Hémostase1 PDF

A. Principes généraux L'hémostase est l'ensemble des mécanismes qui concourent à l'arrêt du saignement au niveau d'une brèche vasculaire. Ce système peut prendre naissance n'importe où dans le corps (foie, poumon, rein, cerveau …). Il est important no...

A. Principes généraux L'hémostase est l'ensemble des mécanismes qui concourent à l'arrêt du saignement au niveau d'une brèche vasculaire. Ce système peut prendre naissance n'importe où dans le corps (foie, poumon, rein, cerveau …). Il est important non seulement en physiologie mais aussi en pathologie. Il permet la réparation vasculaire. Il y a de nombreuses pathologies qui impliquent des lésions des petits vaisseaux et donc l'hémostase est constamment sollicitée. Le vaisseau peut être agressé par des toxines, par des agents infectieux, par des anticorps. Plus il y a de l'in ammation, plus le processus d'hémostase est sollicité. L'étude de ce système a permis le développement de médicaments évitant le phénomène de thrombose, que ce soient des antiplaquettaires ou encore des anticoagulants. C'est un processus qui se met en place au niveau des petits vaisseaux, au niveau cutanéo-muqueux. Il n'y aura pas d'hémostase en cas de lésion de l'artère fémorale ou de la carotide (elle ne peut pas arrêter un saignement au niveau fémoral ou carotidien). Elle agit au niveau des organes et des petits capillaires. L'exemple typique est l'arrêt d'un saignement dû à une lésion cutanée. Ce processus de réparation peut également se mettre en place sans qu'il y ait de section cutanée (brèche vasculaire). Si un vaisseau est agressé, les mécanismes de l'hémostase essayeront de limiter la lésion. On distingue principalement 3 étapes : - hémostase primaire - Coagulation - Fibrinolyse (réparation, dégradation de la brine pour retrouver un vaisseau normal) La lésion (altération du vaisseau) est le signal d'initiation de l'hémostase. L'hémostase primaire est la première étape du phénomène de réparation. Elle permet le recrutement des cellules de l'in ammation (leucocytes, polynucléaires, mastocytes), de réparer la lésion et donc de rétablir la continuité vasculaire. Elle met en œuvre les plaquettes. Cette étape n'est pas encore consolidée : le caillot (en partie constitué de brine) est assez fragile car il est principalement constituée de plaquettes agrégées. Il sera ensuite renforcé lors de l'étape de la coagulation grâce à la brine. La brine est composée de longues bres qui enchâssent le caillot fragile. L'hémostase n'est pas un processus isolé, elle est intriquée avec des phénomènes in ammatoires. Un vaisseau est formé de couches successives. La 1ere surface importante pour le contrôle de l'hémostase est la mono couche de cellules endothéliales située sur un sous- endothélium. Ensuite se trouvent, plus en profondeur, des cellules musculaires lisses, une lame élastique externe et une adventice Le sous endothélium est une notion importante : lors d'une lésion vasculaire, l'endothélium se rompt et le sang entre en contact avec le sous-endothélium ou avec la matrice extracellulaire et le collagène, et c'est ce contact-là qui initie le processus de l’hémostase. Pour schématiser ce phénomène voici une coupe sagittale schématique d'un vaisseau sanguin NORMAL. La paroi des cellules endothéliales est étanche ou au moins semi perméable. A l'état normal, les globules rouges circulent au centre et repoussent à la périphérie les plaquettes à la surface de l'endothélium. Les globules rouges exercent une pression sur les plaquettes pour qu’elles puissent exercer leur fonction. Ils les aident à patrouiller à la surface de la cellule endothéliale. Elles essayent de repérer les défauts vasculaires. C'est très important car l'anémie crée un risque hémorragique. Il y a moins de globules rouges, qui exercent donc une pression insu sante sur les plaquettes. Elles ne sont pas repoussées e cacement sur les parois. Autrement dit, un patient anémique risque de saigner plus abondamment qu'un patient non-anémique en cas de section vasculaire. Une coupe sagittale schématique d'un vaisseau sanguin SECTIONNÉ La rupture d'une couche endothéliale et sous-endothéliale induit cette notion de fuite sanguine, qui met en contact des molécules que les plaquettes n'ont pas l'habitude de rencontrer à l'état normal (collagène, laminine, lame élastique, bronectine). Cette rupture vasculaire conditionne ffi fl fl fi fl ffi fi fi fi fi fi  immédiatement le fonctionnement des plaquettes. Les plaquettes disposent donc de récepteurs pour leur permettre de détecter ces molécules exposées et possèdent tout l’équipement nécessaire pour adhérer à ces molécules. Elles pourront donc ensuite colmater progressivement la brèche vasculaire. 