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26/09/2023 Dr. NOYEL UE6 Hématologie GONCALVES DE AZEVEDO Matteo VALLERY Liloo PHYSIOLOGIE DE LA COAGULATION ET DE LA FIBRINOLYSE OBJECTIFS PEDAGOGIQUES ● Connaissances à acquérir : - Étapes de l’hémostase secondaire (=coagulation) et leur physiologie - Compréhension des mécanismes de l’hémostase...

26/09/2023 Dr. NOYEL UE6 Hématologie GONCALVES DE AZEVEDO Matteo VALLERY Liloo PHYSIOLOGIE DE LA COAGULATION ET DE LA FIBRINOLYSE OBJECTIFS PEDAGOGIQUES ● Connaissances à acquérir : - Étapes de l’hémostase secondaire (=coagulation) et leur physiologie - Compréhension des mécanismes de l’hémostase ● Compétences à acquérir : - Interpréter un bilan de coagulation standard PARTIE I : PHYSIOLOGIE DE LA COAGULATION ET DE LA FIBRINOLYSE I. Introduction 1. Qu’est-ce que l’hémostase L’hémostase désigne les mécanismes visant à maintenir le sang fluide et à l’intérieur des vaisseaux. C’est donc l’ensemble des phénomènes observés après une lésion vasculaire pour arrêter le saignement. Ils assurent ainsi la prévention de saignements spontanés et l’arrêt d’une hémorragie en cas de rupture de la paroi vasculaire. L’hémostase se décompose en trois étapes : 1. Hémostase primaire 2. La coagulation = hémostase secondaire 3. La fibrinolyse 2. Déroulement des étapes de l’hémostase a. Hémostase primaire Elle correspond à la formation d’un thrombus plaquettaire blanc = clou plaquettaire. C’est donc l’ensemble des interactions entre la paroi vasculaire lésée (=brèche vasculaire), les plaquettes et les protéines adhésives (fibrinogène, vWF). La formation du clou plaquettaire mis en place lors de cette étape permet l’obstruction de la brèche vasculaire, grâce à l’agrégation des plaquettes entre elles. L’hémostase primaire se décompose en deux temps : - Le temps vasculaire : vasoconstriction - Le temps plaquettaire : adhésion, agrégation plaquettaire A la fin de l’étape d’hémostase primaire, on observera : Figure SEQ Figure \* ARABIC 1: rappels sur - L’arrêt du saignement dans les petits vaisseaux l'hémostase primaire - L’arrêt provisoire du saignement dans les autres vaisseaux Page 1/25 b. Coagulation = hémostase secondaire Cette étape correspond à la formation d’un thrombus rouge formé par de la fibrine et des globules rouges (GR) positionné au-dessus du thrombus blanc. Son rôle est de consolider l’agrégat plaquettaire formé lors de l’hémostase primaire. Cette étape a lieu grâce à l’intervention d’un réseau de fibrine insoluble, et se met en place par l’activation en cascade de protéines plasmatiques appelées facteurs de la coagulation. c. Fibrinolyse La fibrinolyse correspond à la dégradation de la fibrine mise en place lors de la coagulation pour permettre une cicatrisation de la paroi vasculaire. Cela permet de limiter l’extension du caillot au site de la brèche. II. La coagulation 1. Acteurs de la coagulation Figure SEQ Figure \* ARABIC 2 : résumé des étapes de l'hémostase a. Les plaquettes – les phospholipides (PL) – Ca2+ Les plaquettes sont le support des réactions de la coagulation. Ces cellules contiennent des granules renfermant des facteurs pro-coagulants (fibrinogène, FV …) qui sont sécrétés lors de l’activation plaquettaire. 🡪 Les plaquettes et le calcium sont des éléments indispensables de l’initiation de la coagulation 1 2 Les phospholipides présents à la surface des plaquettes ont une grande affinité pour le domaine GLA (riche en acide glutamique) des facteurs de la coagulation. Fixation des facteurs de la coagulation avec les plaquettes par l’intermédiaire du calcium qui permet des liaisons électrostatiques entre les phospholipides et le domaine GLA → Permet de déclencher la réaction enzymatique Figure 3 : explication du mécanisme → Ce mécanisme a donc un rôle de support indispensable à l’activation des facteurs plasmatiques. Page 2/25 b. Les facteurs de la coagulation ● ● Les facteurs de la coagulation comprennent des protéines plasmatiques synthétisé majoritairement au niveau hépatique à l’exception du facteur VIII qui à lui une synthèse au niveau de l’endothélium À l’état basal ces facteurs sont tous inactifs et nécessitent une activation. Lorsqu’un signal de coagulation est émis, le zymogène est transformé en enzyme nommée sérine protéase. Cette sérine protéase va ensuite activer les facteurs de la coagulation. NB : en nomenclature, lorsqu’un facteur de coagulation est activé, il porte le suffixe « a- » Ainsi, le FIa = fibrine, Flla = thrombine ● Certains sont vitamine K dépendants : II – VII – IX – X. 