Guía de laboratorio de genética 1 y 2.pdf

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Universidad Ricardo Palma Facultad de Medicina Humana Embriología & Genética LABORATORIO 1 CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO: PARTE 1 OBJETIVOS 1. Conocer los tipos de variantes en el número de copias (CNV). 2. Identificar el número de genes comprometidos en una CNV. 3. Correlación genotipo-fenotipo mediante el uso de plataformas informáticas. VARIANTES EN EL NÚMERO DE COPIAS Las variantes en el número de copias o CNV (del inglés copy number variation), están definidas como variaciones con un tamaño mayor a 50 pb, las cuales podrían estar en ganancia (duplicaciones) o en pérdida (deleciones). Clasificación La siguiente es una clasificación práctica para definir una CNV. 1. CNV patogénica: aquellas que involucre a más de 100 genes, que han sido descritos en base de datos como DECIPHER ®, OMIM, NCBI, etc., y que incluya a los genes con sensibilidad de dosis (haploinsuficiencia o triplosensibilidad). 2. CNV probablemente patogénica: aquellas que tienen un tamaño que involucre entre 10 a 100 genes o CNVs con tamaño mayor a 500 kb y con una frecuencia menor a 0,1% en estudios poblacionales. También serán consideradas aquellas CNVs encontradas en un caso aislado reportado en la literatura como patogénica y que afecten parcialmente a genes con sensibilidad de dosis. 3. CNV de significado incierto: su tamaño contiene a menos de 10 genes, no se ha reportado un hallazgo clínico, y no se encuentran dentro variaciones comunes. 4. CNV probablemente benigna, hay alguna evidencia que no causaría el fenotipo clínico del paciente, y son encontrados por ejemplo en el DGV. No está reportado como un polimorfismo común. 5. CNV benigna, son las que no tienen asociación con un fenotipo clínico, conocidos como polimórficos, son muy frecuentes en la población (>1%) y son clasificadas según base de datos curadas. Etiología Las variantes en el número de copias pueden ser ocasionadas de novo (dominantes), heredadas de ambos padres (recesivas autosómicas), o heredades de un solo progenitor (dominantes, recesivas ligadas al cromosoma X, disomías uniparentales). Fisiopatología Las CNVs patogénicas o probablemente patogénicas provocarán un fenotipo determinado según el gen o los genes afectados, si son en ganancia o pérdida, así como la combinación con factores ambientales, y otras variantes modificadoras (SNV, CNV). Dependiendo de si existiera un CNV en ganancia o pérdida provocará triplosensibilidad o haploinsuficiencia respectivamente. Otra manera de provocar un fenotipo es por la fusión de genes o disrupción de estos. Se ha encontrado  Universidad Ricardo Palma Facultad de Medicina Humana Embriología & Genética que algunas CNVs que no contienen genes (CNVs no codificantes), son regiones reguladoras de otro(s) gen(es). Por otro lado, el análisis cromosómico por micromatrices (CMA) con SNP, tiene la posibilidad de encontrar regiones con homocigosidad (ROH) el cual indicaría posibles disomías uniparentales o incluso indicarnos coeficiente de endogamia altos, lo cual estaría en relación con una posible entidad de herencia recesiva autosómica. Las disomías uniparentales, según la región afectada, estaría relacionada a genes que se ha modificado la impronta o la aparición de enfermedades recesivas autosómicas. REGIONES DE HOMOCIGOSIDAD (ROH- Regions of homozygosity-). Son segmentos del genoma que muestran homocigosidad continua. Si el ROH está entre 5-10 Mb podría indicar sugestivo de una entidad recesiva autosómica. Si el ROH es mayor a 10 Mb se podría deber a una disomía uniparental. Por otro lado, si el porcentaje total de ROH en los cromosomas autosómicos es mayor a 0,5% nos indicaría consanguinidad. MICROMATRICES Las micromatrices es una tecnología que consiste en utilizar un “chip” ordenado en filas, con la intención de poder analizar el ADN, expresión de genes (ARN), proteínas. A través del uso las micromatrices con la genómica comparada (CGH- comparative genome human-) o los polimorfismos únicos de nucleótidos (SNP- single nucleotide polymorphism) se determina las variantes en el número de copias en el genoma. A la técnica que determina estos CNVs en todo el genoma se le conoce con el nombre de análisis cromosómico por micromatrices. Los nombres alternativos utilizado en la la práctica clínica son: Chromosomal microarray analysis (CMA), Array CGH. El análisis cromosómico por micromatrices se realiza mediante el uso de marcadores, como oligonucleótidos, los cuales pueden ser polimórficos (SNP) o no polimórficos, las diferencias entre las plataformas son entre otras: i) El número de marcadores; ii) la densidad en el genoma; iii) distribución de marcadores en el genoma los que varía según los fabricantes, existiendo desde 60 mil hasta más de 2 millones. NOMENCLATURA DEL ANÁLISIS CROMOSÓMICO POR MICROMATRICES Normal: Mujer normal: arr(X,1-22)x2. Donde: arr=array 1-22= cromosomas autosómicos. X= cromosoma sexual. x2= Cantidad de material genómico encontrado (doble). Varón normal = arr(X,Y)x1,(1-22)x2 Donde: 1-22= cromosomas autosómicos. X,Y= cromosomas sexuales. x2= Cantidad de material genómico encontrado (doble). x1= Cantidad de material genómico encontrado (único). Anormal  Universidad Ricardo Palma Facultad de Medicina Humana Embriología & Genética hmz= Homocigosidad Paciente con deleción parcial (x1) que va desde la banda 1 de la región 2 hasta la subanda 1 de la banda 5 de la región 2a del brazo largo del cromosoma 6 (6q21q25.1), en las coordenadas siguientes 113900000-149100000. TRABAJO PRÁCTICO A continuación, Ustedes utilizarán los siguientes puntos de corte y realizarán una búsqueda en DECIPHER (https://decipher.sanger.ac.uk/), para lo cual, según las coordenadas, ustedes determinarán: 1. Tipo de CNV. 2. Número de genes comprometidos. 3. Tipo de herencia. 4. Existe una correlación con el fenotipo indicado en la solicitud del examen. 5. Es necesario otras pruebas genéticas en el paciente y familiares. Además, se utilizarán otros recursos como el OMIM (www.omim.org), ClinGen Dosage (https://dosage.clinicalgenome.org). Ejemplo: Paciente mujer de 8 años de edad con discapacidad intelectual, microcefalia, tricorexis nodosa, y facies dismórfica, se le realizó el CMA y se observó lo siguiente: 7p14(40100000-40265451)x0. PRIMER CASO Paciente mujer de 8 años, con diagnóstico de discapacidad intelectual, trastorno del espectro autista. Al examen físico se observa hipertelorismo, bermellón de labios gruesos, hipoplasia de alas nasales e hipertricosis. Se le realizó el CMA encontrando lo siguiente: 20q13.13(50822072-50909698)x1; 22q12.2q12.3(31707806-31879699)x1. SEGUNDO CASO Paciente mujer de 4 años con el diagnóstico de retraso psicomotor, estrabismo, microcefalia, hoyuelos retroauriculares, dobles de hélix, distonía y tiene como antecedente familiar de una hermana de 9 años con fenotipo similar. Se le realizó el CMA y el resultado es el siguiente: 21q11.2q21.1(13644165-17753420)x3, 5p15.33p14.1(113461-26924388)x1 TERCER CASO Recién nacida quien presenta comunicación interventricular, agenesia de falanges distales de 1º y 5º dedo bilateral, así como de los ortejos de ambos pies. Se le realizó el CMA y el resultado fue: 17p12(14179737-15579519)x1  Universidad Ricardo Palma Facultad de Medicina Humana Embriología & Genética TAREA Nº01 Niña de 3 años de padres no consanguíneos, quien presentó al nacimiento ileo meconial y posteriormente tuvo varias hospitalizaciones por infecciones recurrentes broncopulmonares. Se le realizó la prueba de sudor y se estableció que tenía una menor cantidad de cloro, haciendo el diagnóstico clínico de fibrosis quística. Se le realizó la determinación de 8 variantes patogénicas frecuentes del gen CFTR (utilizando la técnica de electroforesis) no observando ningún patrón de heterocigosis u homocigosis. Se solicitó el estudio de CMA y se encontró lo siguiente: 7q31.2(117447213-117665290)x0, 7q22.2q31.2(104808063-121795015) hmz mat. Según el cuadro clínico determine: 1. Tipo de CNV. 2. Número de genes comprometidos. 