRNA mRNA maturo Schema di un gene umano costituito da tre esoni. Sono indicati alcuni elementi del promotore e i siti importanti per la trascrizione e la maturazione dell'RNA. E' rappresentato anche il trascritto primario, precursore dell'mRNA chiamato pre-mRNA, e l'mRNA maturo.  IL GENOMA UMANO STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI Il promotore La regione a monte del sito della trascrizione è chiamata promotore. La numerazione dei nucleotidi del promotore inizia da -1, che corrisponde al nucleotide che precede il sito di inizio della trascrizione che viene invece indicato come +1. Nella regione del promotore è di lunghezza variabile e sono presenti una serie di brevi sequenze chiamate elementi cis che viene riconosciuta e legata da fattori di trascrizione chiamati elementi trans.  IL GENOMA UMANO STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI Il promotore Oltre alle sequenze comuni molti promotori contengono sequenze che vengono riconosciuti da fattori di trascrizione tessuto-specifici. Un altro tipo di sequenze specifiche che vengono riconosciute da fattori di trascrizione quali gli elementi di risposta (ER), localizzati nel promotore o nella regione 5' del gene. Gli elementi enhancer (intensificatori) che servono per aumentare i livelli basali della trascrizione e sono localizzati a distanza variabile dal gene, talvolta anche a valle del sito di inizio della trascrizione, vale a dire all'interno della regione trascritta. Gli elementi silencers (silenziatori) che servono per reprimere la trascrizione e sono spesso localizzati lontano dal sito di trascrizione.  IL GENOMA UMANO STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI  IL GENOMA UMANO STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI Nuovi progressi compiuti nello studio del controllo sull'espressione del DNA è stata l'identificazione delle modificazione della cromatina associata a una conformazione aperta (attiva) o compatta (inattiva) a livello degli istoni. Tali modificazioni sono dette epigenetiche perché non modificano la sequenza primaria del DNA. Struttura della cromatina Il nucleosoma è l’unità strutturale della cromatina, è costituita da DNA e gli istoni. Questa struttura si ripete in tutto il materiale genetico di un organismo.  IL GENOMA UMANO STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI La cromatina trascrizionale quindi la forma attiva è caratterizzata da un alto livello di acetilazione degli istoni H3 e H4 a livello dei residui di lisina delle code N-terminali. Tali code delle proteine istoniche interagiscono e legano il DNA grazie alla carica positiva dei residui di lisina e arginina. L'acetilazione dei gruppi aminici delle lisine neutralizza tale carica e diminuisce quindi l'affinità degli istoni H3 e H4 per il DNA facilitandone il suo distacco. Al contrario, gli istoni associati alla cromatina non trascritta quindi inattiva sono deacetilati. Questo processo di acetilazione e deacetilazione avviene grazie a due enzimi l'acetiltransferasi e la deacetilasi.  IL GENOMA UMANO STRUTTURA ED ESPRESSIONE DEI GENI Le modificazioni dell'istone interessano la struttura della cromatina: Il DNA negli eucarioti è organizzato prima in nucleosomi e poi in strutture di cromatina di ordine superiore. Gli istoni che costituiscono il core del nucleosoma hanno code aminoacidiche che protrudono. Queste code di aminoacidi possono essere modificate dall'aggiunta di gruppi acet