1. L'hémostase primaire La brèche fait se rencontrer les plaquettes et la matrice extracellulaire, ce qui les active. Ces plaquettes ont un pouvoir adhésif très important. La première étape de colmatage, de réparation conduit à une adhésion des plaquettes au sous-endothélium et à la matrice. On observe également un rétrécissement de la lumière vasculaire (vasoconstriction pour perdre le moins de sang possible). On a progressivement la formation d'un caillot/clou plaquettaire. Ce caillot est initié par la première phase d'adhésion à la matrice. Il grandit progressivement pour obturer la brèche vasculaire grâce à un processus d'adhésion mais également d'agrégation plaquettaire (les plaquettes vont s'unir les unes aux autres). Au début, l'écoulement est rouge car les globules rouges peuvent sortir dans le milieu extérieur. Au bout de quelques minutes, la couche de plaquettes est formée donc les globules rouges ne peuvent plus passer. On a alors essentiellement un écoulement de plasma et de liquide (écoulement jaunâtre). A terme, le caillot se consolide pour mettre n à l'écoulement : c'est la coagulation (mise en place d'un caillot brino-plaquettaire). Il. L'hémostase secondaire Cette étape a besoin de l'hémostase primaire, c'est-à-dire de l'activation de cellules. L’activation cellulaire provoque une modi cation de la membrane cellulaire des plaquettes qui peut conduire à un phénomène de coagulation. L'hémostase secondaire, ou coagulation se traduit par le renforcement et l'étanchéité du clou plaquettaire. Les facteurs de coagulation s'activent et conduisent à la formation de brine. Ces facteurs de coagulation ont besoin d'une surface pour s'ancrer. Évidemment, ces surfaces ne sont pas exposées à l'état normal. La brine s'insère alors dans le clou plaquettaire entre les plaquettes pour le consolider et donc le rendre totalement hermétique. La prof fait l'analogie de la brine avec le ciment. Ceci est essentiellement le fruit d'une cascade de coagulation. Une série de protéases s'activent les unes après les autres et conduisent à la formation de brine à partir de brinogène. La consolidation du caillot brino-plaquettaire est l’étape ultime. Il est de plus en plus solide et de plus en plus stable, ce qui permet d'entamer la réparation de la section vasculaire. Ensuite, les cellules in ammatoires investissent (=pénétrer) ce caillot pour recréer la continuité vasculaire. C'est un mécanisme e cace. Ce processus est en équilibre, il est contrôlé. Dans le sang, des inhibiteurs physiologiques essayent de limiter ce processus. Attention, en cas de sténose (rétrécissement des vaisseaux sanguins), les conditions de fortes pressions sont favorables à l'action des plaquettes. Si une lésion apparait, le caillot peut être excessif, obstructif et provoquer un arrêt de la circulation (ischémie). C'est un cas d'hémostase pathologique. Cela peut se passer au niveau d'une artère coronaire, fémorale ou au niveau de vaisseaux plus petits participant à l'oxygénation des poumons ou au fonctionnement hépatique. Il existe des systèmes protecteurs comme la brinolyse endogène (pas très rapide) ou des inhibiteurs physiologiques (assez lent aussi). Aucun système ne nous permet de lutter contre l'hémostase excessive aigue qui peut conduire à des thromboses. Ainsi, les premiers traitements développés pour lutter contre l’infarctus du myocarde sont des molécules qui s'opposent à l'agrégation des plaquettes. Le but est d'éviter toute récidive. On est plus dans une optique de prévention secondaire que de prévention primaire. La plupart des individus qui ont fait un infarctus du myocarde sont traités par la pose d'un stent en complément d'un traitement antiplaquettaire au long terme. L'hémostase est un système assez ubiquitaire, qui intervient au niveau de tous les tissus. Il faut bien comprendre qu'il y a plusieurs types de thromboses : - artérielles : impliquent les plaquettes → traitement antiplaquettaire - veineuses : impliquent la coagulation → traitement anticoagulant fi fi fl ffi fi fi fi fi fi fi fi fi  III. La brinolyse et cicatrisation L'étape ultime est la cicatrisation. Progressivement, les cellules de la réparation (notamment les cellules in ammatoires), envahissent le caillot, le dégradent (= brinolyse) et reforment de la matrice pour permettre aux cellules endothéliales de régénérer la continuité vasculaire. On retrouve à la n un vaisseau normal. Il n'y a alors plus de fuite sanguine, plus d'activation d'hémostase, la paroi vasculaire est à nouveau étanche. Il y a un rétablissement de la continuité vasculaire. B. L'hémostase primaire I. Les acteurs de l'hémostase primaire Les éléments qui conditionnent cette hémostase primaire sont : - Le vaisseau avec le collagène de la couche sous-endothéliale impliqué dans l’adhésion. - Les