Histología 2024 - Tema 1. Introducción a la histología (5) - PDF

Tema 1 Introducción a la Histología Histología Ana Isabel García Guillén Grado en Odontología ÍNDICE CONTENIDOS Introducción a la Histología. Concepto y clasificación de los tejidos Métodos y técnicas histológicas: métodos generales de estudio de los tejido...

Tema 1 Introducción a la Histología Histología Ana Isabel García Guillén Grado en Odontología ÍNDICE CONTENIDOS Introducción a la Histología. Concepto y clasificación de los tejidos Métodos y técnicas histológicas: métodos generales de estudio de los tejidos bucodentales. Microscopía óptica. Microscopía electrónica. Técnicas para tejidos blandos. Técnicas para tejidos duros. 2 Histología Concepto Histología Estudio de la anatomía microscópica de las células y los tejidos humanos, animales y vegetales y cómo se organizan para la constitución de los órganos. ιστoς significa tejido y λoγια significa conocimiento Histopatología Estudio microscópico del tejido “enfermo” 3 Histología Tejidos Conjunto de células especializadas unidas para realizar una función específica. 2 componentes: células y matriz extracelular 4 Histología La célula La célula (del latín cellula, diminutivo de cella = celda, hueco) es: la unidad anatómica, funcional y genética de los seres vivos. Posee la capacidad de realizar las funciones vitales: respiración, nutrición, relación, reproducción 5 Célula Características de la célula 1. Autorreplicarse, manteniendo la 5. Obtener energía para sus información genética. procesos vitales. 2. Realizar la síntesis de 6. Digiere sustancias que toman del macromoléculas para su propia medio ambiente o de sus propios estructura. componentes. 3. Sintetizar y secretar moléculas 7. Realizar procesos catabólicos. que le permiten interaccionar con el 8. Respirar aeróbica y medio. anaeróbicamente. 4. Recibe señales del medio 9. Moverse (más notorio en ciertos ambiente, las procesa y emite tipos celulares). señales al medio 6  Clasificación de las células Forma: Está determinada básicamente por su función. Depende del citoesqueleto, pero puede variar a causa de las tensiones que ejercen las células contiguas, del estado nutricional, del estímulo hormonal y de agentes patógenos externos. Existe una variedad de formas: esféricas, planas, cúbicas, prismáticas, estrelladas. 7  Clasificación de las células 3. Cilíndricas: Células del 1.Planas: Células de la intestino. epidermis (piel), de la mucosa bucal, etc. 4. Poliédricas: Célula vegetal 2. Cúbicas: Hepatocitos (células (plantas). del hígado), tiroides, etc. 8  Clasificación de las células 5. Bicóncavas u ovaladas: 7. Alargadas o fusiformes: Glóbulos rojos o eritrocitos Miocitos (células musculares). (sangre). 6. Estrelladas: Neuronas (células del cerebro). 8. Filiformes: Espermatozoide (células masculinas). 9 Clasificación de las células 9. Esféricas: Ovulo (célula femenina). 10  Clasificación de las células Tamaño: El tamaño igualmente depende de la función. En el organismo humano hay células tan pequeñas como los linfocitos que miden 4 µ o tan grandes como ciertas neuronas que llegan a medir más de un metro. 11 Histología Tejidos Matriz extracelular: - Macromoléculas - Soporte de las células - Contiene el fluido que transporta los nutrientes para las células. - Elimina los productos de secreción y desecho. - Producido localmente por las células Durante el desarrollo del tejido, las células y su matriz se especializan en su función Órganos: formados por la combinación de los tejidos. La disposición precisa de los tejidos permite el funcionamiento de cada órgano y del 12 organismo en su conjunto.  Histología Tejidos Parénquima: conjunto de células responsables de la función del tejido Estroma: células con función de soporte 13 ¿Cómo estudiamos los tejidos? La observación de los tejido se puede hacer mediante siguientes aparatos Microscopía óptica Microscopía virtual Microscopía electrónica Métodos moleculares 14 Preparación del tejido Metodología Los tejidos y órganos son muy gruesos para su visualización Lo ideal es preservar el tejido es un estado lo más similar al de su condición en el organismo. Proceso de preparación puede eliminar las células lipídicas y generar una pequeña distorsión de la estructura celular 15 Preparación del tejido Soluciones crecientes de etanol Microtomo 16 Preparación del tejido 1º paso FIJACIÓN: para conservar la estructura de los tejidos/órganos y: ✓ Abolir el metabolismo celular ✓ Impedir la autolisis ✓ Destruir microorganismos patógenos ✓ Endurecer el tejido Fijador: Formalina diluida (formol) + buffers. 