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Elettrofores i Indica la migrazione di molecole attraverso un mezzo fluido e sotto l’impulso di un campo elettrico (differenza di potenziale) sulla base di proprietà fisiche o chimiche quali: (1) dimensioni (2) forma (3) carica elettrica ...

Elettrofores i Indica la migrazione di molecole attraverso un mezzo fluido e sotto l’impulso di un campo elettrico (differenza di potenziale) sulla base di proprietà fisiche o chimiche quali: (1) dimensioni (2) forma (3) carica elettrica  In biologia tale termine è ristretto allo studio qualitativo e/o quantitativo della migrazione di molecole che presentano gruppi acidi o basici cioè ionizzabili (DNA, RNA, Proteine, peptidi, aminoacidi) Elettrofores i La molecola si muove verso l’elettrodo di segno opposto con una velocità proporzionale al campo elettrico e alla sua carica ma inversamente proporzionale all’attrito del mezzo stesso  Elettroforesi capillare Elettroforesi su Tipi di elettroforesi: acetato di cellulosa Elettroforesi su gel di agarosio Elettroforesi su gel di poliacrilammide Elettroforesi bidimensionale  Apparecchiature per elettroforesi con supporti solidi Alimentatore Cella o vaschetta orizzontali Cella o vaschetta verticali Elettroforesi su supporto solido per sieroproteine (protidogramma) L’ elettroforesi delle sieroproteine può essere effettuata su «fogli sottili» di acetato di cellulosa o su gel di agarosio purificato o di poliacrilammide; Questa tecnica permette di separare le proteine presenti nel sangue o da altro materiale biologico. L’utilizzo del siero come campione biologico permette di inattivare le proteasi presenti nel plasma che altrimenti darebbero una sottostima nelle determinazioni. La richiesta di elettroforesi delle proteine sieriche viene fatta in seguito a sospetto di patologie immunoproliferative, malattie del fegato, malattie croniche, malattie autoimmuni, ecc. Preparazione del campione: separazione su acetato di cellulosa Il siero viene diluito in un tampone a pH 8,6: in queste condizioni le proteine sieriche (ad es. l’albumina con punto isoelettrico=6), assumono carica netta negativa, in quanto le cariche + vengono neutralizzate dalle cariche OH- del tampone, quindi migrazione verso l’anodo (+). Il siero viene applicato all’estremità catodica (-). Successivamente si applica un campo elettrico di 180-220V. Al termine della corsa (15 min circa) le proteine sulla striscia vengono fissate in 10% acido tricloroacetico e poi Colorate con Rosso Ponceau o Amido Black per 20 minuti. Il colorante in eccesso viene lavato via con acido-acetico metanolo acqua (10:50:40 v/v)  Interpretazione 1 1.L’albumina è la 1 proteina più 23 4 espressa 5 2.alfa-1-globuline 3.alfa-2-globuline Alb 55-64% 4.beta1-globuline 2 α1 2.3-4.5% 5.gamma- α2 7-9% globuline β 9-13% γ 14-18% L’analisi semiquantitativa (qualitativa) viene eseguita mediante densitometro a scansione; l’intensita della colorazione è proporzionale alla quantità di proteine. Si ottiene un tracciato (profilo) in cui le singole bande sono rappresentate da picchi di diversa altezza e larghezza. L’altezza della curva può essere immaginata come la quantità relativa di quello specifico tipo di proteine. accumolo di proteina M nel midollo osseo e nel sangue identifica la gammopatia monoclonale Quando un clone di plasmacellule produce una proteina M, si ha una modifica dell’elettroforesi. Una proteina monoclonale può migrare ovunque nella regione gamma globuline. Gammopatie: rialzo della curva gamma dovuto ad una serie di disordini immunoproliferativi cronici caratterizzati da produzione di elevate quantità di Igs di tipo policlonale o monoclonale. A Picco largo : eterogeneità policlonale C Picco stretto: omogeneità e monoclonalità  Componente monoclonale (CM): Presenza nel siero di immunoglobulina omogenea che viene prodotta da un singolo clone di plasmacellula in modo autonomo (Mieloma) o in risposta ad un antigene non noto. L’immunofissazione o immunoelettroforesi può essere utilizzata per identificare le bande anomale rilevate mediante elettroforesi proteica al fine di determinare quale tipo di anticorpo è stato prodotto: IgA, IgM, IgG Testo  le ig sono costituite da due parti unite tra loro le catene leggere e le catene pesanti. in un individuo con gammopatie monoclonale