plaquettes, petites cellules anucléées très ef caces et très fonctionnelles (peuvent se contracter, libérer leur contenu…) - Des protéines plasmatiques : Facteur Willebrand (VWF) et le brinogène Le facteur de Willebrand (VWF) est une protéine synthétisée par la cellule endothéliale présente au niveau du mégacaryocyte (cellule précurseur des plaquettes). Elle se trouve dans le sang circulant et dans les matrices extracellulaires. Elle a plusieurs fonctions, elle est capable de transporter le facteur 8 dans la circulation, est multimérique et elle peut s'étendre. Elle a une forme globulaire dans la circulation. Dès qu'elle subit l’effet des forces cisaillantes, elle s'étire et se met au contact du sang (des plaquettes notamment) et de nombreux domaines de liaisons. La forme globulaire du facteur de Willebrand est peu active pour l'hémostase primaire alors que la forme étendue est particulièrement active. Le collagène de la paroi vasculaire est très accessible et super ciel au niveau du sous endothélium. Le sang le rencontre très facilement après une lésion vasculaire. Il est très important pour l'hémostase primaire. Il existe certaines pathologies pour lesquelles les individus ont des dé cits en plaquettes ou tout simplement des plaquettes inef caces. Ils sont alors exposés à un grand risque de saignement, principalement des saignements cutanéo-muqueux. Ils saignent beaucoup du nez par exemple. Cela s'explique par le fait que les vaisseaux du nez sont petits et que la zone est fortement exposée au milieu extérieur. Ces individus perdent beaucoup d'hémoglobine car ils saignent en permanence. Tout ça pour dire qu'il existe bien des maladies héréditaires qui touchent l'hémostase primaire. a. La cellule plaquettaire 1. Généralités Les plaquettes sont des débris membranaires très petits, des fragments de cytoplasme d'une très grosse cellule médullaire : le mégacaryocyte. La plaquette est toute petite par rapport à un globule rouge (diamètre 3 micromètres). On remarque des zones un peu plus foncées, avec beaucoup de granules, qui sont particulièrement importantes dans l'hémostase primaire car elles ampli ent le processus. Elle ne contient pas de noyau. fi fl fi fi fi fi fi fi fi fi  Les plaquettes sont discoïdes, rondes, elles ont un cytosquelette remaniable, et elles peuvent émettre des prolongements, ce sont des fragments de cytoplasme. La plaquette est une cellule qui a une grosse réserve de membrane à l'intérieur qui peut très facilement déverser ses grains. À l'intérieur de la plaquette on peut identi er au moins 4000 à 6000 protéines, un peu de RNA, des ribosomes, des éléments du cytosquelette, des composés membranaires, beaucoup de mitochondries, et beaucoup de granules (granules alpha, granules denses...). La production plaquettaire : Le mégacaryocyte arrête de se diviser à une certaine étape de sa maturation et grossit. C'est une grosse cellule qui synthétise beaucoup de protéines, avec un cytoplasme qui devient granulaire. Le mégacaryocyte est présent au niveau de sinusoïdes vasculaires et émet de longs prolongements (+/- volumineux appelés pro-plaquettes) qui se transforment progressivement en plaquettes en fonction du ux. On a dans un premier temps la formation de pro-plaquettes qui se transforment ensuite en plaquettes dé nitives, notamment dans le poumon. Le poumon est un lieu d'enrichissement en plaquette très important. Les plaquettes sont riches en cytosquelette et en granules, et ont pour fonction principale de se déformer. Les plaquettes contiennent beaucoup de facteurs de croissance, de facteurs de coagulation, de substances anti bactériennes (rôle dans la défense anti infectieuse)... Les plaquettes sont des réservoirs à molécules de la réparation. Il y a plein de récepteurs à la surface de la plaquette. Les propriétés régénératrices de ces cellules sont utilisées en chirurgie orthopédique et esthétique. Des instituts ont développé des petits appareils pour préparer du PRP (plasma riche en plaquettes). Ils l’injectent soit dans les articulations, soit au niveau de la peau pour favoriser la trophicité des tissus ciblés et pour permettre d'améliorer la réparation. C'est également utilisé pour traiter les tendinites des chevaux. 