17 Preparación del tejido 2º paso INCLUSIÓN: inclusión en parafina para su posterior corte. Cuando la parafina se enfría, la muestra está preparada para su corte en el MICROTOMO. Después de la fijación: ✓ Se lava. ✓ Se deshidrata en soluciones alcohólicas en concentraciones crecientes (hasta 100%) ✓ Aclarado con Xileno para extraer el alcohol. ✓ Parafina líquida (caliente). 18 Preparación del tejido 3-10 μm – microscopio óptico CORTE Menos de 1 μm para microscopio electrónico 19 Preparación del tejido 3º paso TINCIÓN: se utiliza para poder observar al microscopio. Después de la parafina : ✓ Se extrae la parafina con xileno ✓ Se rehidrata mediante alcoholes en concentraciones decrecientes. ✓ Se tiñe con HEMATOXILINA, en agua. ✓ Se deshidrata con alcoholes. ✓ Se tiñe con EOSINA. Hematoxilina y Hematoxilina Eosina eosina Se coloca en un medio de montaje y se cubre con un 20 cubreobjeto de forma permanente. Preparación del tejido Otros fijadores: Por congelación: Isopentano (-170 ºC) enfriado con nitrógeno líquido. Ensayos enzimáticos Estudios de la estructura lipídica 21 Preparación del tejido Otras tinciones: Para poner en evidencias otros componentes de tejido. 22 Preparación de tejidos duros 1º paso FIJACIÓN: para conservar la estructura de los tejidos/órganos : Fijador: Formalina diluida (formol) + buffers. 2º paso DESCALCIFICACIÓN: eliminación de sales cálcicas para ablandar el tejido e incluirlo en parafina Solución de ácidos fuertes (Acido nítrico al 5-10% en agua Solución de ácido débiles (ácido fórmico al 90% en agua destilada). destilada). Fija y descalcifica. Tiempo: días y semana, según grosos de la muestra. Tiempo: 1 semana. Quelantes químicos: EDTA (semanas) 3º paso INCLUSIÓN Con este proceso el esmalte desaparece 4º paso TINCIÓN 23 Con este proceso el esmalte desaparece 24 Otro método para estudio de tejidos mineralizados 1º paso FIJACIÓN: para conservar la estructura de los tejidos/órganos : Fijador: Formalina diluida (formol) + buffers. 2º paso INCLUSIÓN: inclusión en metacrilato de gran dureza, sin descalcificar, para su posterior corte. Tiempo: 6-7días Corte con MICROTOMO MOTORIZADO con cuchilla de tungteno. Las secciones pueden observarse con luz común, luz polarizada o fluorescencia, sin colorear o coloreadas con tinción de rutina. 25 Método por desgaste Se utiliza para piezas dentarias fijadas o no. Se obtiene un lámina gruesa mediante una sierra y luego se pule con una piedra de Arkansas, primero de grano grueso y luego fino hasta obtener un espesor de 30µm, que permita el paso de la luz. No se utiliza tinción. Sobre ellos se pueden realizar microradiografías que permiten visualizar en donde hay sales de calcio. Láminas de 30µm Caries Desgaste 26 TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS Y CITOQUÍMICAS Tinciones ✓ Fundamento: Unión específica de colorantes a los tejidos. ✓ La tinción más utilizada es la Hematoxilina & Eosina - Colorantes BÁSICOS: - Colorantes ÁCIDOS: poseen una carga global poseen una carga global positiva (catiónicos +) y negativa (aniónicos -) y reaccionan con los reaccionan con los componentes aniónicos de componentes catiónicos la célula (ej: HEMATOXILINA). de la célula (ej: EOSINA). - Colorantes neutros: su carga global es neutra, colorean juntas o por separado diversas estructuras (ej: Giemsa). - Colorantes indiferentes: no tiene afinidad ni por los ácidos ni por los básicos (ej: Sudan para lípidos). 28  TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS Y CITOQUÍMICAS Tinciones EOSINA HEMATOXILINA Colorante ácido - y se une a Colorante básico + y colorea los estructuras básicas de la célula componentes ácidos de la célula (citoplasma) de tonalidad (núcleo) de color morado. BASOFILIA rosada. ACIDOFILIA Heterocromatina Filamentos citoplasmáticos ADN Componentes membranosos del ARN citoplasma Matriz del cartílago H E Fibras extracelulares Cualidad de los colorantes básicos: Metacromacia: Reaccionan con el tejido cambiando de color azul a rojo. Es por la presencia de polianiones que forman aglomerados poliméricos. Ej.: Azul de toluidina. Componentes cromótropos: Gránulos de histamina. 