🡪 Leur activation nécessite de la vitamine K ● Certains facteurs jouent un rôle de catalyseur d’une réaction donnée, ce sont des cofacteurs qui vont augmenter l’activité enzymatique du facteur auquel ils sont liés : - Le facteur V est le cofacteur du FXa (facteur X activé) = complexe prothrombinase - Le facteur VIII est le cofacteur du FIXa (facteur IX activé) = complexe tenase. Le substrat des facteurs pour les réactions enzymatiques est le fibrinogène ● c. Métabolisme de la vitamine K La vitamine K a une origine alimentaire, sous forme de vitamine K1 (légumes verts, foie, céréales, lait de vache) et est aussi synthétisée par la flore intestinale sous forme de vitamine K2 absorbée via les sels biliaires = réserve hépatique qui permet de subvenir aux besoins du corps sans apports alimentaires pendant 1 à 2 semaines. La Vitamine K2 est liposoluble Certains facteurs de coagulation sont dépendants de la vitamine K. La glutamyl-carboxylase a besoin de vitamine K pour fixer le groupement GLA sur le facteur et ainsi l’activer. Page 3/25 Sur le schéma ci-contre on peut voir que la vitamine K, en s’oxydant fournit aux facteurs de la coagulation inactifs (PIVKA = précurseurs inactifs vitamine K dépendants) les atomes nécessaires à leur conversion en facteurs de la coagulation actifs. PIVKA subit une carboxylation (+groupement GLA) qui permet d’activer les facteur vitamine K dépendant. (Non à connaitre par cœur), Cela est valable pour les facteurs II, VII, IX et X et les protéines C et S des inhibiteurs (physiologiques) de la coagulation. En thérapeutique : attention, si instauration d’un traitement antivitamine K, début des effets au bout de 2-3 jours et si arrêt, plus d’effets au bout de 2-3j. Une carence en vitamine K : - Chez le nouveau-né : carence physiologique = maladie hémorragique du nouveau-né ; due au manque de vitamine K dans le lait maternel et à l’immaturité hépatique des premiers jours de vie. - Chez l’adulte : ▪ Carence alimentaire sévère (régime sans fibres, alimentation parentérale, …) ++ ▪ Défaut de synthèse par la flore intestinale (causée par une antibiothérapie à large spectre). ▪ Défaut d’absorption de vitamine K causé par un manque de sels biliaires, un ictère, des maladies du grêle ou encore des résections. d. Le fibrinogène Il est le substrat de la coagulation. Synthétisé dans le foie, sa concentration plasmatique est de 2 à 4 g/L. Il est composé de 6 chaines polypeptidiques identiques 2 à 2 : - 2 chaînes Aα - 2 chaînes Bβ - 2 chaînes γ (Aα)²(Bβ)²γ² Elles sont liées entre elles par des ponts disulfures. Concernant leur structure, elles se présentent sous la forme d’un noyau central E avec deux polypeptides 1 et B ainsi que deux domaines latéraux D. Figure SEQ Figure \* ARABIC 6: structure du fibrinogène Figure SEQ Figure \* ARABIC 5: structure du fibrinogène e. Le facteur tissulaire Page 4/25 C’est une glycoprotéine membranaire présente dans de nombreuses cellules qui est associés aux phospholipides membranaires. Physiologiquement il a une distribution tissulaire, et non plasmatique ; il n’est pas au contact du sang dans des conditions basales. On la retrouve dans les cellules du sous-endothélium et des cellules qui ne sont pas au contact direct du sang comme les fibroblastes, le placenta, le cerveau et le poumon. Il peut cependant être induit au besoin dans des cellules au contact du sang comme les monocytes ou des cellules endothéliales. Lors d’une brèche vasculaire, le facteur tissulaire est exposé par les cellules endothéliales et le sous-endothélium. Le sang circulant est ainsi en contact avec le facteur tissulaire ce qui engage l’initiation de la coagulation. De plus, le facteur tissulaire, a une forte affinité pour le facteur VII avec lequel il forme le complexe équimolaire en présence de calcium. L’association du facteur tissulaire (FT) et du FVII permet alors l’initiation de la coagulation. Page 5/25 2. Les étapes de la coagulation a. Etapes clés 1) Phase d’initiation Par l’exposition du facteur tissulaire (FT) lors de la brèche ; ce dernier est donc au contact du sang circulant ● ● 2) Phase d’amplification et propagation ● 3) Formation du caillot (=fibrinoformation) Cascade de réactions enzymatiques Le plasma contient toutes les protéines nécessaires (sauf le FT qui est physiologiquement contenu dans l’endothélium et le sous endothélium, mais qui sera donc mis à disposition) Aboutit à la formation d’une grande quantité de thrombine = Enzyme clé La thrombine transforme le fibrinogène en fibrine pour aboutir à un caillot de fibrine Figure SEQ Figure \* ARABIC 7: déroulement et fonction de la coagulation Page 6/25 b. Phase d’initiation Phase d’initiation VOIE EXTRINSEQUE (EXOGENE) : Majoritaire Une lésion vasculaire permet une libération du facteur tissulaire, qui va ensuite former le complexe FT-FVIIa + Ca2+ qui conduira à l’activation du facteur X en FXa VOIE INTRINSEQUE (ENDOGENE) : Minoritaire Elle implique les facteurs de la phase contact : - la prékallicréine (PK) et le kininogène - de haut poids moléculaire (KHPM) Activation FXII puis FXI Tous ces facteurs vont venir activer : FIX en FIXa et le FX en FXa Le FXa permet la formation d’une petite quantité de thrombine qui est une enzyme clé dans la coagulation (permet la conversion du fibrinogène soluble en fibrine