Dogma centrale della biologia.pdf

LE SBOBINE DI ROBERTO MANCUSI ✓ CONTENUTI DI TUTTE LE LEZIONI ✓ CON LE IMMAGINI DELLE SLIDE ✓ CON TUTTE LE PATOLOGIE TRATTATE A LEZIONE PREFAZIONE Tralasciando che probabilmente questa prefazione sarà letta da pochi, vi lascio le mie sbobine del co...

LE SBOBINE DI ROBERTO MANCUSI ✓ CONTENUTI DI TUTTE LE LEZIONI ✓ CON LE IMMAGINI DELLE SLIDE ✓ CON TUTTE LE PATOLOGIE TRATTATE A LEZIONE PREFAZIONE Tralasciando che probabilmente questa prefazione sarà letta da pochi, vi lascio le mie sbobine del corso di biologia molecolare e cellulare dell’anno accademico 2023/2024. Vorrei ringraziare Kikka Simeone per avermi passato parte dei suoi appunti per molecolare, Marianna Gambuli per parte della biogenesi degli organelli e della mitosi, e Andrea Esposito per parte della matrice cellulare. Le lezioni sono state così strutturate: Biologia molecolare Parisi Membrane, biogenesi degli organelli, via Paladino secretoria e citoscheletro Ciclo cellulare e apoptosi Parisi Mitosi Libro Giunzioni e matrice extracellulare Venditti Sviluppo degli organismi pluricellulari e cellule Parisi staminali Mi rendo conto che alcune cose possano non essere state scritte in maniera del tutto chiara, ma queste sbobine sono nate come appunti presi per me a lezione e poi sono evoluti in questo enorme progetto. Personalmente non ho sentito la necessità di approfondire dall’Alberts, ma consiglio comunque di consultarlo per un secondo parere, in quanto cose che potrebbero sembrare sciocchezze su questi appunti potrebbero risultare importanti per ottenere una visione globale di come funziona la cellula. Detto questo vi auguro un buono studio e vi chiedo di scrivermi in privato per inviarmi dei feedback. Baci Roberto 1 Sommario DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA: IL DNA.................................................................. 6 STRUTTURE RICORRENTI................................................................................................ 7 PROCARIOTI ED EUCARIOTI............................................................................................ 8 GENOMI.......................................................................................................................... 9 ORGANIZZAZIONE E FUNZIONE DELLA CROMATINA NEGLI EUCARIOTI......................... 12 EPIGENOMA.................................................................................................................. 15 REPLICAZIONE DEL DNA............................................................................................... 22 DANNO E MUTAZIONE DEL DNA.................................................................................... 36 INTRODUZIONE ALLA TRASCRIZIONE............................................................................ 44 TRASCRIZIONE EUCARIOTI............................................................................................ 48 TRADUZIONE................................................................................................................ 58 RIBOSOMI..................................................................................................................... 61 FOLDING PROTEICO...................................................................................................... 67 REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA................................................................. 69 METILAZIONE DEL DNA................................................................................................. 73 RNA INTERFERENCE..................................................................................................... 75 LE MEMBRANE HANNO RUOLO CRUCIALE.................................................................... 77 LE MEMBRANE CELLULARI SONO SELETTIVAMENTE PERMEABILI.................................. 85 BIOGENESI DEGLI ORGANELLI CELLULARI.................................................................... 90 MITOCONDRI................................................................................................................ 91 APOPTOSI.................................................................................................................... 102 TRAFFICO PROTEICO................................................................................................... 107 BIOGENESI DEI MITOCONDRI....................................................................................... 109 BIOGENESI DEI PEROSSISOMI..................................................................................... 112 BIOGENESI DEL NUCLEO............................................................................................. 115 BIOGENESI DEGLI ORGANELLI DELLA VIA SECRETORIA................................................ 121 TRASPORTO MEDIANTE VESCICOLE............................................................................. 131 LE PROTEINE RAB SONO GTPasi MONOMERICHE......................................................... 133 I TAPPA: DAL RE AL GOLGI............................................................................................ 135 VESCICOLE TUBULARI................................................................................................. 137 COP1........................................................................................................................... 