a causa di un comportamento anomalo delle plasmacellule le catene leggere non sono legate alle catene pesanti e si possono ritrovare nel sangue. Lìimmunoelettroforesi si avvale dell’applicazione di anticorpi contro le proteine sieriche già separate elettroforeticamente: fissazione in situ mediante anti-siero monospecifico. Si generano archi di precipitazione dovuti alla reazione antigene-anticorpo visibili mediante l’applicazione di una soluzione cromogena (colorazione diretta). La concentrazione della Componente monoclonale deve soddisfare le condizioni di equilibrio necessarie per la formazione di uno stabile immunocomplesso! Precipitazione sulla banda delle IgA , delle IgM, delle IgG, Kappa o Lambda, che permette di riconoscere a quale classe di immunoglobuline Componente monoclonale in appartiene la proteina M zona Gamma di tipo IgG Lambda L’immunofissazione permette di stabilire a quale isotipo appartiene la componente monoclonale presente nel sangue e nelle urine.Dopo che la componente monoclonale è stata tipizzata e quantificata, bisogna identificare gli eventuali danni causati dalla malattia a organi e tessuti. A questo scopo si utilizzano: - l'emocromo, cioè la conta delle cellule del sangue, che serve a valutare la funzionalità del midollo osseo; - gli esami chimici del sangue, che misurano la funzionalità renale e la quantità di calcio nel sangue. Gel di agarosio L’agarosio è un polisaccaride che si presenta come polvere biancastra insolubile in acqua fredda. Il gel si prepara scaldando la sospensione acquosa a temperatura di ebollizione e lasciando raffreddare. A 40-45°C si ha formazione di un gel. Durante la gelificazione, polimeri di agarosio si associano in modo non covalente per formare «un setaccio molecolare» con pori di varia grandezza La consistenza del gel dipende dalla percentuale in peso/volume di agarosio. Maggiore è la concentrazione di agarosio migliore è la separazione di molecole di piccole dimensioni e viceversa gel a bassa concentrazione separano meglio molecole i grandi dimensioni. Caratteristiche dell’elettroforesi su gel di agarosio Impiegato per elettroforesi degli acidi nucleici (DNA e RNA) di dimensione variabili in quanto ha pori abbastanza grandi da far passare queste molecole di grandi dimensioni (1 kilobase di DNA= 650kDa), ma anche per alcune proteine. Le molecole di DNA hanno tutte lo stesso rapporto massa/carica. L’elettroforesi su gel richiede molto più tempo rispetto a quella che avviene su carta o su acetato di cellulosa.  Elettroforesi di DNA I gel sono fatti di agarosio ma possono essere anche di poliacrilammide In presenza di tampone con pH >4 gli acidi nucleici assumono una carica intrinseca netta negativa; I tamponi utilizzati sono: TRIS-Acetato-EDTA (TAE) 0.001M pH8 o TRIS-borato 0.089M a pH8.4 con EDTA 0.002M (TBE). La sospensione contenente DNA o RNA viene colorata con Blu di bromofenolo. I campioni di DNA vengono caricati ed e’ applicata una differenza di potenziale Dal momento che il DNA è carico negativamente, esso migra verso l’elettrodo “+” I frammenti di DNA piu’ piccoli migrano piu’ velocemente: + la distanza percorsa è inversamente proporzionale al log del suo peso molecolare  La velocità di migrazione di una molecola di DNA attraverso un gel di agarosio dipende da: 1) dimensione della molecola di DNA; 2) concentrazione di agarosio; 3) DNA conformazione; 4) tensione applicata, 5) presenza di bromuro di etidio, 6) tipo di agarosio e 7) tampone di elettroforesi.  Alla soluzione di agarosio viene aggiunto del bomuro di etidio (EtBr) il quale si inserisce (intercala) nel DNA in base alla sua concentrazione e mostra una fluorescenza arancione-rossa se illuminato da luce UV (fluorescenza su transilluminatore). Ciò consente una stima della quantità di DNA in base alla sua intensità di colore. A causa della sua carica positiva, l'uso del EtBr riduce il tasso di migrazione DNA del 15%. Coloranti alternativi sono Blu di Metile e Crystal Violet che non richiedono l'esposizione del gel di luce UV per la visualizzazione delle bande di DNA, sebbene la loro sensibilità è inferiore. Sono meno tossici di EtBr pertanto è possibile recuperare il frammento di DNA dal gel con più facilità  Elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) per proteine E’ una delle metodiche più