insoluble). Grâce aux premières traces de thrombine formées par les deux voies précédentes, on observe une amplification du processus de coagulation avec : - L’activation des plaquettes : contiennent des facteurs pro-coagulants (granules contenant du FV qui joue un role dans l’amplification) - L’activation des deux cofacteurs V (du FX) et VIII (du FIX) - L’activation du facteur XI Grâce à ces activations, on observe la formation d’une grande quantité de thrombine. Figure SEQ Figure \* ARABIC 8: voies intrinsèque et extrinsèque Page 7/25 c. Amplification et propagation Après l’étape d’initiation et les activations successives dues à la thrombine, on assiste à une seconde phase dite d’amplification et de propagation. Ces deux étapes permettent d’augmenter la quantité de thrombine produite pour intensifier le phénomène de coagulation. Cette augmentation de thrombine exerce un feedback positif sur la production et la formation des complexes avec les différents facteurs, pour obtenir encore plus de thrombine. La thrombine assure donc aussi un rôle dans la fibrinoformation. Elle assure en plus l’activation du facteur XIII qui stabilise la fibrine. d. Fibrinoformation C’est l’ultime étape de la coagulation ; la thrombine produite en grande quantité va permettre la conversion du fibrinogène en fibrine. Le fibrinogène subit une hydrolyse partielle en monomère de fibrine. La thrombine active le FXIII en FXIIIa qui est un stabilisant de la fibrine, vient consolider le réseau. NB : Le FXIII ne fait partie d’aucune voies Le zymogène présent dans le plasma et les granules plaquettaires s’active et active ensuite le facteur XIII pour qu’il agisse en stabilisateur de la fibrine et qu’il puisse consolider correctement le réseau de fibrine. Figure 9 : rôle de la thrombine lors de la fibrinoformation La thrombine permet : - La formation de monomères de fibrines L’activation, en parallèle, du FXIII en XIIIa 🡪 permet le passage d’un polymère de fibrine soluble en polymère de fibrine insoluble et stable qui compose le caillot. La fibrinoformation a ainsi un rôle dans la stabilité du caillot. Lors de cette étape, la thrombine assure une production maximale de fibrine au sein du caillot ; la thrombine formée se lie à la fibrine ce qui permet de la protéger des inhibiteurs de la coagulation (c’est l’inverse dans la circulation). Page 8/25 Pour une coagulation efficace, il faut que le caillot tienne suffisamment longtemps pour permettre la réparation tissulaire. La thrombine active alors le TAFI (inhibiteur de la fibrinolyse dont le rôle est de maintenir le caillot plus longtemps. Elle incorpore aussi d’autres inhibiteurs de la fibrinolyse comme α2-AP et PAI-1. Vidéo youtube : « La coagulation sanguine » https://www.youtube.com/watch?v=gLL5jUwkdwI EN RESUMÉ : FIBRINE + HEMATIES + PLAQUETTES = THROMBUS ROUGE Figure SEQ Figure \* ARABIC 10: schéma récap des étapes de la coagulation 3. Système de contrôle de la coagulation (Rappel du cours du Dr TARDY= passage rapide sur ce cours) a. Contrôle Pour éviter la thrombose et contenir dans le temps et dans l’espace le phénomène de coagulation, il y a l’intervention d’un système de contrôle. Ce système de contrôle est extrêmement régulé : - Le flux sanguin dilue les facteurs de coagulation à distance de la brèche - Contrôle grâce à des effets de seuil (avec TFPI, la thrombine …) - On retrouvera un endothélium sain en aval de la lésion - Intervention de plusieurs protéines inhibitrices (antithrombine, protéine C, protéine S, TFPI) b. Quelques inhibiteurs de la coagulation Un déficit en inhibiteurs de la coagulation entraînera donc une tendance à la thrombose. L’ANTITHROMBINE (AT3) : Page 9/25 Elle appartient à la famille des SERPINes (SERine Protease INhibitor); Elle a une synthèse hépatique et circule librement dans le sang. Physiologiquement, elle inhibe la thrombine, le facteur Xa, IXa et XIa par formation d’un complexe antithrombine – sérine protéase. C’est donc un inhibiteur fondamental de la coagulation ; un déficit total en antithrombine serait non viable. Des variations iatrogènes en antithrombine peuvent apparaître : -20% avec de l’héparine, -20/30% avec la L-asparaginase. LE SYSTEME PROTEINE C Le système protéine C implique plusieurs protéines : la protéine C, la thrombomoduline et les phospholipides. - La thrombomoduline est une protéine transmembranaire présente à la surface des cellules endothéliales. Elle se fixe à la thrombine et active la protéine C - La protéine C est de la famille des sérine protéase vitamine K-dépendante dont la synthèse est hépatique. Sa demi-vie est courte (4h). Comme dit ci-dessus, elle sera activée par le complexe thrombine-thrombomoduline. - La protéine S agit comme un cofacteur de la protéine C, elle est aussi vitamine K-dépendante. Elle a une synthèse hépatique mais elle est aussi synthétisée par d’autres cellules (mégacaryocytes, cellules endothéliales). Sa