2. Les propriétés plaquettaires Il est important de retenir que les plaquettes sont remplies de granules. Celles-ci ont une forme discoïde au repos qui est maintenue par des microtubules. Ces granules sont obtenus du mégacaryocyte mais aussi beaucoup d'échanges avec le milieu extérieur: molécules captées à partir de la circulation (90% de la sérotonine circulante est contenue dans les plaquettes). Dans les grains, il y a 2 éléments essentiels qui sont des voies d’activation de la plaquette. Il y a différentes sortes de granules : 1. Les granules denses : Il y en a très peu (4 à 8 par plaquettes) mais elles sont très importantes pour la réparation. Elles permettent de solidi er le caillot. En effet, elles sont très riches en ADP. Cet ADP active les plaquettes voisines. Il majore localement le processus d’activation. On retrouve également beaucoup d'ATP, de calcium, de sérotonine... Toutes ces molécules permettent d'ampli er l'hémostase primaire et secondaire. Le développement de molécules qui bloquent l'interaction entre l'ADP et le P2Y12 (récepteur à l'ADP) est un véritable tournant dans la prise en charge des patients. Ces molécules vont bloquer cette voie d'ampli cation. Cette voie d'ampli cation se manifeste quelle que soit la voie d'activation de la plaquette fi fi fi fi fi fi fl  2. Les granules alpha : Elles sont en nombre bien plus important (40 à 80 par plaquettes) et contiennent énormément de molécules de la réparation: facteurs angiogéniques, pro-angiogéniques, anti-angiogéniques, chemokines …. De nombreuses études montrent que le contenu de ces granules alpha peut in uencer de manière conséquente le processus d'hémostase. En ME: On a des mitochondries, du glycogène, et les cellules sont trouées (il y a énormément de canaux à l'intérieur de cette cellule). Les canaux peuvent fusionner pour permettre la fusion des grains : c'est ce que l'on appelle le système canaliculaire ouvert. Il permet aux plaquettes de libérer le contenu des grains dans la circulation. Les vacuoles vides sont des réserves de membrane pour que la plaquette puisse s'activer et étirer des phyllopodes qui atteignent toute la surface nécessaire. On peut diviser l'hémostase primaire en 3 étapes : - adhésion (principalement au collagène ) - activation - agrégation b. Le collagène et l'adhésion La plaquette est une cellule gendarme qui est capable d'être le « sensor » de son environnement et notamment de protéines du sous-endothélium (en particulier du collagène). On remarque une disposition de collagène sous-endothélial et une adhésion de ces plaquettes sur le collagène. Les plaquettes sont équipées pour y adhérer. Le collagène, positionné en hélice, est le substrat de choix. La plaquette est équipée en récepteurs susceptibles de reconnaitre le collagène. Ces récepteurs peuvent soit adhérer directement à une intégrine (qui comporte une chaîne alpha et une chaîne bêta) comme la GpVI et l'a2ß1 ou par adhésion indirecte de la glycoprotéine GP1b-V-IX (protéine triédrique) par liaison avec le collagène via le facteur de Willebrand Il existe des moyens de favoriser l'interaction plaquette/Willebrand in vitro, notamment grâce à un antibiotique particulier : la ristocétine. Elle est utilisée tous les jours dans les laboratoires qui explorent les plaquettes au Willebrand. Si on met de la ristocétine dans un tube qui contient des plaquettes et du Willebrand, on crée immédiatement une interaction entre la GP1B et la plaquette. De nos jours, elle n'est plus utilisée comme traitement car elle provoque une diminution du compte plaquettaire dans le sang comme effet secondaire. On a également un autre récepteur, c'est la GP 2B 3A dont l'intégrine est l'aIIBß3 (qui est spéci que à la plaquette, impossible de la trouver ailleurs, 40000 à 80000 exemplaires / plaquette), elle est présente à la surface de la plaquette, elle est capable de lier le Willebrand mais ce n'est pas son facteur préférentiel. Sa fonction majeure est de lier le brinogène et de lier deux plaquettes entre elles (une fois qu'elle a changé de conformation). C'est cette intégrine qui supporte l'agrégation plaquettaire. De nombreux développements pharmaceutiques recherchent des molécules qui bloquent l'interaction entre la GP1b et le collagène. On a déjà des molécules qui s'opposent à alIBß3. C'est donc un champ d'investigation intéressant. On recherche des molécules qui réduisent le risque hémorragique tout en favorisant l'effet antithrombotique. fi fi fl c. Le facteur de Willebrand (VWF) Le VWF est polymérique, globulaire, et circule dans le sang. C'est une très grosse protéine. Elle est importante pour l'hémostase primaire. Il se lie au collagène. C'est la « tranche de jambon dans le sandwich », elle fait le lien entre la plaquette et le collagène. Cette protéine présente des domaines d'interaction avec le collagène, avec la GPIb mais aussi avec l’alIBβ3. C'est un point clé de l'hémostase primaire de comprendre ce qui se passe entre le VWF, le collagène et la plaquette. Un individu dé citaire en VWF est atteint de la maladie de Willebrand. Il risque de saigner beaucoup. A l'inverse, l'excès de VWF est mauvais pour les petits vaisseaux, les vaisseaux cérébraux et coronaires ; et peut conduire à des thromboses. La conformation du VWF : C'est la forme