3. Tipo de herencia. 4. Existe una correlación con el fenotipo indicado en la solicitud del examen. 5. Es necesario otras pruebas genéticas en el paciente y familiares.  Universidad Ricardo Palma Facultad de Medicina Humana Embriología & Genética LABORATORIO DE GENÉTICA 2 CORRELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO: PARTE 2 OBJETIVOS 1. Conocer los tipos de variantes en un único nucleótido (SNV) o de múltiples nucléotidos. 2. Correlación genotipo-fenotipo mediante el uso de plataformas informáticas. Secuenciación La secuenciación de los didesoxinucleótidos de última o segunda generación automatizada del ADN es una interacción eficaz elegante entre la química, la ingeniería, programas informáticos y la biología molecular; el cual está basado en el descubrimiento de la secuenciación Sanger, con la finalidad de poder encontrar variantes patogénicas en zonas que ésta última técnica no detecta. La secuenciación masiva de última o segunda generación se puede clasificar en: 1. Secuenciación de exoma - clínico, el cual tiene la finalidad de encontrar variantes patogénicas en todos los exones de los genes que hasta la fecha se ha demostrado correlación con algún fenotipo determinado. 2. Secuenciación de exoma solo, detecta variantes patogénicas en los exones de todos los genes descubiertos a la fecha. 3. Secuenciación de exoma trío, detecta variantes patogénicas en todos los exones, pero que se compara los hallazgos con el de los padres; teniendo la finalidad de asegurar el estado de patogenicidad de las variantes encontradas en el caso índice. 4. Secuenciación de genoma, detecta variantes patogénicas en los exones e intrones de todos los genes. 5. Paneles, el cual tiene la finalidad de encontrar variantes patogénicas en un determinado número de genes que se manifiestan con alguna sintomatología determinada como miopatía, inmunodeficiencia, displasia esquelética. Variantes. También conocidas como mutaciones; los cuales son cambios en la secuencia de nucleótidos dentro de un genoma determinado. Estas podrían ser clasificadas como benignas, probablemente patogénicas, desconocidas, probablemente patogénicas y patogénicas. Etiología Las variantes genéticas patogénicas pueden ser ocasionadas de novo (dominantes), heredadas de ambos padres (recesivas autosómicas), o heredadas de un solo progenitor (dominantes, recesivas ligadas al cromosoma X, disomías uniparentales). Fisiopatología Las variantes genéticas patogénicas provocarán según el gen afectado, y por lo tanto la proteína expresada diferentes manifestaciones clínicas, el cual dependerá de varios factores, como el tipo de “mutación” (sin sentido, con cambio de sentido, cambio del marco de lectura), alelos comprometidos, variantes modificadoras entre otros. Esto provocará que la proteína obtenga una ganancia o pérdida de función. Epidemiología  Universidad Ricardo Palma Facultad de Medicina Humana Embriología & Genética Se ha descrito alrededor de 10 000 enfermedades genéticas distintas. Las enfermedades raras, son un grupo de estas enfermedades que tienen una presentación de 1 por cada 2 000 personas. Se estima que el número pacientes afectados es el 6-8% de la población en general; calculando por lo tanto que el número de personas afectadas en nuestro territorio es de hasta 2 400 000 personas. El 80% de las personas afectadas tienen como base una etiología genética. En relación a la heterogeneidad genética, hasta la fecha, se conoce que el número de fenotipos en los cuales hay una base genética es de más 7 000; a pesar de que hasta la fecha se ha descrito que el genoma humano contiene alrededor de 19 000 genes. Las manifestaciones clínicas se pueden observar desde la etapa fetal hasta la etapa de adulto mayor, observándose como anomalías congénitas, trastornos del neurodesarrollo (retraso psicomotor, trastorno del espectro autista, discapacidad intelectual), síndromes de neuroregresión, cáncer con