demivie est longue (36h). On la retrouve sous forme libre active, liée à C4BP. La protéine C est activée par la formation du complexe thrombine-thrombomoduline. Cela va entrainer la formation du complexe PCa-PS qui va ensuite se lier aux plaquettes via la forte affinité de la protéine S pour les Phospholipides plaquettaires anioniques. Pour finir, cela aboutit à la dégradation des FVa et FVIIIa, ce qui ralentit la génération de la thrombine. Figure SEQ Figure \* ARABIC 11: schéma du fonctionnement du système protéine C TFPI (Tissue factor pathway inhibitor = inhibiteur du facteur tissulaire) Il est synthétisé par les cellules endothéliales et circule en faible quantité dans le plasma. Il va former un complexe avec le FT lorsque celui-ci est lié au FVIIa ce qui limite l’action du FX en FXa. Page 10/25 Figure SEQ Figure \* ARABIC 12: récapitulatif des rôles des inhibiteurs de la coagulation III. Fibrinolyse 1. Définition La fibrinolyse est l'ensemble des processus mis en œuvre pour éliminer le caillot de fibrine et permettre une re-perméation correcte du vaisseau. En effet : - Le caillot hémostatique ne joue qu'un rôle temporaire - Les processus de cicatrisation sont mis en jeu, le caillot doit disparaître - Le caillot de fibrine est progressivement éliminé́ sous l’action du système fibrinolytique Cette étape est initiée en même temps que l'hémostase primaire et la coagulation mais elle est inhibée au début. De plus, l'enzyme clé du système fibrinolytique est la plasmine. Schéma global de l'action de la plasmine lors de la fibrinolyse La thrombine et la fibrine sont les enzymes clés 2. Le système fibrinolytique a. Le plasminogène ● ● ● Glycoprotéine circulante dans le plasma, dont la synthèse est hépatique Grande affinité pour la fibrine Activé en plasmine par des activateurs plasmatiques ou tissulaires Activateurs plasmatiques ou tissulaires t-PA (tissular plasminogen activator ) ● ● Principal activateur de la fibrinolyse, en transformant le plasminogène en plasmine Produit par les cellules endothéliales et sécrété sous l'effet de divers stimuli (thrombine, cytokines, occlusion vasculaire) Page 11/25 ● u-PA (urokinase plasminogen activator) ● ● ● Forte affinité pour la fibrine donc son action est 1000 fois plus importante sur le plasminogène adsorbé à la fibrine 2ème système d'activation du plasminogène (transformant le plasminogène en plasmine) Synthétisée par les cellules endothéliales, monocytes, macrophages sous la forme d'une prourokinase qui sera activée en urokinase active par le plasminogène, la plasmine et le système contact Pas d'affinité directe pour la fibrine, système minoritaire par rapport au système du t-PA b. La plasmine ● ● ● ● Enzyme protéolytique (sérine protéase) clé de la fibrinolyse Formation préférentielle à la surface du caillot La plasmine libre est dangereuse car capable de dégrader le fibrinogène, les facteurs V, VIII, vWF (facteur de von Willebrand), XIII, le système du complément, les matrices, etc. Enzyme très active, d'où la nécessité de limiter sa synthèse au lieu du caillot → Contrôlée par l'α2-antiplasmine en présence du facteur XIII 3. Déroulement de la fibrinolyse Le plasminogène et le t-PA se fixent spécifiquement sur la fibrine du caillot. En effet, la fibrine catalyse fortement la réaction entre le t-PA et le plasminogène (x100 à x1000), qui aboutit à la formation de plasmine à la surface du caillot. La plasmine formée à la surface de la fibrine la dégrade progressivement, ce qui aboutit à la lyse du caillot de fibrine. Schéma des étapes de la fibrinolyse 4. Régulation de la fibrinolyse a. Régulation positive Voie du t-PA (tissular plasminogen activator) Voie prourokinase/urokinase Les voies actives de la fibrinolyse ● Synthèse par les cellules endothéliales ● t-PA peu efficace en l'absence de fibrine → la fibrine est le support pour l'agencement spatial du plasminogène et du t-PA Pas de liaison directe à la fibrine : se lie par l'intermédiaire du plasminogène Voie dépendante du facteur XII Mêmes acteurs que le système contact : XII + KHPM + PK b. Régulation négative Le système doit être régulé (pour limiter la fibrinolyse): - Si fibrinolyse trop lente : persistance inappropriée du caillot, occlusion du vaisseau - Si fibrinolyse non contrôlée : destruction trop précoce du caillot - Si fibrinolyse hors du caillot : détruirait les capacités de coagulation (surconsommation des facteurs) Page 12/25 On a donc une action limitée dans le temps et dans l’espace du t-PA : il ne peut activer le plasminogène que s'il est lié à la fibrine donc au sein d'un caillot. Les acteurs de la régulation négative ● Élimine la plasmine libre circulante α2-antiplasmine ● Se lie à la plasmine grâce au FXIII dans la circulation et bloque ainsi son action ● Afin d'éviter une lyse trop précoce du caillot, une certaine quantité d'α2-antiplasmine est incorporée au caillot : inhibe les premières traces de plasmine ● Si l'α2-antiplasmine est débordée : intervention de l'α2-macroglobuline, du C1-inhibiteur ● Si déficit en α2-antiplasmine : syndrome hémorragique ● Principal inhibiteur plasmatique du t-Pa et de l’u-Pa ● Synthétisé par les cellules endothéliales, monocytes, hépatocytes, fibroblastes, adipocytes et mégacaryocytes PAI-1 (plasminogen activator inhibitor) ● Circule en grande quantité dans le sang et est libéré par les plaquettes ● Rôle : inhibe immédiatement le t-PA s'il n'est pas lié à la fibrine ● Grande variation du taux de PAI-1 : o Expression stimulée par les cytokines pro-inflammatoires et les hormones o Augmentation si grossesse, inflammation ● Si déficit : syndrome hémorragique TAFI (Thrombin activable Fibrinolysis Inhibitor) ● Synthèse hépatique sous forme de procarboxypeptidase B ● Activation en carboxypeptidase par le complexe thrombine/thrombomoduline ● Rôle : ralentisseur de la fibrinolyse (encore mal définit) o Diminue la fixation du t-PA et du plasminogène sur la fibrine A savoir essentiellement que la régulation négative se fait grâce à l'α2-antiplasmine, PAI-1 et TAFI et que c’est un système très contrôlé En résumé ● ● ● Si pas assez de facteurs de coagulation : on saigne Si pas d’inhibiteurs de la coagulation : on thrombose Si pas d’inhibiteurs de la fibrinolyse : on saigne Page 13/25 ● Si pas assez d’activateurs de la fibrinolyse : on thrombose Schéma récapitulatif des voies de régulation de la fibrinolyse 5. Produits formés par la fibrinolyse La plasmine est une enzyme protéolytique qui dégrade progressivement les molécules de fibrine. On obtient : - Protéolyse des chaines entre les domaines D et E - Production de produits de dégradation de fibrine (PDF) de divers poids moléculaires, se réduisant progressivement PDF précoces, intermédiaires et tardifs - Les produits ultimes sont des D-dimères (produits de dégradation spécifiques de la fibrine) correspondant à Deux fragments D de deux monomères de fibrine contigus (grâce à l'action du XIIIa sur la fibrine) Page 14/25 Schéma montrant les produits de dégradation de la fibrine par la plasmine IV. Résumé de la coagulation et de la fibrinolyse La thrombine est produite au départ en petite quantité puis on a une boucle d'activation de la coagulation qui permet d'avoir une production plus importante, permettant de constituer un réseau de fibrine. Mais la thrombine en faible quantité active aussi les systèmes anticoagulants (protéines C, S, antithrombine) qui limitent la production du caillot qu'au niveau de la brèche. Elle active TAFI pour que la fibrinolyse n'ai pas lieu précocement. Schéma récapitulatif Page 15/25 PARTIE 2 – METHODES D’EXPLORATION ET INTERPRETATION I. Exploration de l'hémostase 1. Pourquoi explorer l'hémostase ? On explore l'hémostase pour mettre en évidence un déséquilibre de la balance hémostatique pouvant provoquer des saignements ou des thromboses. ● ● Hémorragie : - Défaut de l'hémostase primaire - Déficit en facteurs de la coagulation (un ou plusieurs) - Excès de fibrinolyse ● Diminution des inhibiteurs de la fibrinolyse (rare) Thrombose : - Déficit en inhibiteurs de la coagulation - Défaut de fibrinolyse - Présence d'anticorps anticoagulants circulants (inhibent les PL et provoquent des thromboses) L'exploration passe par : 1) Interrogatoire du patient +++ : ▪ Antécédents personnels ▪ Antécédents familiaux ▪ Ttt anticoagulants 2) Orientation : ▪ Saignement cutanéomuqueux : trouble de l'hémostase primaire ▪ Saignement profond, articulaire : trouble de la coagulation 6. Exploration biologique On réalise un prélèvement de sang veineux au pli du coude ● Sur tube citrate = anticoagulant chélateur du calcium - But : empêcher la coagulation dans le tube (rôle +++ du Ca2+) - Citrate = anticoagulant liquide - Nécessite d’avoir un rapport sang / anticoagulant correct = 9 volumes de sang pour 1 volume de citrate d’où l’importance de remplir le tube jusqu’au trait (pour ne pas avoir de dilution du sang par le citrate). ● Agitation du tube par retournement au moins 5 fois dès la fin du remplissage du tube pour mélanger le citrate et le sang et éviter la formation de caillot dans le haut du tube. ● Conservation à température ambiante (jamais au frigo) et acheminement au laboratoire en moins de 4h. Démarche diagnostique de l'exploration de l'hémostase Rappel : l’ordre de prélèvement est très important Un prétraitement du tube a été réalisé afin d'obtenir du plasma pauvre en plaquettes (PPP). Pour cela, on a réalisé une centrifugation pendant 10min. On parle bien de plasma et non de sérum (plasma = contient tous les facteurs de la coagulation (avec antico) et sérum sans antico, sang dépourvu des facteurs de coagulation par la formation du caillot). Page 16/25 Attention : ne pas prélever un tube hépariné avant un tube citraté car peut fausser le prélèvement. 