utilizzate per separare proteine (con diverse cariche e diversa forma) e DNA di piccole dimensioni (fino a 2000 bp) è l’utilizzo di gel di poliacrilammide Le proteine sono molto piu’ piccole del DNA Amminoacido medio = 110 Da Paio di nucleotidi medio = 649 Da 1 kilobase di DNA = 650 kDa 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kDa  Perché il gel di poliacrillamide? Il gel di poliacrilammide ha una trama più compatta, è trasparente, termostabile e si può variare la porosità variando la percentuale di acrilammide (effetto setaccio). I pori hanno dimensione minori del gel di agarosio e pertanto più ideneo a molecole più piccole del DNA e a proteine L'acrilammide è una potente neurotossina e nella forma non polimerizzata, è facilmente assorbita attraverso la pelle. Una volta avvenuta la gelificazione perde la sua pericolosità in quanto non è più assorbita. Il gel viene preparato facendo co-polimerizzare l’acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N’-metilenbisacrilammide. Quest’ultima forma legami crociati con l’acrilammide creando un gel a struttura ben definita. La polimerizzazione si ottiene per catalisi radicalica aggiungendo TEMED e APS.  La struttura secondaria / terziaria ed eventualmente quaternaria delle proteine viene persa a causa dell’utilizzo di detergenti ionici (i.e. SDS) o agenti denaturanti non ionici Elettroforesi su gel di (i.e. UREA). poliacrilammide L’UREA denatura lasciando alla proteina una carica (PAGE) propria. L’SDS o sodio dodecil solfato è un detergente ionico che condizioni “denaturanti” solubilizza e denatura le proteine. Inoltre questo della proteina detergente aggiunge cariche negative alle proteine. La denaturazione delle proteine è ottenuta anche bollendo e aggiungendo ditiotreitolo (DTT) o b-mercaptoetanolo che rompono i legami disolfuro.  Elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS (SDS-PAGE) le molecole hanno tutte stesso rapporto carica/massa Proteina Nativa Carica netta: -5 Proteina trattata con SDS Carica netta: Molto (-) L’SDS conferisce alla proteina una carica UNIFORME per unità di massa pertanto la separazione avviene in base al peso molecolare  Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle proteine prima dell’elettroforesi Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2° e 3°; legami disolfuro Condizioni covalenti) “non denaturanti” Le proteine conservano la loro carica normale Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma  Schema riassuntivo Procedimento per Elettroforesi in SDS (SDS-PAGE): I campioni vengono risospesi in un tampone di caricamento. Segue una bollitura di 2 minuti per assicurarne la denaturazione. Si procede al caricamento nei pozzetti (gel di deposizione)  Un tampone (Tris) per fornire il giusto pH (6,8) SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica negativa complessiva Cosa c’è nel Glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli scendere tampone di nei pozzetti caricamento ? Un agente riducente (DTT o b-Mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni elettroforesi su gel di page e una tecnica che permette di separare le proteine in un campo elettrico.le proteine da analizzare si trovano in un tampone contenente SDS e DTT , SDS denatura le proteine e le carica negativamente il DTT rompe i ponti disolfuro distruggendo la struttura terziaria della proteina. le proteine corrono verticalmente verso il polo + situato nella parte bassa della cella L’SDS PAGE è caratterizzato da uno «stacking gel» (gel di deposizione) al 4% (Tris-HCl pH 6,8) in cui le proteine si impacchettano e da un «running gel» (gel di separazione) (Tris- HCl pH 8,8) in cui si separano in base al loro peso molecolare (kD, PM). La percentuale del gel (% acrilamide) si sceglie in base al PM delle proteine che si vogliono analizzare. % di acrilammide Dimensioni delle consigliata proteine 8% 40-200 kDa 10% 21-100 kDa Stacking gel 12% 10-40 kDa  Una volta caricati i campioni si effettua un’elettroforesi verticale ad un voltaggio di 80-120V. Una volta terminata la corsa il gel può essere colorato con Blu di Coomassie (come gel di agarosio) e poi decolorato per mostrare le proteine. In generale però si procede con la fase successiva del Blotting. + kD mm Le proteine cariche 203 135 8. negativamente si 86 1 5 muovono verso 2.0 