globulaire du VWF qui circule dans le sang. Elle ne peut pas exposer au sang les domaines d'interaction avec la plaquette. Pour avoir une interaction possible, il faut que le VWF soit en contact avec du collagène et qu'il soit étiré. En fait, dès qu'il y a une lésion, le VWF se lie au collagène et (sous l'effet des forces de cisaillement dans les petits vaisseaux) s'étirer. Cela met à nu des domaines d'interaction avec la plaquette. L'effet de l'immobilisation et des forces de cisaillement sur l'af nité de VWF pour la GPIb : On voit donc ici que la forme globulaire (forme présente dans le sang circulant) s'étire pour donner une longue chaine lorsqu'il est soumis à une forte pression, comme dans les capillaires par exemple. On peut le voir en ME: on voit alors les chaînes de facteurs Willebrand. Ce dernier est polymérique, il est également protéolysé à la surface de l'endothélium pour éviter qu'il soit trop gros. S'il est trop grand, il captera tellement de plaquettes que des microthrombies se formeront. Il y a une vraie régulation de la taille du VWF à la surface de l’endothélium. Lorsque le VWF est sous forme globulaire il n'expose pas de site de liaison aux plaquettes (la glycoprotéine GP1b), alors que s'il est sous forme étendue, il est capable de modi er sa conformation pour pouvoir lier la plaquette (exposer des sites de liaison). C'est un des premiers mécanismes qui concourent à l'adhésion. En fait la GPIb permet de lier la plaquette mais ce n'est pas une liaison irréversible. Donc la plaquette continue à rouler jusqu'à s'immobiliser sur la matrice de collagène. La forme globulaire a donc une faible af nité avec les plaquettes contrairement à sa forme étirée. A retenir : - VWF globulaire circulant → Faible af nité pour les plaquettes - VWF étiré→ Forte af nité pour les plaquettes II. L'adhésion La plaquette peut aussi adhérer à de la bronectine, à de la laminine, à du brinogène, à de la vitronectine...elle est équipée pour adhérer à beaucoup de molécules. Les récepteurs qui sont fortement exprimés sont des récepteurs pour le collagène. On a à peu près 70 000 copies de l'allBß3, 25 000 copies de la GPIb à la surface d'une plaquette. Pour les récepteurs à des intégrines comme l'⍺2-βl on a beaucoup moins de copies (1000-2000) donc on voit bien que le plus important reste quand même cette interaction avec le collagène. fi fi fi fi fi fi fi fi Ces quatre facteurs sont importants, et on peut observer un mécanisme un peu plus moléculaire sur les schémas ci-dessous : On observe le collagène qui est brillaire. Ce que peut voir également c'est que le facteur de Willebrand est une protéine qui circule dans le sang (donc on en a plein), et lorsqu'une lésion de collagène est mise à nue: le Willebrand adhère au collagène (il a des sites de liaison au collagène). Étant donné qu'on est dans un petit vaisseau (pas d'intérêt dans les gros vaisseaux) ce Willebrand s'étire (ce qui est dû aux forces forces de cisaillement). Pour cette interaction, un facteur est majeur: la GP1B-V-IX (spéci que à la plaquette, à retenir ++). Le « GP» pour glycoprotéine, « 1B V IX» parce qu'elle est trimérique. ETAPE 1 Lors d'une lésion vasculaire, il y a une exposition au sang du sous endothélium et du collagène. Le VWF est ici représenté par une succession de monomères. Il se lie donc au collagène en cas de blessure vasculaire et il s'étire. ЕТАРЕ 2 La plaquette arrive et se lie au FWB étiré. Pour que le VWF puisse être actif il doit s'allonger. Il est étiré dans les vaisseaux dû aux fortes forces de cisaillement, ce qui permet aux plaquettes d'adhérer sur ce facteur de Willebrand. La plaquette se lie au VWF par sa Gp1B. C'est un phénomène de freinage de la plaquette qui circule dans le sang. ЕТАРЕ 3 La plaquette roule et se xe au collagène du sous-endothélium via l'intégrine ⍺2β1 et la Gp VI. La GpVI est une glycoprotéine peu exprimée par la plaquette mais importante. Les individus dé citaires en GpVI saignent beaucoup car leurs plaquettes ne peuvent pas adhérer au collagène. En résumé sur le schéma, on a : - Le facteur de Willebrand qui est étiré (n'est plus globulaire lorsqu'il est lié au collagène) - On a une plaquette qui arrive (cellule sensor) - La Gp1B V IX - La plaquette : l'interaction Willebrand-GPIB est une façon de freiner la plaquette sur le vaisseau. La plaquette roule ensuite puis on aura une adhésion dé nitive beaucoup plus solide qui met en œuvre à la fois la GP VI et l’⍺2ß1. III. L’activation On a vu l'adhésion, ainsi que l'importance du facteur de Willebrand, de la GPIB, du Gp6. À partir du moment où la plaquette est immobilisée, et où elle est dans un environnement de stimulation, elle va s'activer sous l'effet du collagène et de son adhésion, elle va réorganiser son