7. Exploration de la coagulation Elle est réalisée lors de : - Suivi des ttt anticoagulants : héparine, AOD = NACO (anticoagulants oraux directs), AVK - Recherche d'un risque hémorragique - Exploration d'un syndrome hémorragique ou thrombotique Les tests utilisés sont : - Tests automatisés - Méthode chronométrique = coagulométrique - Tests globaux (Temps de Quick, temps de céphaline activée) - Tests spécifiques (dosage du fibrinogène, de facteurs de coagulation, mesure activité anti Xa) Schéma global de l'exploration des facteurs par les tests globaux a. Méthode chronométrique ● ● ● Mesure du temps de coagulation d'un plasma citraté dans des conditions standardisées Résultats exprimés en seconde 2 modes de détection : - Détection mécanique On met une bille aimantée dans le tube au-dessus d'une bobine électromagnétique. La bille fait des oscillations jusqu’à ce que le caillot se forme. L'oscillation de bille diminue jusqu’à ce que le caillot emprisonne la bille 🡪 on regarde ce temps sur le chronomètre : temps de coagulation - Détection optique : diminution de la lumière transmise par la formation du caillot. On chronomètre le temps de coagulation. La lumière diminue au fur et à mesure que le caillot se forme. Page 17/25 b. Tests Temps ● de céphaline globaux avec activateur (TCA) Temps de coagulation : - D'un plasma citraté pauvre en plaquettes mais contenant les facteurs de coagulation - Recalcifié par ajout de Ca2+ et en présence de céphaline (phospholipides (comme à la surface des plaquettes → substitut plaquettaire)), d'activateur du système contact (silice, kaolin, acide ellagique) - Permet l'exploration de la voie intrinsèque (XII, XI, VIII et IX) et de la voie commune (II, V et X et fibrinogène) - Exploration de la voie intrinsèque et de la voie commune en explorant les facteurs : PK, KHPM, FXII, FXI, FIX, FVIII, FV, FX, FII, FI - Mode d'expression : - En secondes (ordre de 30-35sec) - En ratio par rapport à un témoin (population saine) : TCA patient/TCA témoin - Valeurs normales : ratio < 1,20 (pour tout le monde). Un TCA anormal est donc allongé. Schéma montrant le protocole de Temps de Quick (TQ): ● Temps de coagulation : - D'un plasma citraté pauvre en plaquettes - Après adition de thromboplastine (facteur tissulaire, phopholipides, calcium) ● Exploration de la voie extrinsèque (FT et VII) et de la voie commune (II, V, X et fibrinogène) - Facteurs : FVII, FV, FX, FII, FI ● Paramètre le plus sensible aux hypovitaminoses K (AVK, déficit en facteurs vitamine K dépendant) Modes d’expressions En secondes (ordre de 13 sec) Temps de Quick ● Conversion du TQ en TP grâce à la droite de Thivolle = droite d'étalonnage à partir d'un En % : TP (Taux de Prothrombine) + plasma sain de référence dont le TP = 100% lorsque non dilué, on mesure le temps qui correspond à 100% on fait des dilutions successives qui donne un TP à 50%... Puis on reporte sur la droite. Page 18/25 ● Mode d'expression le plus souvent utilisé ● Valeur normale : 70-100% ● Mode d’expression utilisé/codifié chez les patients traités par AVK uniquement ● ● ● En ratio : INR (International Normalized Ratio) ● (médicaments à marge thérapeutique étroite nécessitant un suivi biologique régulier), on ne regarde pas leur TP. S’affranchit de l’hétérogénéité des réactifs de laboratoire (multitudes de thromboplastine sur le marché)́ Permet une normalisation des résultats entre laboratoires (par rapport au TQ qui est labo dépendant) Calculé grâce à l’ISI : index de sensibilité international calculé pour chaque thromboplastine par rapport à une thromboplastine de référence (environ 1) Calculé grâce à la formule : INR = (TQ malade/ TQ témoin)ISI Le médicaments anti-vitamine K (AVK) permet : - L'inhibition de la régénération de la vitamine K oxydée en sa forme réduite : - devient inutilisable pour transformer les PIVKA (précurseurs inactifs) en facteurs actifs 🡪 Facteurs vitamine K dépendants inactifs : FII, FVII, FIX, PC, PS Le traitement et la prévention de la maladie thromboembolique veineuse 🡪 indication thérapeutique Pour que le traitement par AVK soit équilibré, l'INR cible doit être situé entre 2 et 3 ou parfois entre 3,5 et 4,5 ▪ Si INR < 2 : sous-dosage ▪ INR > 5 : surdosage avec risque hémorragique Si troubles de la coagulation, on a une augmentation du TQ et une diminution du TP Schéma montrant le protocole de mesure du temps de Quick c. Tests spécifiques Dosage du fibrinogène (uniquement): - Temps de coagulation d'un plasma citraté pauvre en plaquettes, en présence d'un excès de thrombine calcique → formation de fibrine : + le caillot de fibrine se forme vite, + on a du fibrinogène - Valeurs usuelles : 2-4 g/L ▪ Hypofibrinogénémie < 2g/L peut faire saigner ▪ Hyperfibrinogénémie > 4g/L (syndrome inflammatoire, pas de risque augmenté de formation de caillot) Page 19/25 Le temps de coagulation est inversement proportionnel à la concentration de fibrinogène. Schéma montrant le protocole du dosage du fibrinogène Dosage des différents facteurs de la