139 2 APPARATO DEL GOLGI.................................................................................................. 140 SISTEMA ENDOLISOSOSMIALE..................................................................................... 147 LISOSOMI.................................................................................................................... 148 MODELLO DI MATURAZIONE DEI LISOSOMI.................................................................. 151 ENDOCITOSI................................................................................................................ 152 FAGOCITOSI................................................................................................................. 153 MACROPINOCITOSI..................................................................................................... 153 ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORE......................................................................... 154 CORPI MULTIVESCICOLARI (MVB) MEDIANO L’INDIRIZZO ALLA VIA DEGRADATIVA....... 158 TRANSCITOSI............................................................................................................... 158 AUTOFAGIA.................................................................................................................. 159 CITOSCHELETRO......................................................................................................... 161 MICROFILAMENTI........................................................................................................ 162 MIGRAZIONE CELLULARE............................................................................................. 166 MIOSINA II................................................................................................................... 169 MICROTUBULI (25nm).................................................................................................. 173 CHINESINE E DINEINE................................................................................................. 176 FILAMENTI INTERMEDI................................................................................................. 178 CICLO CELLULARE (introduzione)................................................................................. 180 Esistono diversi metodi per studiare il ciclo cellulare.................................................. 183 PUNTI DI CONTROLLO.................................................................................................. 184 RECETTORI DI MEMBRANA........................................................................................... 186 SIGNALATORI DEL CICLO CELLULARE.......................................................................... 191 RIASSUMENDO............................................................................................................ 197 PROBLEMI CHE BLOCCANO IL CICLO........................................................................... 197 APOPTOSI.................................................................................................................... 202 VIA ESTRINSECA.......................................................................................................... 203 VIA INTRINSECA O MITOCONDRIALE............................................................................ 204 MITOSI......................................................................................................................... 210 MEIOSI......................................................................................................................... 220 INTERAZIONI CELLULARI.............................................................................................. 224 GIUNZIONI STRETTE..................................................................................................... 228 3 GIUNZIONI ADERENTI.................................................................................................. 229 LE CADERINE COSTITUISCONO UNA GRANDE SUPERFAMIGLIA DI PROTEINE.............. 231 DUE TIPI PRINCIPALI DI CADERINE DESMOSOMALI...................................................... 235 EMIDESMOSOMI.......................................................................................................... 237 INTEGRINE................................................................................................................... 238 PROETINE CAM............................................................................................................ 243 GAP JUNCIOTNS (GIUNZIONI COMUNICANTI).............................................................. 244 LA MATRICE EXTRACELLULARE.................................................................................... 245 GAG (glucosamminoglicani)......................................................................................... 245 COLLAGENI.................................................................................................................. 247 La matrice è formata da una serie di glicoproteine: fibronectina.................................. 252 LAMININA.................................................................................................................... 