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Caracterização dos processos de replicação, transcrição e tradução. Objetivos: Caracterizar e identificar as etapas básicas da síntese de DNA, RNA e tradução do genoma humano.  Função do DNA Armazenar a informação ge...

Caracterização dos processos de replicação, transcrição e tradução. Objetivos: Caracterizar e identificar as etapas básicas da síntese de DNA, RNA e tradução do genoma humano.  Função do DNA Armazenar a informação genética de um organismo. Autorreplicar a informação genética Genomas de Eucariontes (Costa e Martins, 2011) Principais classes de DNA eucarioto e sua representação no genoma humano (Lodish, et.al., 2005).  ✓ Genes interrompidos. ✓ R. Promotoras. 1. DNA singular ou de Cópia única DNA cuja ordem linear de mucleotídeos específicos está representada uma única vez ou no máximo algumas vezes. São sequencias codificantes, encontrada em trechos curtos intercalados por sequencias repetitivas. Molécula de DNA (dupla hélice) linear. Célula Humana possui 46 cromossomos. Cada cromossomo apresenta Regiões teloméricas e um centrômero. Sequencias codificadoras – Éxons - intercalas por sequencias não codificadoras – íntrons (Sequencia de DNA repetitivo)  Tamanho e conteúdo genético de 24 cromossomos humanos Figura 1.Tamanho de cada cromossomo humano, em milhões de pares de bases (1 milhão de pares de bases = 1Mb). Os cromossomos estão ordenados por tamanho da esquerda para a direita. O número de genes identificados em cada cromossomo humano. Os cromossomos estão ordenados por conteúdo genético da esquerda para a direita.  Conteúdo gênico de cromossomo humano 1.300 genes que codificam proteínas. Receptor de Éxons da globina olfato Figura 2. Conteúdo do gene no cromossomo 11, que consiste em 134,45 Mb de DNA. A distribuição dos genes está indicada ao longo do cromossomo e é grande em duas regiões do cromossomo e menor em outras regiões. Uma região expandida de 5,1 a 5,3 Mb (medida a partir do braço mais curto do telômero), que contém 10 genes, sendo cinco pertencentes à família do gene do receptor olfatório (OR) e cinco pertencentes à família do gene da globina. Os cinco genes globina semelhantes a ß ainda mais expandida. 2. DNA repetitivo Classificadas: - Localização no genoma. - Comprimento total da série em tandem. - Comprimento das unidades repetidas  As categorias de DNA repetitivo. a)STR - Satélites: consiste de segmentos de DNA relativamente simples, curtos, altamente repetitivos em tandem. É visualizado como heterocromatina nas regiões dos centrômeros ou em blocos de heterocromatina nos telômeros. b) Minissatélites: Consiste de repetição de 15 a 100pb/ centenas de pares de bases, localizados em várias posições e em vários cromossomos humanos. c) Microssatélites: São sequências curtas simples repetidas de 1 até 6 pb nucleotídeos.  Organização do genoma humano Famílias de Genes – Duplicação de um gene precursor a 500 milhões de anos atrás. Compartilham sequências de DNA estreitamente relacionadas e codificam polipeptídeos com sequências de aminoácidos estreitamente relacionadas. Pseudogenes – São sequências de DNA que são extremamente semelhantes a genes conhecidos, mas não são funcionais (não produz qualquer RNA ou produto proteico). Tipos: ✓ Pseudogenes NÃO processados - subprodutos da evolução representando genes “mortos”. ✓ Pseudogenes processados – são formados por retrotransposição, envolvendo a transcrição, a geração de uma cópia de DNA a partir do mRNA (transcrição reversa) e, por fim, a integração dessas cópias do DNA no genoma. Não possuem íntrons. Variabilidade entre diferentes indivíduos.  Alterações no genoma x evolução dos genomas A matéria-prima para a evolução e representada pelas moléculas de DNA e genes que já existem. Novos genes e sequencias de DNA surgem por modificação de sequencias pré-existentes. Essas inovações podem surgir de diferentes maneiras Bio Store  Evolução dos genomas Possíveis modificações: 1) Mutação intragência: Um gene existente pode sofrer mutações na sua sequencia de DNA, produzindo uma forma genica modificada. (Costa e Martins, 2011). Pode ou ser herdada. 2) Embaralhamento de exons: dois ou mais genes podem sofrer quebras e reorganização de forma a produzir genes quimeras consistindo de segmentos de DNA que, originalmente, pertenciam a genes separados. (Costa e Martins, 2011). Embaralhamento dos Éxons: Gene eucarioto: Regiões éxons intercaladas por regiões íntrons. Novas combinações de éxons podem ser criadas por meio da recombinação dentro de um íntron. Consequência: Rearranjos gênicos com novas combinações e novas funções. Recombinações ocorrem por meio do Crossing over. 1. Íntrons servem para dividir os genes em pequenos espações funcionários. 