Untitled Quiz

Kromatografi Afinitas

• Kromatografi afinitas adalah teknik pemisahan dan pemurnian sebagian besar molekul biologi berdasarkan susunan kimianya.
• Dasar pemisahannya adalah pengikatan molekul protein, antibodi, atau vitamin yang memiliki afinitas spesifik dengan ligan tertentu atau fase diam.
• Molekul yang akan dimurnikan akan teradsorpsi oleh ligan yang terimobilisasi pada matriks. Ikatan yang terjadi biasanya merupakan ikatan multivalen.

Prinsip

• Prinsip kromatografi afinitas adalah ligan yang terimobilisasi pada kolom.
• Sampel protein yang dilewatkan pada kolom akan berinteraksi secara spesifik dengan ligan.
• Protein target akan terpisah dari protein pengotor.
• Ligan berikatan kovalen dengan backbone matrix.
• Hanya enzim dengan afinitas spesifik yang akan terikat pada adsorben melalui interaksi dengan ligan.
• Setelah pengikatan, biomolekul target dapat dipisahkan dari ligan dengan cara elusi.

Syarat Fasa Diam

• Material pendukung harus inert (tidak bereaksi dengan ligan atau molekul target) dan hidrofilik.
• Contoh: Agarosa, sepharose, atau polimer dimodifikasi secara kimia.
• Stabil secara kimia terhadap pelarut dan eluen.
• Stabil secara mekanik dan dapat menahan tekanan selama proses.
• Aksesibilitas ligan harus sesuai dengan ukuran butiran material agar molekul target dapat mengakses ligan.
• Imobilisasi ligan spesifik pada material pendukung, menentukan daya tarik dengan molekul target berdasarkan interaksi spesifik. Contoh: ligan seperti antibodi, enzim, atau oligonukleotida.

Syarat Fasa Gerak

• Mendukung interaksi spesifik, menjaga kondisi yang memungkinkan interaksi spesifik antara molekul target dengan ligan. Biasanya menggunakan buffer tertentu untuk menstabilkan lingkungan biologis. Contoh: Buffer fosfat, buffer tris-HCl.
• Tidak mengganggu Interaksi, fasa gerak tidak boleh mengganggu interaksi ligan-molekul target, tetapi harus mampu menghilangkan pengotor. Biasanya menggunakan buffer dengan pH dan kekuatan ion tertentu.
• Elusi Molekul Target, untuk melepaskan molekul target dari fase diam, fasa gerak perlu dimodifikasi dengan menambahkan buffer elusi (elution buffer) untuk kompetisi atau mengubah pH/kekuatan ion. Contoh: buffer yang mengandung garam konsentrasi tinggi atau molekul kompetitor.

Mekanisme

• Proses pemisahan dimulai dengan pengikatan, enzim berinteraksi secara spesifik dan reversibel dengan ligan yang berfungsi sebagai fase diam
• Jika campuran protein dialirkan ke kolom yang mengandung ligan, enzim terikat pada ligan, sedang protein lainnya mengalir keluar.
• Enzim yang terikat pada ligan dapat dilepaskan (di eluasi) kembali dengan ligan, inhibitor, dan larutan buffer.

Uji Kemurnian

• Analisis Spektroskopi UV-Vis
• Elektroforesis Gel (SDS-Page)
• HPLC
• Analisis Warna
• Western Blotting
• ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Faktor yang Mempengaruhi

• Spesifisitas ligan
• Kondisi buffer
• Temperatur
• Waktu interaksi
• Konsentrasi garam
• Konsentrasi biomolekul

Aplikasi

• Pemisahan dan Pemurnian Protein: Memurnikan protein spesifik dari campuran kompleks.
• Deteksi dan Identifikasi Biomarker: Diagnosis penyakit dengan mengidentifikasi biomarker spesifik
• Penentuan Interaksi Antigen-Antibodi: Studi interaksi antigen dan antibodi, dasar untuk pengembangan vaksin dan terapi berbasis antibodi.
• Pembuatan Antibodi Monoklonal: Produksi antibodi monoklonal untuk terapi, diagnostik, dan penelitian.

Kelebihan dan Kekurangan

• Kelebihan:*
• Spesifitas tinggi
• Efisiensi pemurnian tinggi
• Berguna dalam berbagai aplikasi
• Proses mudah dan sederhana
• Kemudahan elusi
• Kekurangan:*
• Biaya tinggi
• Keterbatasan ligan
• Potensi denaturasi protein
• Durasi proses yang lama
• Keterbatasan kapasitas

Kesimpulan

• Kromatografi afinitas adalah teknik pemisahan dan pemurnian yang efektif untuk molekul biologi berdasarkan sifat kimianya.
• Meskipun beberapa keterbatasan, kromatografi afinitas lebih efisien dan mudah digunakan, memberikan hasil yang lebih baik dengan spesifitas yang tinggi, sehingga meningkatkan kemurnian produk akhir.