coagulation : ● Mesure d’un temps de coagulation (utilisation du réactif du TQ ou TCA) - D’un plasma patient mélangé́ à 50/50 avec un plasma témoin déficient en un facteur de la coagulation (le facteur à doser) - Le temps de coagulation mesuré dépend uniquement du taux du facteur d’intérêt (les autres facteurs sont apportés en quantité́ suffisante par le plasma témoin) - Conversion en taux (%) de facteur grâce à une droite de calibration Exemple du dosage du facteur VII : on met le plasma témoin avec tous les facteurs de coag sauf le facteur VII. → Le temps de coag ne dépend que de ce facteur. Schéma du protocole de dosage du FVIII Activité antiXA/ Héparinémie : (passage rapide) → Sert à suivre les patients sous héparine. activité anti-Xa / héparinémie Héparines Suivi biologique Dosage par colorimétrie ● Médicaments injectables o HNF : Héparines Non Fractionnées (Calciparine) o HBPM : Héparines de Bas Poids Moléculaire (Lovenox, Innohep) ● Potentialise les effets de l’antithrombine : o Activité anti-IIa et anti Xa ● Pour les HNF principalement dans certains cas pour les HBPM o TCA ratio o Dosage de l’activité́ anti Xa circulante ● On rajoute au plasma du patient contenant de l'héparine et de l'antithrombine, le facteur Xa dont l'activité est alors diminuée. Puis, on rajoute au mélange un substrat chromogène qui va réagir avec le Xa résiduel pour former de la paranitroaniline o Quantité de paranitroaniline libérée inversement proportionnelle à la quantité d'héparine dans le plasma du patient ● Utilisation d'une courbe de calibration Page 20/25 ● Bilan standard de coagulation : TP, TCA, fibrinogène En pratique ● Si on a une anomalie de ce bilan : on réalise des tests spécifiques. ● Pour le suivi des TTT, on dose INR pour les AVK et activité antiXa pour l’héparine Page 21/25 8. Exploration de la fibrinolyse (système très peu exploré) Les marqueurs explorés sont : ● Effondré en cas d’emballement du système fibrinolytique (coagulation intravasculaire disséminée) Fibrinogène ● Produits de dégradation de la fibrine et du fibrinogène PDF ● Produits de dégradation de la fibrine et du fibrinogène. Si pas de caillot, pas de fibrine (mais seuil donc pas = à 0) augmenté dans les cancers, l’inflammation... D-Dimères ● Intérêt dans la MTEV : diagnostic d'exclusion de la thrombose veineuse profonde si D-Dimères < 500 ng/ml Monomères de fibrine / complexes solubles ● Reflet d’une activation massive de l’hémostase ● Étude des protéines non explorées par les tests globaux o FXIII Dosage de la fibrinolyse est très spécialisé o Inhibiteurs de la coagulation : antithrombine, protéine C, protéine S ● Recherche d’anticorps : anticoagulant circulant ● Acteur de la fibrinolyse : PAI, α2antiplasmine... II. Interprétation du bilan de coagulation ● ● ● ● Les tests globaux n’explorent pas la totalité de l’hémostase mais uniquement une partie de la coagulation Le FXIII n’est pas exploré par les tests globaux Un test global normal n’exclut pas un risque hémorragique L’interrogatoire clinique du patient est primordial (si ATCD familiaux, on réalise des dosages spécifiques de facteurs) Interprétation du bilan toujours en regard : - De l’âge du patient - Du sexe de patient - Du contexte clinique / service ... 1. Causes d'un bilan perturbé Erreurs préanalytiques (1e cause) ● Mauvais remplissage du tube ● Tube coagulé ● Erreur de type de tube ● AOD ne nécessitent pas de surveillance mais perturbent tous les tests d’où l’importance de les renseigner. ● Présence d'héparine dans le prélèvement : Présence d’un TTT anticoagulant chez le patient - Par le TTT du patient - Par contamination du prélèvement : ▪ Tubes héparinés de l'ionogramme prélevé avant le tube citrate de l'hémostase ▪ Hémodialyse ▪ Prélèvement sur voie héparinée ● AVK Page 22/25 ● AOD ● Allongement du TQ : diminution du TP < 70% TQ = les plus sensibles pour l’exploration de la voie commune et vitamine K dépendants (II, VII, IX, X) ● Allongement du TCA : ratio TCA patient/TCA témoin > 1,2 ● Acquises ou constitutionnelles Anomalie de la coagulation sur 1 ou plusieurs voies ● TQ = paramètre le plus sensible aux hypovitaminoses K (AVK, déficit vitamine K dépendant). 2. Causes d'un allongement isolé du TCA ● Déficit en facteurs de la voie endogène : FVIII, FIX, FXI, FXII ● Traitement par héparine ● Anticoagulants circulants (agissent contre les PL) a. Déficit en facteurs de la voie endogène ● Pathologies hémorragiques dont les plus fréquentes sont des pathologies constitutionnelles liées à l'X (ne touche que l'homme) : - Déficit en FVIII : hémophilie A - Déficit en FIX : hémophilie B Pathologies liées au chromosome x donc ce sont les mamans qui transmettent et les garçons sont malades. Ces deux facteur sont en bas de la cascade donc risque majeur ! - Hémophilie sévère : taux de facteurs <1% - Hémophilie modérée : taux de facteurs entre 1-5% - Hémophilie mineure : taux de facteur entre 5-40% ● Plus