2. Éxons embaralham-se criando novas combinações gênicas (novas proteínas) com funções novas. Ex: Enzimas envolvidas no processo de coagulação sanguínea e a fribrinólise  Evolução dos genomas 3) Transferência horizontal: um segmento de DNA ou mesmo um genoma inteiro pode ser transferido de uma célula para outra da mesma espécie ou de uma espécie diferente. Esse processo é oposto à transferência vertical que ocorre dos pais para a progênie. Nos genomas dos mamíferos, grande parte do material genético compõe-se por segmentos de DNA repetitivos adquiridos pela integração de vírus, retrovírus e elementos transponíveis. (Costa e Martins, 2011).  Transferência horizontal de genes Teoria Darwiniana de Evolução – uma espécie transfere verticalmente, a herança genética contida em seu genoma para a sua própria progênie e a diversidade e a variabilidade seriam resultado unicamente do acúmulo de mutações e rearranjos no genoma. Genômica: A diversidade genética é em grande parte resultado da aquisição de DNAs exógenos, fusão de genomas seguido ou não de rearranjos no material genético híbrido. Genomas de mamíferos _ grande parte do material genético compõem-se por seguimentos de DNA repetitivos adquiridos pela integração de vírus, retrovírus e elementos transponíveis. Todos os fragmentos de DNA são potencialmente capazes de serem transferidos de um genoma para outro, independente da participação de vírus, retrovírus ou outra partícula carreadora de material genético. Ex: Em mamíferos cruzamento interespecífico entre porco x javali = javaporco. Transferência horizontal de genes: Incorporação do DNA exógeno: Definitiva. Transiente. Dependente: Tipo e estrutura do material genético. Locais da inserção do genoma. Capacidade da expressão dos produtos tóxicos. Mecanismos de salvaguarda do DNA, Atuação das barreiras reprodutivas. Instabilidade genética: Célula receptora, capaz de gerar rearranjos variados. Após a integração, pode ocorrer duplicações, translocações ou deleções envolvendo pequenos ou grandes segmentos cromossômicos resultando em novas combinações. Duplicação gênica: Duplicações gênicas forneceram as condições necessárias para as principais transições evolutivas, incluindo a evolução da multicelularidade, da simetria bilateral e da evolução dos vertebrados. Os mecanismos precisos dos eventos de duplicação são diversos e podem envolver crossing over desigual, retrotransposição, aneuploidia e poliploidia. Esses mecanismos podem levar às duplicações de pequenos segmentos de genes, genes inteiros, blocos de genes, cromossomos inteiros ou mesmo genomas inteiros. Duplicação gênica permite que as novas cópias do gene assumam funções mais especializadas ou mesmo possibilita a origem de novos genes com funções totalmente distintas daquelas dos genes de origem. Replicação do DNA  Replicação do DNA A informação genética de um indivíduo deve ser transmitida á geração seguinte. Neste contexto, a célula realiza a síntese de uma nova molécula de DNA idêntica á originária para que ambas sejam repartidas para as células filhas. A síntese ocorre em três etapas: Iniciação Elongação Terminação Figura 5. Fases da interfase.  DNA Polimerase em eucariotos. DNA Polimerase – Adiciona nucleotídeos a fina nascente de DNA. DNA Polimerase Função DNA Polimerase α (alpha) Replicação do cromossomo nuclear (fita lagging). DNA Polimerase β (beta) Reparo de DNA no preenchimento de espaços do cromossomo nuclear. DNA Polimerase γ (gamma) Replicação de DNA mitocondrial DNA Polimerase δ (delta) Replicação do filamento leader a da lagging do cromossomo nuclear. DNA Polimerase ε (epsilon) Reparo do DNA do cromossomo nuclear. DNA Polimerase ζ (zeta) Possível reparo de DNA.  Propriedades das DNAs polimerase ✓ Todas as DNA polimerases requerem um molde. ✓ A polimerização deverá acontecer no sentido 5'- 3’. ✓ O processo de polimerização só irá iniciar-se com a presença oligonucleotídeo de RNA denominado RNA primer (iniciador), pois polimerase só consegue agir na presença de extremidade 3' OH livre.  Principais enzimas envolvidas na Replicação do DNA Helicases – Movimenta-se ao longo da dupla hélice de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATP para desenrolar as duas fitas. Topoisomerase II (DNA Girase) – Alivia a torção na frente da forquilha de replicação. Topoisomerase I – Corta uma fita do DNA, rotaciona essa fita sobre a outra e rejunta as extremidades, evitando o emaranhamento do DNA durante a replicação. Primases – Catalisa a formação dos RNAs iniciadores para a síntese de DNA. Telomerases – enzimas que repõem as sequencias teloméricas. DNA ligase – Catalisa a união dos fragmentos adjacentes de Okazaki.  