cytosquelette, libérer ses grains. Elle s'active également parce qu'elle est dans un environnement propice à son activation : environnement du caillot riche en ADP. Elle va libérer ses grains qui contiennent également beaucoup d'ADP/ATP (ces nucléotides sont des stimulateurs importants de la plaquette). Cette immobilisation de la plaquette va la rendre sensible à d'autres agonistes/activateurs. Il y a donc une mise en jeu d'autres récepteurs que celui du collagène comme l'ADP, la thrombine, l'adrénaline … a. Substrats de l'adhésion Ce schéma-là montre la GPVI, un récepteur au collagène, qui est fortement liée au FcRy. Donc on répète, tout d'abord liaison au Gplb qui freine la plaquette puis liaison au GpVI fi fi fi fi fi qui immobilise. Ce couple de récepteur (GpVI / FcR ) est capable d'induire un processus de signalisation qui va introduire des kinases. Cela va entrainer la phosphorylation de résidus tyrosine, sur lesquels se xe la protéine SYK entrainant le cycle de signalisation intracellulaire impliquant la Phospholipase C 2. Cela va aboutir à la libération de calcium, à l'activation des intégrines et à la réorganisation du cytosquelette par la plaquette. b. Agonistes solubles Toutes les interactions vont conduire à des signaux intra cellulaires. On a deux types d'activation. Il faut bien faire la différence entre ce qui correspond à la matrice (collagène) et tout ce qui gravite autour de la plaquette qui est soluble et qui peut activer la plaquette. Cette activation peut se faire soit par l’intermédiaire de substrats de l'adhésion (collagène) (interaction avec la matrice) ou des agonistes solubles (thrombine, ADP, adrénaline, thromboxane A2...). Dans l'environnement des plaquettes, les agonistes solubles vont pouvoir les solliciter par leurs récepteurs et les activer. Toutes les plaquettes ne sont pas activées (seulement celles au coeur de la lésion). Grâce à la découverte de ces agonistes solubles, on a pu découvrir des anti-plaquettaires qui bloquent le récepteur à l'AMP. Ce sont des molécules anti thrombotiques très utilisées. Par exemple, si un patient arrive pour un syndrome coronaire aigüe, il aura peut-être besoin d'une pose de stent. Un des gestes importants pour que l'intervention se passe au mieux est de bloquer l'activation des plaquettes. Car la pose d'un stent crée une lésion. L'ADP est la voie d'ampli cation majeure. Les récepteurs de l'ADP sont très importants (+ ++). Beaucoup de drogues bloquent l'interaction entre l'ADP et le récepteur à l'ADP (appelé P2Y12). P2Y12 est un récepteur purinergique extrêmement important. L'ADP est contenue dans les granules plaquettaires. Lors de l'activation, l'ADP est délivrée sur le site lésionnel. Si on bloque l'effet de l'ADP, il y a un blocage d'une voie très importante dans l'activation des plaquettes. Cela entraine un saignement plus important, mais c'est intéressant lorsque l'on veut éviter le risque de thrombose. Le clopidogrel est un anti-P2Y12. C'est un inhibiteur à l'ADP, et donc un antiagrégant plaquettaire (évite l'ischémie). Tous les patients qui vont avoir une pose de stent sont traités par des anti P2Y12. A ce jour, il n'existe pas de médicaments contre les récepteurs à l'hémoglobine. Le Thromboxane A2 : Le thromboxane A2 est une molécule qui est produite par la plaquette, et donc une voie métabolique qu’on peut bloquer. La production du thromboxane A2 est une véritable voie métabolique qui intervient suite à l'augmentation de calcium dans la plaquette, qui active la phospholipase A2 etc. Pour bloquer l'activation plaquettaire par le thromboxane A2, on utilise de l'aspirine (très utilisé en cardiologie). Quand on prend de l'aspirine on bloque la production de thromboxane A2 par la plaquette. L'aspirine est donc un antiplaquettaire. Ce n'est pas un antithrombique très puissant. Les patients qui ont fait un infarctus se voient prescrire une bithérapie: de l'aspirine associé au clopidogrel. Cela inhibe totalement l'activation plaquettaire et fait en sorte que le risque de récidive soit minime. On n'a pas de molécule qui bloque le côté matrice. On n'a pas de molécule qui bloque l'interaction entre le GP1b et le collagène. Mais on a des molécules très ef caces pour bloquer l'action des agonistes solubles. Il faut bien comprendre que l'ADP est sécrétée par les plaquettes alors que le thromboxane A2 est produit par les plaquettes. fi fi 𝛾 𝛾 fi  La thrombine : Cette molécule se lie à 2 récepteurs. Les récepteurs aux agonistes solubles sont donc des sites intéressants. On remarque nalement un récepteur négatif, qui permet la régulation de l'activation des plaquettes par la prostacycline produite par l’endothélium. C'est donc un récepteur inhibiteur. La prostacycline (PG12) est inhibitrice de l’activation