29  Tinción de PAS – ácido periódico-reactivo de Schiff Detecta los hidratos de carbono que se tiñen de rosa/magenta – glucógeno de las células hepáticas – mucina de las células caliciformes – membranas basales de tejido epiteliales, etc…. a) hematoxylin & eosine b) PAS for glycoproteins Detecta las hifas y esporas fúngicas Membrana basal Micrographs of epithelium lining the small intestine. Lumen (L) or the scattered mucus-secreting goblet cells (G) Hepatocitos 30 Cél. caliciformes Hifas micóticas  Colorantes y reacciones histológicas comunes Reactivo Resultado Hematoxilina Azul: núcleo, regiones del citoplasma; matriz de cartílago. Eosina Rosa: Regiones básicas del citoplasma; fibras de colágeno. Tricrómica de Masson Azul oscuro: núcleo; Rojo: músculo, queratina y citoplasma. Colorante de orceína para Pardo: fibras elásticas fibras elásticas. Colorante Weigert para Azul: fibras elásticas. fibras elásticas. Tinciones argénticas. Negro: Fibras reticulares Hematoxilina férrica Negro: Estriaciones de músculo, núcleos, eritrocitos Ácido peryódico de schiff Magenta: moléculas ricas en glucógeno y carbohidratos Colorantes de Wright y Se utiliza para tinciones deferenciales de Giemsa células hemáticas. Rosa: eritrocitos, gránulos de eosinofilos. Púrpura: núcleos de leucocitos, gránulos basofilos. Azul: citoplasma de monocitos y linfocitos. 31 Inmunohistoquímica FUNDAMENTO: Reacción específica entre antígeno y anticuerpo. Técnica que permite detectar in situ componentes celulares y extracelulares (antígenos) por medio de anticuerpos específicos (“inmuno”) empleando sistemas enzimáticos (“histoquímica”). Es un proceso automatizado y rápido de gran especificidad y alta afinidad debido a la capacidad que tienen los anticuerpos para reconocer a una moléculas y unirse a ellas. UTILIDAD: ✓ Diagnóstico y clasificación de tumores malignos indiferenciados. ✓ Marcadores predictivos y pronósticos de tumores (R- Her2). ✓ Identificación de agentes infecciosos en tejidos. ✓ Clasificación de leucemias y linfomas. ✓ Determinación del origen de tumores metastásicos. 32 Inmunohistoquímica ❑ Ag. (antígeno)= sustancia que queremos detectar en una sección tisular o frotis celular. La mayoría son proteínas. ❑ Ac. (anticuerpo)= glicoproteína en forma de Y sintetizada por la células plasmáticas. Se obtienen de conejos o ratas ANTICUERPOS POLICLONALES: El Ag. se inyecta al animal (Conejo +++) Producción de Ig. contra los diferentes epítopos del Ag. Suero extraído contiene una mezcla de Ig sintetizadas por distintos clones de células plasmáticas (Policlonal). Ventaja: Alta sensibilidad (porque se pueden detectar varios epítopos del Ag.) Inconvenientes: – Especificidad variable (reacciones cruzadas). 33 Inmunohistoquímica ❑ Ag. (antígeno)= sustancia que queremos detectar en una sección tisular o frotis celular. La mayoría son proteínas. ❑ Ac. (anticuerpo)= glicoproteína en forma de Y sintetizada por la células plasmáticas. Se obtienen de conejos o ratas ANTICUERPOS MONOCLONALES: Fusión de células plasmáticas secretoras de Ig. del bazo de ratones inmunizados + células tumorales de mielomas no secretoras de Ig. Se obtiene un HÍBRIDO: ✓La célula plasmática normal aporta la capacidad de sintetizar una Ig. específica. ✓La célula tumoral aporta la inmortalidad. Ventajas: ESPECIFICIDAD + (reconoce un solo epítopo), REPRODUCTIBILIDAD y DISPONIBILIDAD. Inconvenientes: Falsos negativo. 34 ¿Cómo se detecta? El complejo Ag-Ac no es visible con el M.O. DETECCIÓN: Conjugar el anticuerpo con una molécula señal que puede ser: – Un marcador fluorescente – microscopio de fluorescencia (marcaje no permanente ya que la luz emitida por el marcador fluorescente se desvanece con el tiempo). – Un marcador enzimático (peroxidasa, fosfatasa alcalina) – microscopio óptico (se mantiene en el tiempo). 35 Detección DIRECTA Ac. primario Anticuerpo marcado con fluorocromo o enzima. Inconvenientes: - Necesidad de conjugar una enzima a cada anticuerpo, es muy costoso. - Ac. primario debe emplearse en alta concentración. 