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Elektrophorese Teil 2 Stand: 03.09.12 ELEKTROPHORESE I) elektrophoretische Verfahren allgemein: Elektrophorese ist die Wanderung geladener Teilchen (Ionen) in einem elektrischen...

Elektrophorese Teil 2 Stand: 03.09.12 ELEKTROPHORESE I) elektrophoretische Verfahren allgemein: Elektrophorese ist die Wanderung geladener Teilchen (Ionen) in einem elektrischen Feld. Die elektrophoretische Beweglichkeit – Mobilität - ist eine substanzspezifische Größe, die die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld bestimmt und damit für eine Trennung entscheidend ist. Unterschiedliche Ladungen, Formen und Größen der Teilchen bewirken ein unterschiedliches elektrophoretisches „Migrationsverhalten“. Weiters hängt die Beweglichkeit von der Temperatur ab sowie (ev. auch) vom pH-Wert und bei der Gelelektrophorese auch von der Porengröße des Gels. Durch unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten der Einzelsubstanzen eines Substanzgemisches im elektrischen Feld wird dieses während der Elektrophorese in einzelne Zonen aufgetrennt. Für Proteine werden im wesentlichen zwei unterschiedliche Verfahren angewandt: a) Zonenelektrophorese: in einem homogenen Puffersystem Die Zonenelektrophorese ist eine Trennung von Ionen in einem homogenen Puffersystem mit konstantem pH-Wert durch ein elektrisches Feld, wobei die Trennung nach der elektrophoretischen Mobilität erfolgt. In unserem Fall untersuchen wir Proteine, deren elektrophoretische Mobilität abhängig ist von ihrer Größe und Ladung. In der Biochemie / Molekularbiologie / Zellbiologie wird meist die denaturierende SDS-Gelelektrophorese durchgeführt (so auch hier; "SDS-PAGE", siehe unten): alle Proben-Proteine werden durch das Detergens SDS (siehe unten) denaturiert (entfaltet) und erhalten gleichzeitig von SDS eine negative Ladung, wandern also in Richtung Anode. Manchmal wird eine native Gelelektrophorese durchgeführt: hier erfolgt die Ionenwanderung aufgrund der "natürlichen" Ladung der verschiedenen Proteine, die vom pH-Wert des Elektrophorese- und Gel-Puffers abhängt. In beiden Fällen bestimmt man die relative elektrophoretische Mobilität gegenüber der Front. Man lässt einen (niedermolekularen, d.h. „kleinen“) ionischen Farbstoff (Bromphenolblau) mitlaufen, den man als Front definiert. b) Isoelektrische Fokussierung: in einem pH-Gradienten Dies ist ebenfalls eine Variante der nativen Gelelektrophorese (ohne SDS-Behandlung): die Wanderung der Proteine erfolgt also aufgrund ihres relativen Gehalts an sauren und basischen Aminosäureresten. Je nach pH-Wert des Gels tragen diese Aminosäuren unterschiedliche Ladungen, die sich zu einer Nettoladung summieren. Am isoelektrischen Punkt (pI) eines Proteins beträgt seine Nettoladung null. Bei diesem pH-Wert im Gel wird die elektrophoretische Beweglichkeit also null. Das Proteingemisch wird daher auf ein Gel aufgetragen, in dem zuvor ein pH-Gradient etabliert wurde. Jedes Protein bewegt sich nun im elektrischen Feld so weit, bis sein pI dem pH-Wert des Gels entspricht. Dort wird dieses Protein konzentriert ('fokussiert'). II) SDS-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese): Trennung von Proteinen nach ihrer Molekülgröße SDS (sodium dodecyl sulfate) ist ein anionisches Detergens, das Micellen aus je einer Proteinkette und angelagertem SDS bildet. SDS überdeckt die Eigenladungen der Proteine (siehe "native Elektrophorese" oben), sodaß alle Proteine negativ geladen werden und zur Anode wandern. Außerdem werden die unterschiedlichen Molekülformen (globuläre versus stäbchenförmige Proteine) ausgeglichen, indem die Tertiär- und Sekundärstrukturen durch Aufspalten der Wasserstoffbrücken aufgelöst werden (Denaturierung der Proteine bei der Probenvorbereitung: Erhitzen der Proben mit SDS auf 95°). Alle Proteinketten bilden dann vergleichbare ellipsoide Zufallsknäuel, deren Größe nur vom Molekulargewicht abhängt. Obwohl die Menge an gebundenem SDS und somit die Ladung proportional zur Kettenlänge (bzw. Molekulargewicht) ist, wandern größere Proteine nicht