plaquettaire et induit un effet vasodilatateur. Elle envoie des signaux via une protéine Gs pour augmenter l'AMPc et freiner l'activation plaquettaire. Lorsque les granules ont toutes été sécrétées, les processus de signalisation vont permettre à l'intégrine a2Bβ3 de s'activer. Le phénomène d’activation des intégrines plaquettaires est similaire à celui chez les leucocytes. L'a2Bβ3 est spéci que à la plaquette (a2Bß3 totalement spéci que à la plaquette comme la GpIB). La régulation inhibitrice des plaquettes : - La prostacycline → utilisée pour calmer une suspension plaquettaire avant une analyse par exemple. - Le NO qui induit la formation de GMPc qui temporise (ralentir) la plaquette. On a des pathologies concernant le système d'activation mais on n'a pas de pathologies concernant le système d’inhibition. Ampli cation de l'activation : À l'état de base, la plaquette est discoïde et lisse. Elle se modi e lorsqu'elle s'active, elle émet des prolongements (= lopodes) pour essayer de lier les molécules et de resserrer le caillot plaquettaire. Elle rassemble aussi ses granules au centre, et les libère par ses canaux. Le contenu des granules denses inonde l'environnement plaquettaire avec des substances activatrices. Lorsque la plaquette s'active, elle forme du thromboxane A2. La plaquette activée augmente son calcium intracellulaire, et produit du DAG et de l'IP3. On a alors une activation de la phospholipase A2 et une libération de l'acide arachidonique (présent en petite quantité au niveau de la membrane). Sous l'effet de la cyclo-oxygénase on a formation d'endopéroxines. Puis sous l'action de la thromboxane synthétase, la formation de thromboxane A2. L'aspirine, sur cette voie de signalisation, va inhiber la cyclo-oxygénase de façon irréversible. L'aspirine « tatoue» la plaquette de façon dé nitive car elle ne pourra plus se débarrasser de l'aspirine qui a acétylé la cyclo-oxygénase, et ce pour toute la durée de vie de la plaquette (10j). Il n'y alors plus de formation d'endopéroxine ou de thromboxane A2 (pendant 7 à 10 jours). Il faut bien se souvenir que la plaquette n'a pas de noyaux. Donc si on inhibe une enzyme particulière, la plaquette sera incapable de la synthétiser à nouveau. Environ 10% des plaquettes sont renouvelées tous les jours. Il faut donc attendre cinq jours après la prise d'aspirine pour que 50% du stock ne soit pas « tatoué ». Après rencontre avec le collagène, la plaquette active la phospholipase C (I'ADP active lui la phospholipase Cß). Un ensemble de voie de signalisation se met en jeu pour activer l'a2Bß3. À retenir : lorsque la plaquette s'active sous l'effet de ses nombreux agents stimulants, les grains sont libérés (sérotonine), le thromboxane A2 est produit, l'a2Bß3 va se conformer pour être activée. L’intégrine a2Bβ3 permet l'agrégation des plaquettes entre elles. S'il n'y a plus d'agrégation les saignements sont sévères (traitement par concentrés plaquettaires). fi fi fi fi 𝛾 fi fi fi  - Le dé cit en CalDAG (découvert à Marseille) induit des saignements par un blocage du signal qui doit activer l’a2Bβ3. - Le dé cit en kindlin existe également et peut s'avérer très sévère Il faut bien comprendre que l’intégrine 2Bβ3A est sous forme inactive dans la circulation, xé sur une plaquette au repos. Dès que la plaquette s'active, l’intégrine ⍺2Bβ3A change de conformation et elle devient capable de lier ses ligands. C'est une étape essentielle pour arriver à former des agrégats. Il existe une pathologie pour laquelle les individus n'ont plus du tout d’intégrine ⍺2Bβ3A à la surface de leurs plaquettes : c'est la thrombasténie de Glanzmann (très rare : 400 cas en France). Représentation de l'a2Bß3 : L'a2B en rouge et le B3 en blanc. Lors de l'activation plaquettaire, il y a un changement de conformation de la a2Bß3 (intégrine) qui xe le brinogène produit en présence de calcium (2,5g/L dans le sang). Le brinogène est une molécule produite par le foie. Le brinogène peut être substitué par le facteur de Willebrand mais il possède une af nité préférentielle. Il permet la liaison entre 2 plaquettes par l'intermédiaire du calcium. À partir de l'activation plaquettaire il y a création d'un réel magma de plaquettes. Si tout ce processus ne s'est pas déroulé, l'a2Bß3 n'est pas activée dans le sang circulant. Le brinogène fait le lien entre 2 plaquettes alors que le facteur de Willebrand relie la plaquette au vaisseau mais il peut aussi relier 2 plaquettes. IV. L'agrégation plaquettaire La méthode de Born est une méthode très ancienne. Elle est apparue en 1962 mais est toujours d’actualité. En laboratoire, on prépare une suspension plaquettaire et on la soumet à de nombreux agonistes. On prélève le sang et on chélate le calcium (tube citrate donc bleu). On