características clínicas y epidemiológicas no correspondiente al grupo etáreo, epilepsia, talla baja o alta, entre otras. NOMENCLATURA g= secuencia de referencia de ADN genómico. No entrega información que se pueda relacionar al ARN o a la proteína. Ej. g. 12168663A>G c= secuencia de referencia de ADN codificante. Entrega una información que se pueda relacionar con el ARN y la proteína Ejemplos: c. 1637A>G → Variante en una posición codificante. c. 859+12 T>C→ Variante en una región intrónica (contado desde la posición 5’). c. 2396- 6G>A → Variante en una región intrónica (contado desde la posición 3’). Sustitución →c.123A>G Deleción →c.123delA Duplicación →c.123dupA Inserción →c.123_124insC Referencias de secuencias (RefSeq) son secuencias de base de datos de la secuencia de ADN, ARN y sus proteínas (Ej. NC= Molécula genómica completa, NM= ARN mensajero, NP= Proteína.) TRABAJO PRÁCTICO En la siguiente práctica utilizaremos la base de datos ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) y OMIM (www.omim.org) de los siguientes casos clínicos, y verificaremos según la misma lo siguiente: 1. Tipo de variante única o SNV (missense, frameshift, nonsense). 2. Determine si se encuentra en heterocigosis, homocigosis, hemicigosis, heterocigosis compuesta 3. Tipo de herencia. 4. Correlación genotipo-fenotipo. 5. Indique pronóstico y terapias. 6. Es necesario otras pruebas genéticas en el paciente y familiares.  Universidad Ricardo Palma Facultad de Medicina Humana Embriología & Genética Ejemplo: Paciente varón de 9 años con talla alta, facies alargada, subluxación del cristalino, dedos y ortejos alargados y delgados, pectus excavatum. Se le solicitó la secuenciación del gen FBN1 y se encontró la siguiente alteración: NM_000138.4(FBN1):c.8056T>C (p.Cys2686Arg). PRIMER CASO Paciente varón de 8 años, que presenta disminución de la fuerza muscular desde los 3 años; actualmente se observa caminata anadeante, camina de puntas, contractura de tendón de Aquiles. Se le realizó el estudio de deleciones y duplicaciones del gen DMD, a través de la técnica de MLPA, el cual fue negativo. Se le solicitó una secuenciación genómica y se encontró la siguiente variante: NM_004006.2(DMD):c.10783C>T (p.Gln3595Ter). SEGUNDO CASO Paciente mujer de 2 años, con antecedente de fracturas desde recién nacida. Al examen físico se observa facies triangular, escaleras azules, talla baja y deformidad de muslos y antebrazo. Se realizó la secuenciación de exoma clínico y se determinó la siguiente variante: NM_000088.3(COL1A1):c.4391T>C (p.Leu1464Pro). TERCER CASO Paciente mujer de 10 años, quien presenta disminución de fuerza muscular desde los 5 años, y que desde los 9 años utiliza silla de ruedas. Su desempeño escolar es superior/alto. Se le realizó el estudio de la deleción del exón 7 del gen SMN1, el cual fue negativo. Tiene el antecedente de hermano de 8 años con cuadro clínico similar. Se le realizó una secuenciación de exoma clínico teniendo como resultado NM_007294.4(BRCA1):c.5542C>T (p.Gln1848Ter). TAREA Nº02 Paciente varón de 10 años, acude a la consulta con el diagnóstico clínico de síndrome Marfan por presentar diagnóstico de subluxación del cristalino, pectus excavatum, úvula bífida y facies con cresta nasal cóncava. Antecedentes de padres consanguíneos, hermano mayor de 12 años con cariotipo 47,XYY y no presenta familiares con la misma condición. Tiene un estudio de cariotipo y CMA, los cuales fueron 46,XY y arr(X,Y)x1,(1-22)x2, respectivamente. Se le realizó secuenciación de exoma trío y se encontró una variante en homocigosis en el gen ASPH (c.171G>A / cDNA.359G > A / g.30476G > A / chr8:61684121 C > T / p.W57*). Indique lo siguiente: 1. Tipo de variante única o SNV (missense, frameshift, nonsense). 2. Determine si se encuentra en heterocigosis, homocigosis, hemicigosis, heterocigosis compuesta. 3. Tipo de herencia. 4. Correlación genotipo-fenotipo. 5. Indique pronóstico y terapias. 6. Es necesario otras pruebas genéticas en el paciente y familiares.