rarement : - Déficit en FXI - Déficit en FXII : non hémorragique (car FXII en haut de la phase contact, non indispensable car pas tout seul) ● Le TCA est +/- allongé selon l’importance du déficit b. Anticoagulant circulant de type lupique ● Anticorps dirigés contre certains phospholipides Perturbation des tests d’hémostase dont les réactifs contiennent des phospholipides - TCA plus sensible que le TQ - > allongement du TCA - Réactif du TQ contiennent des phospholipides en excès qui neutralisent la présence potentielle d’un ACC Conséquences cliniques de la persistance d’un ACC : - Risque de thrombose chez l’adulte - Pathologie non hémorragique (qd c'est ACC -> pas de risque hémorragique) Page 23/25 3. Allongement du TQ : arbre décisionnel On sait que le TQ est allongé (ou TP diminué) quand AVK -> si prise d'AVK, on suit l'INR Si pas d’AVK (ou arrêt >2j) > on fait un dosage du facteur V qui est un reflet de la fonction hep et si diminué on part sur une IHC, si N on se dit que le pb vient des autres facteurs explorés par le TQ (FVII, FX, FII, FI). Si le TQ est allongé seul -> on effectue un dosage du FV qui est un bon reflet état hépatique du patient. Ainsi, si le FV est normal, on écarte un état hépatique critique du patient On dose ensuite les cofacteurs du TP qui sont vitamine K dépendants -> On peut avoir une hypovitaminose K si tous les facteurs sont diminués et que le FV est normal 4. Causes d'un allongement du TQ et du TCA ● ● ● Traitement anticoagulant Anomalie isolée de la voie commune : déficit en un facteur de la coagulation : FII, FV, FX, fibrinogène : pathologies hémorragiques constitutionnelles Anomalie globale : Carence en vitamine K, CIVD, IHC, hémorragie importante (perte en grande quantité de tous les facteurs de coagulation par consommation donc déficit de la voie intrinsèque et extrinsèque) a. La CIVD ● ● ● ● Coagulation IntraVasculaire Disséminée - Coagulopathie de consommation - Génération anormale et diffuse de thrombine ● Activation de la coagulation + débordement capacité d’inhibition Dépôts de fibrine dans la microcirculation -> formation de caillots dans les vaisseaux sanguin sans brèche → Consommation des plaquettes et des facteurs de coagulation -> syndrome hémorragique + activation de la fibrinolyse (dans le but de lyser les petits caillots dans les petits vaisseaux) Conséquences : - Allongement TQ et TCA - Diminution de tous les facteurs de la coagulation (FV, fibrinogène++) - Diminution du taux de plaquettes - Élévation des monomères de fibrine Contexte : sepsis, chirurgie lourde, obstétrique (post partum), cancer Page 24/25 A VOIR POUR MIEUX COMPRENDRE : Cascade de la coagulation : https://www.youtube.com/watch?v=fa5rbkFpq0w https://www.youtube.com/watch?v=gLL5jUwkdwI QCM : Question 1. A propos des méthodes d’exploration de la coagulation, cochez-la ou les réponses justes : A – Le TCA permet l’exploration de la voie extrinsèque et de la voie commune B – le suivi biologique des patients sous héparine se fait par dosage de l’activité antiXa C – un traitement par héparine n’est pas à l’origine d’un allongement du TCA D – Le temps de quick est le paramètre le plus sensible pour l’exploration des déficits en Vitamine K E – un dosage de D-dimères peut être justifié dans le cas d’une suspicion d’embolie pulmonaire Question 2. A propos de la coagulation et de la fibrinolyse (cochez la ou les propositions vraies) : A- La synthèse des facteurs de la coagulation vitamine K dépendants (II, VII, IX, X) par le foie peut être altérée au décours une carence alimentaire prolongée (supérieure à 2 semaines). B- La voie exogène (majoritaire) permet de former une quantité de thrombine suffisante à la constitution du caillot. C- La thrombine (IIa) permet l’activation des 2 cofacteurs Va et VIIIa aboutissant à la formation des complexes ténase (Va-Xa) et pro-thrombinase (VIIIa-IXa). Ces mêmes co-facteurs sont les cibles du système TM-PC-PS. D- La facteur XIII, activé par la thrombine, est indispensable pour consolider le réseau de monomères de fibrine agrégés sous forme de polymère. E- Un déficit en inhibiteur de la fibrinolyse (α2-antiplasmine, PAI-1 et TFPI) est l’origine d’hémorragie. Question 2 : AD Question 1 : BDE A – Faux : exploration de la voie intrinsèque et de la voie commune B – Vrai C – Faux : un ttt par héparine est à l’origine d’un allongement du TCA uniquement D – Vrai E - Vrai A- Vrai (réserve hépatique pour 1 à 2 semaines). B- Faux la quantité de thrombine générée par la voie exogène est INSUFFISANTE à la constitution d’un caillot. C- Faux complexes ténase (VIIIa-IXa : voie intrinsèque) et pro-thrombinase (Va-Xa : voie commune). Le reste est juste. D- Vrai. Le TFPI est un inhibiteur physiologique de la coagulation mais pas de la fibrinolyse ! Les 3 inhibiteurs de ma fibrinolyse sont et l’α2-antiplasmine, PAI-1 et le TAFI. Leur déficit provoque bien un saignement par excès de fibrinolyse. Page 25/25