1 250 l’elettrodo positivo 8.5 41 Dimensioni in kDa 200 2 Proteine piu’ piccole 8.0 33 150 si muovono piu’ 3 4.0 100 velocemente 19 50 4 Le proteine si 1.5 0 8 separano per 4 0 20 40 60 dimensione 4.5 _ Distanza (mm dal pozzetto)  Visualizzazione delle proteine nel gel I due metodi piu’ usati sono: Colorazione con il Coomassie Brilliant Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere visualizzato ~1ng di proteina per banda) Coomassie staining Silver staining  Indica il trasferimento per capillarità (blotting) o per elettroforesi di Metodiche DNA, RNA o proteine dopo separazione dal gel di poliacrilammide ad una membrana di supporto o filtro su cui effettuare ulteriori Blotting analisi; costituisce una replica delle molecole del gel. E’ essenziale a determinare le quantità e il peso molecolare di una molecola all’interno di una miscela. La prima metodica di blotting per identificare sequenze di DNA fu messa a punto da Edwin Mellor Southern e prese il nome di Southern Blot. Il principio si basa sull’ibridazione dei frammenti di DNA con sonde radioattive o fluorescenti. Il DNA dopo separazione su gel viene denaturato e trasferito su un supporto e messo a reagire con un oligonucleotide di sequenza nota radioattivi o uniti ad un fluoroforo, il quale si legherà alla sequenza complementare sul frammento di DNA. La stessa metodica può essere usata per identificare sequenza di RNA. In tal caso la metodica prende il nome di Northern Blot.  Southern Blot: Per l’analisi del DNA. (sonda = DNA o RNA) Northern Blot: Per l’analisi dell’RNA. (sonda = DNA o RNA) Western Blot: Per l’analisi delle proteine così denominata da W.N. Burnette nel 1981 (sonda = anticorpo)  A cosa serve il Western Blot? Qual’è la proteina che mi interessa? – SDS-PAGE (non certo) Si basa sul confronto di peso molecolare – Western blot (certo) Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo – ? +  Esecuzione: Prima Fase: Separazione monodimensionale tramite SDS-PAGE Seconda fase: Il gel viene messo a contatto con strisce (o fogli) di nitrocellulosa o PVDF per trasferimento elettrico delle proteine cariche negativamente sulle strisce (blotting) Terza fase: saturazione o blocking per prevenire le interazioni non specifiche tra l’anticorpo e la membrana (viene fatta utilizzando albumina sciolta in tampone) Quarta fase: Incubazione della striscia con l’anticorpo (primario) contro la proteina di interesse. Seguito da Lavaggi e Incubazione con l’anticorpo secondario coniugato con HRP che riconosce il primario. Lavaggi Quinta fase: Incubazione con il sistema di rilevazione dell’anticorpo secondario tramite ECL Enhanced Chemiluminescence. Sesta fase: Sviluppo «detection» della reazione su lastra fotografica.  Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Trasferimento dal catodo (-) all’ anodo (+) Spugnette 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento Gel Membrana 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento Componenti del tampone di trasferimento: Spugnette – 25mM Tris – 190mM glicina – 20% metanolo  Anticorpi secondary coniugati con perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) Western blot: Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato – rilevazione o Substrati Chemioluminescenti (luminolo) Emettono luce se convertiti dall’enzima “detection” Possono essere visualizzati su lastre radiografiche Anticorpi secondary coniugati con radioattivi Anticorpi secondarii biotinilati  Schema riepilogativo dei passaggi di western blot Elettroforesi bidimensionale (2D PAGE) Si usa per separare miscele complesse di proteine. Le proteine vengono prima separate in base alla loro carica elettrica e poi in base al loro peso molecolare in presenza di SDS. E’ possibile separare proteine che differiscono di 0.1 unità di pH e di 1000 dalton nel loro peso molecolare. Tale tecnica viene impiegata per la risoluzione di proteine plasmatiche, ribosomiali, di membrana, ecc. La 2D PAGE ha consentito lo sviluppo della proteomica che studia il proteoma. Questo si ottiene sottoponendo a 2D PAGE un estratto cellulare, di un organo o di un tessuto ottenendo un quadro di espressione di migliaia di proteine. Tale quadro caratteristico di quel tessuto può essere poi paragonato con altri tessuti o con lo stesso tessuto durante una malattia o patologia.