Kromatografi Afinitas (PDF)

UNIVERSITAS PADJADJARAN KELOMPOK 6 KROMATOGRAFI AFINITAS Kimia Pemisahan - Dr Retna Putri Fauzia, M.Si  ANGGOTA Kelompok 6 Kimia Pemisahan 140210230005 - Annisa Anggita Maulana 140210230015 - Chesya Faza 140210230012 - Sabbihisma Ramadhani...

UNIVERSITAS PADJADJARAN KELOMPOK 6 KROMATOGRAFI AFINITAS Kimia Pemisahan - Dr Retna Putri Fauzia, M.Si  ANGGOTA Kelompok 6 Kimia Pemisahan 140210230005 - Annisa Anggita Maulana 140210230015 - Chesya Faza 140210230012 - Sabbihisma Ramadhani 140210230031 - Aisya Rizqiani Salsabila Syam 140210230014 - Ariesha Putri A 140210230066 - Gifty Aulia 140210230080 - Elisa Nova  TABLE of contents 01. Pendahuluan 05. Faktor-faktor yang mempengaruhi 02. Prinsip 06. Aplikasi Penggunaan 03. Syarat Fasa diam & Fasa gerak 07. Kelebihan & Kekurangan 04. Mekanisme Kerja 08. Kesimpulan Pendahuluan Kromatografi afinitas merupakan teknik pemisahan dan pemurnian sebagian besar molekul biologi berdasarkan susunan kimia molekul tersebut. Dasar pemisahan pada kromatografi afinitas adalah pengikatan molekul protein, anti body atau vitamin yang mempunyai afinitas spesifik dengan ligan tertentu atau fase diam. Molekul yang dimurnikan akan terabsorbsi oleh ligan yang ter mobilisasi pada matrik. Ikatan yang terjadi antara protein dan ligan tersebut biasanya merupakan ikatan multivalen.  Prinsip Prinsip kromatografi afinitas adalah ligan terimobilisasi pada kolom. Sampel protein yang dilewatkan pada kolom, akan terjadi interaksi spesifik antara protein target dengan ligan, yang menyebabkan protein target dapat terpisah dari protein pengotor. Ligan berikatan kovalen dengan backbone matrix. Hanya enzim dengan afinitas spesifik yang akan terikat pada adsorben melalui interaksi dengan ligannya. Setelah proses pengikatan, biomolekul target yang terikat dapat dipisahkan dari ligan dengan cara elusi. Syarat Fasa Diam Material Pendukung yang Inert Material pendukung harus inert (tidak bereaksi dengan ligan atau molekul target) dan memiliki sifat hidrofilik agar sesuai dengan larutan berair yang digunakan dalam proses kromatografi. Contoh: Agarosa, sepharose, atau polimer lainnya yang dimodifikasi secara kimia. Stabilitas Stabil secara kimia terhadap pelarut dan eluen. Stabil secara mekanik untuk menahan tekanan selama proses kromatografi. Aksesibilitas Ligan Ukuran butiran harus sesuai untuk memungkinkan akses molekul target ke ligan Imobilisasi Ligan Spesifik Fasa diam harus mengandung ligan spesifik yang diimobilisasi pada material pendukung (support material). Ligan ini berfungsi sebagai "kunci" yang mengenali molekul target (ligat) berdasarkan interaksi spesifik. Contoh: Ligan seperti antibodi, enzim, atau oligonukleotida. Syarat Fasa Gerak Mendukung Interaksi Spesifik Fasa gerak harus dirancang untuk menjaga kondisi yang memungkinkan interaksi spesifik antara molekul target dengan ligan. Hal ini biasanya memerlukan buffer tertentu yang menstabilkan lingkungan biologis. Contoh: Buffer fosfat, buffer tris-HCl. Tidak Mengganggu Interaksi Fasa gerak tidak boleh mengganggu interaksi spesifik antara ligan dan molekul target, tetapi harus mampu menghilangkan pengotor atau molekul yang tidak terikat. Biasanya menggunakan buffer dengan pH dan kekuatan ion tertentu. Elusi Molekul Target Untuk melepaskan molekul target dari fasa diam, fasa gerak dapat dimodifikasi dengan menambahkan buffer elusi (elution buffer) yang bersifat kompetitif atau mengubah pH/kekuatan ion. Contoh: Buffer yang mengandung garam konsentrasi tinggi atau molekul kompetitor seperti analog substrat  Mekanisme