36 Detección INDIRECTA Ac. Primario y secundario El marcador va unido a un Ac. secundario que reconoce al Ac. primario. Ventajas: - Necesita una cantidad más diluida de anticuerpo primario - Mayor sensibilidad 37 Detección INMUNOFOSFATASA ALCALINA Piel Piel: Melanoma INMUNOPEROXIDASA INMUNOFLUORESCENCIA Mucosa cervical 38  Hibridación in situ FUNDAMENTO: Método que localiza el ARN mensajero o el ADN mediante la hibridación: capacidad de una molécula monocatenaria de interactuar con secuencias complementaria conocidas (sonda de nucleóticos) marcadas con isótopos radioactivo o biotina. -Las sondas radioactivas se detectan y visualizan con autorradiografia. -Las sondas con biotina se detectan con inmunocitoquímica. Si la cantidad de ARN o ADN es pequeño se utiliza técnicas de amplificación en cadena de polimerasa “PCR” Actualmente se están utilizando colorantes fluorescentes, llamada técnica de hibridación in situ con fluorescencia, “FISH”. 39 Hibridación FISH de HER2 en cáncer de mama El panel de la derecha muestra células de un tumor de mama con amplificación del gen HER2 (puntos rojos). A la izquierda podemos ver células de un tumor sin amplificación. La paciente de la izquierda se beneficiará del tratamiento con TRASTUZUMAB (anticuerpo monoclonal dirigido contra HER2). 40 Microscopía MICROSCOPIO ÓPTICO MICROSCOPIO ELECTRÓNICO MICROSCOPÍA VIRTUAL 41  Microscopio óptico El microscopio más simple es la lupa, pues el objetivo no Cuánto menor LR, más poder del es “aumentar” sino ver lo invisible. microscopio Lupa de muchos aumentos x300, x500, x1000 no permite ver las células, en cambio un microscopio de x20, sí! ¿Por qué? Porque no depende del aumento sino del poder o límite de resolución (LR) que es la distancia mínima a la que se pueden discriminar dos puntos: 42  Resolución Pero la resolución no solo depende del sistema óptico, sino, de la longitud de onda, calidad de fijación , del corte e intensidad de tinción. Nosotros utilizamos microscopios de campo claro (microscopio óptico) y la resolución máxima es de 0,2 µm. 43  Los oculares son las lentes que forman la imagen Microscopía que observaremos con nuestros ojos. En los microscopios más básicos al menos uno de los oculares puede regularse, que consiste alejarse o acercarse al objetivo, permitiendo ajustar el enfoque a las condiciones de visión, dioptrías, de cada observador. Los objetivos son las lentes que reciben la imagen directamente de la sección histológica y son los elementos más importantes del microscopio. Los microscopios ópticos poseen revólver donde se encuentran varios objetivos. Cada uno de ellos posee lentes que permiten diferentes aumentos. Los aumentos de los objetivos más usados son de 10x, 20x, 40x y 100x. Cuando se usan objetivos de 100x es necesario emplear un aceite de inmersión, que se añade entre el objetivo y la muestra. Esto es debido a que la refracción de la luz es alta en el aire y provoca alteraciones en la imagen. El aceite de inmersión reduce la refracción permitiendo imágenes mucho más nítidas. 44  Platina: Es la plataforma donde se coloca el portaobjetos con nuestro tejido. Posee un dispositivo Microscopía para sujetar el portaobjetos, el cual se puede desplazar en el plano de la platina, movimiento controlado manualmente. Rueda de macro y micrométrica: el enfoque de la muestra se consigue variando la distancia entre la muestra y el objetivo, mediante dos ruedas denominadas macrométrico y micrométrico, la primera permite movimientos amplios ascendentes y descendentes de la platina y la segunda ajustes finos Condensador: Lente que concentra y focaliza la luz proveniente de la fuente sobre la sección de tejido. Lámpara: proporciona la luz que atraviesa la sección del tejido. 45 ¿Cómo se calcula el aumento? 10x - El AUMENTO TOTAL que permite un microscopio óptico se calcula multiplicando la magnificación que produce el objetivo por la que x produce el ocular. - Por ejemplo, si estamos usando un objetivo de 40x y un ocular de 40x 10x, el resultado final será de 400x, es decir, vemos la muestra 400x aumentada 400 veces. Usando microscopios ópticos avanzados se consiguen unos 1000-1500 aumentos. Artefacto: imperfecciones de la preparación causadas por alteraciones de todo el procesamiento previo. 46 Interpretación de estructuras 3D en 2D 47 Microscopio electrónico Sirve para observar estructuras debajo del limite de resolución del microscopio óptico. Hay dos tipos : Microscopio electrónico de transmisión (MET) y de barrido (MEB). En histología permite ver la ultraestructura celular (orgánulos, membranas, etc….). Limite de resolución