centrifuge à très faible vitesse, donc toutes les grosses cellules se retrouvent un bas et les cellules peu denses comme la plaquette restent en haut. On recueille le surnageant = le plasma riche en plaquettes (= PRP). Les plaquettes sont stimulées par ajout d'agonistes ou activateurs : - De l'acide arachidonique qui est capté par la plaquette pour produire du thromboxane A2, - De l'ADP (très utilisé), - Du collagène +++ - Un analogue de la thrombine - De l’adrénaline... Cette technique est très utilisée pour savoir si le patient prend son médicament, ou s'il résiste au médicament. En stimulant la suspension avec de l'ADP, on observe une réduction de l’agrégation plaquettaire si le médicament fonctionne. Si on mettait du calcium ça ferait un gros caillot de brine car le calcium est indispensable à la coagulation Déroulement : fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi  Quand on ajoute l'activateur, la plaquette s'active et des agrégats se forment. La lumière qui au départ ne passait pas car la suspension était très opaque (première photo), passe quand on met les agonistes (deuxième photo). Donc on arrive à enregistrer et mesurer la transmission lumineuse et on arrive à distinguer des thrombopathies (test de première intention). On mesure souvent l'intensité maximale. Cela s’appelle l'agrégation plaquettaire par transmission lumineuse. Cette méthode permet de véri er l'ef cacité des traitements antiplaquettaires. 2eme méthode : la cytométrie en ux : Elle sert à phénotyper toutes les cellules et est très utilisée pour le diagnostic d'une leucémie. La cytométrie en ux permet aussi de détecter les molécules exprimées par la plaquette. On utilise des anticorps marqués par uorochromes contre les Gp exprimées. On mesure une intensité de uorescence. Plus il y a de molécules exprimées, plus l'intensité uorescente est augmentée. De nombreuses industries ont essayé de commercialiser des anticorps qui avaient pour fonction de bloquer l'interaction entre le brinogène et l’intégrine ⍺2Bβ3a. Ce sont des molécules administrées par perfusion dans des cas assez extrêmes. V. La numération plaquettaire La numération plaquettaire permet de « numérer » des plaquettes. En règle générale, elle doit être supérieure à 150 gigas/ L. En dessous de cette valeur seuil, on parle de thrombopénie. Au-dessus de 450 gigas/L, on parle de thrombocytose. Les plaquettes peuvent avoir des formes variables et donc des tailles très hétérogènes. Dans certaines pathologies, les plaquettes sont très grosses ce qui peut conduire à des erreurs lors de la numération. Il existe également un indice du volume plaquettaire (VPM= volume plaquettaire moyen), celui-ci étant parfois très mal déterminé par les biologistes. La deuxième méthode pour analyser les plaquettes est la cyrtométrie en ux. Elle permet de mesurer la quantité de récepteurs à la surface de la plaquette et la sécrétion plaquettaire. Déroulement : Le bruit de fond correspond à un anticorps non marqué, et on peut voir à côté un déplacement de la population plaquettaire vers la droite (très forte expression). Quand on a une faible expression, la population va se déplacer vers la gauche. Même chez les patients traités par antiplaquettaire, on étudie par cytométrie en ux une molécule phosphorée dans la plaquette. Cette molécule est molécule est modulée par la prise d’antiplaquettaire. On a également des Ac qui permettent de reconnaitre l'activation de la Gp2B3A. On utilise un Ac appelé PAC-1. A l'état de base, la valeur est faible car il n'y a pas beaucoup de Gp2B3A activé. Après stimulation, la valeur est plus importante car elle est exprimée à la surface de la plaquette. On peut donc mesurer l’état d'activation plaquettaire. Certains individus ont des anomalies de formation du mégacaryocyte qui font que la plaquette a un dé cit en granule dense et fonctionne donc moins bien. Il existe une méthode largement utilisée pour explorer les granules denses : c'est le test à la mépacrine. On incube les plaquettes avec la mépacrine (nucléotide) qui a ici un rôle de marqueur uorescent. On peut ainsi visualiser au microscope l'état de la plaquette. Antagonistes de GP1B : Molécule en développement, nous n'avons pas de molécule susceptible de bloquer l’interaction ente le facteur Willebrand et la GPIb. En revanche, fl fl fi fi fl fl fi fl fl fi fl fl développement important (France et États-Unis) sur une molécule qui bloquerait la GPVI (bloquer l'adhésion des plaquettes au collagène) Antagonistes de GP2Bβ3A : Utilisés beaucoup plus rarement dans des circonstances aigues, salle de coronarographie. Si on bloque la 2B3A on n'a plus d'agrégat possible Mab = anticorps On a le P2Y12 (on en a parlé tout à l'heure), inhibé par le Clopidogrel. (Très utilisé)