Proses pemisahan dimulai dengan pengikatan, dimana dalam suatu campuran protein yang akan dipisahkan, terdapat enzim yang dapat berinteraksi secara spesifik dan reversibel dengan ligan tertentu yang diimobilisasi pada permukaan padatan pendukung sebagai fasa diam. Jika campuran protein dialirkan ke dalam kolom yang berisi ligan yang terimobilisasi pada padatan pendukung, enzim akan terikat pada ligan di dalam kolom, sedangkan protein lain akan mengalir ke luar dari kolom. Enzim yang terikat pada ligan dapat dielusi kembali menggunakan ligan, inhibitor, dan larutan bufer (Pakiman dkk., 2012)  Uji Kemurnian Analisis Spektroskopi Uv-Vis Elektroforesis Gel, SDS-Page HPLC Analisis Warna Western Blotting ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)  Faktor - Faktor yang Mempengaruhi Spesifisitas Ligan Temperatur Kondisi Buffer Waktu Interaksi Konsentrasi Garam Konsentrasi Biomolekul  Aplikasi Kromatografi Afinitas 1. Pemisahan dan Pemurnian Protein : digunakan untuk memurnikan protein spesifik dari campuran kompleks. Misal : antibodi untuk memurnikan enzim atau protein terapi. 2. Deteksi dan Identifikasi Biomarker : digunakan dalam diagnosis penyakit untuk mengisolasi biomarker spesifik dari sampel biologis. Ini sangat berguna dalam deteksi kanker, infeksi, atau penyakit lainnya. 3. Penentuan Interaksi Antigen-Antibodi : digunakan dalam studi interaksi antara antigen dan antibodi, yang merupakan dasar untuk pengembangan vaksin dan terapi berbasis antibodi. 4. Pembuatan Antibodi Monoklonal : digunakan dalam produksi antibodi monoklonal untuk terapi, diagnostik, dan penelitian. Kelebihan dan Kekurangan Kelebihan Kekurangan 1. Spesifitas tinggi 1. Biaya tinggi 2. Efisiensi permunian 2. Keterbatasan ligan 3. Pengaplikasian yang beragam 3. Potensi denaturasi protein 4. Proses sederhana 4. Durasi proses yang lama 5. Kemudahan elusi 5. Keterbatasan kapasitas Kesimpulan Kromatografi afinitas merupakan teknik pemisahan dan pemurnian sebagian besar molekul biologi berdasarkan susunan kimia molekul tersebut. Meskipun memiliki beberapa kekurangan, Kromatografi Afinitas ini lebih efisien digunakan karena kemudahannya dan prosesnya yang sederhana dengan hasil yang lebih baik. Kromatografi Afinitas juga memiliki spesifisitas yang tinggi dalam pemisahan sehingga secara signifikan meningkatkan kemurnian produk akhir. Sumber Hidayat,C., Lestari,S., Supriyadi. 2008. Pemurnian Lipase Menggunakan Teknik Immobilisasi Ion Logam Pada Matrik Zirconia Agarosa. Prosiding Seminar Nasional Teknoin Scopes, Robert K. 1994. Protein Purification Principle and Practice Third. Edition. Springer Science Business Media: New York. Pakiman, N.; N. H.Isa, ; Abol Hassan, M.A.; J.K. Walter, dan N. Abdullah. 2012. ―Comparison of Binding Capacity and Affinity of Monoclonal Antibody Towards Different Affinity Resin Using High-Throughput Chromatography Methods‖, Journal of Applied Sciences, 12, 11, 1136–1141. O’Kennedy, R., & McCafferty, J. (2006). Immunoaffinity chromatography for protein purification. Journal of Immunological Methods, 310(1-2), 11-18. Selvaraj, P., & Pillai, S. (2017). Application of immunoaffinity chromatography for biomarker discovery and detection. Clinical Chemistry, 63(7), 1132-1143 Smith, D. L., & Turner, M. W. (2005). Immunoaffinity chromatography in antigen-antibody interaction studies. Journal of Immunological Methods, 296(1-2), 145-153 Chaudhuri, S., & Katta, A. (2014). Immunoaffinity chromatography for the production of monoclonal antibodies. Biotechnology Advances, 32(6), 1182-1192. PADJADJARAN UNIVERSITY THANK YOU