schneller, sondern wegen des Siebeffekts langsamer. Aus beiden Effekten (Molekül-Ladung und -größe) resultiert ein linearer Zusammenhang zwischen Logarithmus des Molekulargewichts (logM) und Wanderungsgeschwindigkeit (gemessen als RF-Wert). Mit Hilfe von Protein-Standards (mit bekanntem M) können die Molekulargewichte der Proben-Proteine ermittelt werden. Theoretische Grundlagen Seite 1 von 5 Elektrophorese Teil 2 Stand: 03.09.12 Disulfidbrücken, die zwei Protein-Untereinheiten kovalent zusammenhalten (Abb. oben, a) werden durch Zugabe einer Thiolverbindung (Merkaptoethanol) reduktiv aufgespalten (b). Die Untereinheiten werden nun wie unabhängige Proteine aufgetrennt. DISK- (diskontinuierliche) Elektrophorese: zweigeteilte Gel-Matrix mit Puffer-Kombination Die SDS-PAGE wird fast immer als DISK-Elektrophorese durchgeführt (aus Zeitgründen wird jedoch im Praktikum nur das Trenngel hergestellt), um schärfere Banden zu erhalten. Die Gelmatrix ist in zwei Bereiche eingeteilt (es werden zwei Gele übereinander gegossen): das engporige Trenngel, darüber das weitporige Sammelgel. Außerdem kombiniert man verschiedene Puffer miteinander: Tris-Glycin pH 8,3 im Elektrophoresepuffer, Tris / Chlorid pH 6,8 im Sammelgel, Tris / Chlorid pH 8,8 im Trenngel. Der pH-Wert des Sammelgels liegt nahe beim isoelektischen Punkt des Glycins. Dadurch hat das aus dem Elektrophoresepuffer einwandernde Glycin eine sehr niedrige Mobilität und wird zum "Folge- Ion". Die Chlorid-Ionen haben hingegen eine sehr hohe Mobilität und sind "Leitionen". Zwischen diesen beiden Ionenarten wandern die Proteine und konzentrieren sich in schmalen Zonen (Banden) (Sammel- oder "Stacking"- Effekt). Bei Eintritt in das engporige Trenngel kommt es zu weiterer Bandenverschmälerung. Dieser Effekt tritt auch ohne Verwendung des Sammelgels auf: wegen der größeren Mobilität der Proteine in der gelfreien Auftragetasche werden die bereits ins Gel eingewanderten Proteinmoleküle weitgehend eingeholt. Theoretische Grundlagen Seite 2 von 5 Elektrophorese Teil 2 Stand: 03.09.12 III) Polyacrylamid-Gel: radikalische Polymerisation Polyacrylamid-Gele sind dünner als Agarose-Gele, meist 0,5-2 mm dick. Sie entstehen durch chemische Copolymerisation des Monomers Acrylamid mit dem vernetzenden Monomer N,N`-Methylenbisacrylamid (Bis): Polymerisationsmechanismus: 1.) In Wasser gelöstes O O O Ammoniumperoxodisulfat (APS) zerfällt leicht durch O S O O S O 2 O S O homolytische Bindungs- O O O - spaltung in SO4 -Radikale: Radikale sind Elektronenmangelverbindungen! Die Radikalbildung wird daher - durch Zugabe geeigneter LEWIS-Basen (e -Donoren) katalysiert! Daher gibt man eine organische Base zu (TEMED = N,N,N´,N´,-Tetramethyl-ethylendiamin)! - 2.) Die SO4 -Radikale O O starten die Kettenreaktion O S wie folgt: Startradikal SO4- O O O NH2 NH2 3.) Die Kettenreaktion setzt sich mit weiteren O O Monomeren fort zu: O O S O O O O NH2 O + S O O NH2 O NH2 NH2 O O O NH2 NH2 O O O NH2 O S O NH2 O O S O O O O NH2 NH2 usw...... 4.) Bis sich letztlich lange, O NH2 O NH2 O NH2 O NH2 O NH2 O NH2 O NH2 lineare Ketten (Polymere) bilden: n * Theoretische Grundlagen Seite 3 von 5 Elektrophorese Teil 2 Stand: 03.09.12 5.) Die Quervernetzung des Gels erfolgt, indem N,N´- Methylenbisacrylamid in je zwei Polymerketten mit auspolymerisiert: 6.) Der Abbruch der NH2 Kettenreaktion erfolgt z.B. NH2 durch „Rekombination“ R O zweier Radikale: R O R O R O NH2 NH2 D.h.: Während also die Polymerisation der Acrylamid-Moleküle lineare Polymere ergibt, führt das Vorhandensein von „Bis“ im Polymerisationsansatz zu einer Quervernetzung (=> poröse Gelsubstanz). Die Acrylamidkonzentration im Ansatz bestimmt daher die Menge der Ketten, die Bis-Konzentration den Vernetzungsgrad. Die Polymerisation soll unter Luftabschluss erfolgen, da O2 als Radikalfänger wirkt. Die meisten Arbeitsvorschriften sehen daher ein Entgasen der Reaktionslösungen vor der Zugabe von APS und TEMED vor, um gelösten Sauerstoff zu entfernen. Will man dieses Entgasen unterlassen, muss man für die Polymerisation entsprechend mehr APS und TEMED (1,5 – 2 fache