Onde começar a síntese???? Origem da replicação – OriC A replicação do DNA tem origem em ponto específico da dupla hélice, denominado de origem de Replicação e prossegue em direção antiparalela, formando as forquilhas de replicação. Eventos de iniciação: ✓ Proteínas de ligação se ligam na OriC. ✓ DNA polimerase se liga ao promotor. ✓ Primase – sintetiza um primer de RNA (iniciador). ✓ DNA polimerase inicia a replicação.  Forquilhas de replicação Figura 6. Representação das forquilhas de replicação. Dupla hélice, Micrografia eletrônica e esquema. A replicação é bidirecional Figura 7. Replicação bidirecional.  Figura 8. Replicação Semiconservativa  Molécula de DNA nascente. Envolve duas operações distintas, mas relacionadas: 1.Síntese da fita líder 2.Síntese da fita tardia Início comum na forquilha de replicação envolvendo: -helicases -topoisomerase -Proteínas de ligação de DNA Figura 10.Fase de alongamento Figura 11. Esquema da replicação e origem dos fragmentos de Okasaki. Replicação TRANSCRIÇÃO  A função de todo gene é produzir uma cadeia polipeptídica, ou seja uma proteína. Transcrição – Processo de síntese de uma molécula de RNA utilizando uma das fitas de DNA como molde. RNA é sintetizado no núcleo celular. RNA é a única molécula conhecida capaz de atuar no armazenamento e na transmissão da informação genética, além de exercer atividade catalítica. Principais tipos de RNAs e suas funções RNA ribossômico  tRNA Os RNAt leem a informação codificada no RNAm e transferem o aminoácido apropriado para uma cadeia polipeptídica nascente durante a síntese proteica. O RNAt tem a função de traduzir a linguagem da sequência de bases para a linguagem de polipeptídeos e este é considerado uma molécula adaptadora, no processo de tradução. Todos os organismos possuem muitas espécies de tRNA, sendo normalmente pelo menos 1 para cada um dos 20 aminoácidos. Além disso, podem ser modificadas. Hoje são conhecidas as sequencias de bases de mais de 4000 tRNAs de mais de 200 organismos e organelas. Uma característica marcante deste RNA é o seu alto conteúdo de nucleosídeos incomuns: inosina (I), pseudouridina ( Y), diidrouridina (D), ribotimina (T) e derivados metilados de guanosina e inosina. Estruturas Primárias e Secundáriasdo tRNA O tRNA tem as seguintes características: – Variam de 54 a 100 nucleotídeos, embora a maioria contém 76 destes; – Estrutura secundária = 4 troncos de bases pareadas; – Estrutura em forma de trevo; – Grupo fosfato 5’-terminal; – Haste aceptora – São 7 pares de base, incluem o aminoácido terminal5’, que realizam pareamentos não- Watson-Crick; – Braço D – Alça que contém a base diidrouridina modificada; – Braço do Anti-códon – Alça que contém o anti-códon; – Braço T – Alça que contém a sequência TΨC (pseudouridina); – Terminam com a sequência – CCA (3’-OH livre); – 15 posições invariáveis e 8 semi-invariáveis (alças); – Braço variável – 3 a 21 nucleotídeos e haste com 7 pares de bases 1. Fase de inicio A transcrição começa quando a RNA polimerase se liga ao promotor.  Processo de transcrição A transcrição ocorre em uma “bolha de transcrição”, onde o DNA é separado em duas fitas e a fita molde é usada na produção da fita de RNA. O produto final da transcrição é chamado de transcrito primário URLGA Processamento do RNA mensageiro  Exemplo: RNA: ? Tradução Código Genético O código é degenerado. Não é ambíguo. Não é sobreposto. Tem ponto inicial e final. É universal. O código é degenerado. Tem ponto inicial e final. É universal Não é ambíguo. Elementos da síntese proteica aminoacil-tRNAsintetase  Aminoacil-tRNA-Sintases Os ribossomos selecionam aminoacil-tRNA pelas interações codon-anticodon e não de acordo com as identidades dos grupos aminoacila. A traduçao necessita que o tRNA seja aminoacilado pelo seu respectivo aaRS. O contato entre a sintetase e o tRNA ocorre na face interna deste último (face côncava) – haste aceptora e alça do anticódon. Estrutura e sequência de nucleotídeos da extremidade 5’ do gene da β-globina humana no braço curto do cromossomo 11. Figura 13. A transcrição do filamento de 3’ para 5’ (inferior) começa no local iniciador indicado para produzir o mRNA da β-globina. A tradução da matriz de leitura é determinada pelo códon iniciador AUG (***); códons subsequentes especificando aminoácidos são indicados em azul. As outras duas estruturas potenciais de leitura não são usadas.  Inicio da tradução tRNA-metionina ocupa o sítio P (sítio do peptídeo) do ribossomo, enquanto isso, o sítio A (sítio do aminoácido) está vazio. A associação desses elementos é mediada pelos fatores de iniciação e energia fornecida pelo GTP. Ramalho et al., Genética na Agropecuária. Lavras: UFLA, 2013. ROBERTS, E.; HIB, J. Baes da biologia molecular celular e molecular. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014. SNUSTAD, P.; SIMMONS, M.J. Fundamentos de Genética. Rio de Janeiro: Guamabara Koogan, 2018. Capitulo 10 – Replicação do DNA e dos cromossomos.