Menge) einsetzen. Zu schnelle Polymerisation (als Folge von zu hoher APS- bzw. TEMED- Dosierung) kann sich allerdings negativ auf die Homogenität des Gels auswirken. Inhomogene Gele liefern schlechte bis keine Trennung und sind oft nicht auswertbar! Die Porengröße der Polyacrylamidgele wird bestimmt durch Totalacrylamidkonzentration T und Vernetzungsgrad C (crosslinking) und lässt sich dadurch exakt und reproduzierbar einstellen. Das Verhältnis der beiden Substanzen zueinander bestimmt die Eigenschaften des resultierenden Gels, insbesondere Porengröße und Elastizität. Bei konstantem C und steigendem T wird die Porengröße (a b) *100 kleiner. Bei konstantem T und steigendem C folgt die T [%] a…Masse an Acrylamid in [g] Porengröße einer parabolischen Funktion: bei hohen und V b…Masse an Methylen- niedrigen C-Werten erhält man große Poren, die kleinsten Poren entstehen bei 4-5% C. Üblicherweise werden für b *100 bisacrylamid in [g] Standardanwendungen Verhältnisse von ca. 35 : 1 (Acryl- C [%] V…Volumen in [ml] amid : Bis) verwendet. Die Dichte bzw. Festigkeit ( a b) des Gels wird zudem durch den Gesamtgehalt der beiden Substanzen im Ansatz bestimmt. Je nach Größe der zu trennenden Sunstanzen kann man dabei zwischen 4% T (bis 1000 kDa) und 20% T(bis 5 kDa) variieren. !!! Zur Charakterisierung der Gelqualität sind der T- und der C-Wert immer anzugeben!!! Theoretische Grundlagen Seite 4 von 5 Elektrophorese Teil 2 Stand: 03.09.12 IV) Introduction to protein structure Proteins (Eiweißstoffe) are biologically active molecules (each of the thousands of different proteins occurring even in a simple bacterial cell has a certain biological function) which consist of one or more polypeptides. A polypeptide is a linear polymer (also called "chain") of 20 different amino acids linked together by amide bonds (in this case called peptide bonds); one particular amino acid can occur in high copy number in one polypeptide molecule. Most polypeptides contain 100 – 10.000 amino acid units, so they differ greatly in chain length; the average molar mass (M) of one amino acid is ca. 100 g/mol, so polypeptides (and proteins) have molar masses in the range 10.000 – 1.000.000 g/mol. Since these numbers are unpractical, the unit "kilodalton" (kDa) is used for proteins: 1 Da = 1 g/mol, 1 kDa = 1000 g/mol. So the M range of proteins translates to 10 – 1000 kDa. Some proteins (e.g., catalase, serum albumin) consist of one single polypeptide. Many proteins contain two or more polypeptides called protein subunits; depending on the particular protein, these can be copies of the same polypeptide or different polypeptides of similar or different chain length. Furthermore, subunits are bound either non-covalently (mostly by hydrogen bridges, e.g., hemoglobin) or, in addition, covalently by disulfide bridges (e.g., immunoglobulin = antibody; see above: "SDS-PAGE"). Four levels of protein structure are distinguished: The primary structure is defined by the chain length and amino acid sequence of the polypeptide(s). The secondary structure is defined by the regular folding of parts of the polypeptide chain into -helices and -folds ( -Faltblatt) by intramolecular hydrogen bonds. The tertiary structure is defined by the specific 3-dimensional folding of the total polypeptide chain. The quartery structure is defined by the assembly of two or more polypeptide subunits. For SDS-PAGE, the primary structure is not changed, but the secondary and tertiary structure are disrupted by SDS. The quartery structure is only completely disrupted (the subunits are separated) by SDS in the absence of disulfide bridges. Otherwise the disulfide bridges have to be broken by mercaptoethanol (as described above and in the left Fig.) Two subunits of different size will then give two bands in the gel (left lane; without mercaptoethanol the subunits will stick together to give a single band). The far left Fig. shows the migration of three polypeptides of different sizes through the gel network (see above): the smallest polypeptide is the fastest. Theoretische Grundlagen Seite 5 von 5