253 LO SVILUPPO DEGLI ORGANISMI PLURICELLULARI...................................................... 254 VIA DI SEGNALAZIONE DI TGFβ.................................................................................... 256 VIA DI NOTCH............................................................................................................... 257 SEGNALAZIONE DI WNT............................................................................................... 258 VIA DI SEGNALAZIONE HEDGEHOG (HH)...................................................................... 259 VIA DI HIPPO................................................................................................................ 260 MORFOGENI................................................................................................................ 261 IL PRIMO EVENTO DIFFERENZIATIVO............................................................................ 262 CELLULE STAMINALI..................................................................................................... 264 Rilevanza delle cellule staminali.................................................................................. 266 CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE (iPSCs).................................................. 267 POTENZIALE APPLICATIVO DELLE IPSC........................................................................ 269 Applicazioni delle iPS umane: organoidi....................................................................... 269 FUTURO DELLE STAMINALI........................................................................................... 271 RIPROGRAMMAZIONE DIRETTA.................................................................................... 272 4 5 DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA: IL DNA Il dogma centrale della biologia ci dice come l’informazione contenuta dal DNA viene utilizzata dalle cellule per produrre il prodotto proteico. Alcune definizioni: Purine: adenina e guanina Pirimidine: uracile, timina e citosina Isoforme tautomere: forme transienti, ovvero che si trovano in equilibrio tra loro. Il DNA è una molecola anfipatica, con la base azotata idrofobica e lo zucchero fosfato idrofilico ed esposto nell’acqua. Tra le basi azotate ci sono legami a idrogeno e interazioni di wan der waals. I due filamenti sono in direzioni antiparallele La forma più comune è la B con 10.5 bp per giro. Si formano 2 solchi, uno maggiore e uno minore. La maggior parte delle proteine reagisce con il solco maggiore. La forma A e la Z sono molto poco comuni. Inizialmente non si pensava che si potesse isolare la A in vitro perché si trova in condizione di disidratazione o quando si forma l’eteroduplex. Eteroduplex: filamenti formati da un filamento di DNA e RNA o due DNA diversi La forma Z è stata vista in vivo e si forma quando c’è depressione trascrizionale (un gene che non deve essere letto) Il DNA può essere denaturato e rinaturato (i filamenti possono essere separati e ricombinati). La denaturazione può essere indotta in provetta attraverso la temperatura, con variazioni di pH o con molecole specifiche. Il DNA ha la tendenza a formare i legami a idrogeno da solo e quindi a rinaturarsi, anche con molecole di DNA diverse. Per poter leggere il DNA è importante che ci sia la possibilità di staccare e riformare filamenti e struttura. Gli enzimi sfruttano l’esposizione delle basi nel solco maggiore. L’interazione dipende dalla sequenza del DNA e dalla composizione della proteina e quindi non è casuale. 6 STRUTTURE RICORRENTI Le proteine che interagiscono con il DNA hanno caratteristiche specifiche sia in sequenza che in struttura (es elica giro elica) Motivo elica giro elica: due Alfa elica e legate da un'estesa catena di aminoacidi che costituisce un giro. L'elica in rosso al C-terminale è quella che si posiziona nel solco maggiore del DNA per il riconoscimento. L'elica all'N- terminale aiuta il corretto posizionamento. Omeodominio: (gene omeodico=serve a regolare il posizionamento delle strutture all’interno del)variazione del motivo elica giro elica in cui ci sono 3 eliche di cui 2 strutturali e una di riconoscimento del DNA: la 3 prende contatto col solco maggiore tramite asparagina, la 1 col solco minore. Serve a determinare l’asse embrionale Cerniera di leucina: due lunghe Alfa eliche anfipatiche avvolte l'una sull'altra e unite dall'interazione idrofobica fra leucine Dominio a dita di zinco: il più comune contiene un'α-elica e un β-sheet tenuti insieme dall'atomo di zinco. Di solito i fattori di trascrizione contengono più motivi di zinco che formano un'interazione molto forte col DNA. ESEMPIO Il fattore generale di trascrizione e il TFIID che usa il β-sheet per curvare il DNA 7 PROCARIOTI ED EUCARIOTI Cellule procariotiche: vivono da sole e sono più piccole. Non ha nucleo e organelli. Non hanno citoscheletro. Ha un'unica molecola di DNA circolare Cellule eucariotiche: formano organismi pluricellulari e sono più grandi. Ha il nucleo che consente di separare il DNA genomico dal resto della cellula e organelli che danno funzioni specifiche. Hanno il citoscheletro. Hanno più molecole di DNA lineari Nonostante le differenze, il flusso di informazione e il codice genetico sono praticamente gli stessi. Le ramificazioni sono delle mutazioni. Se hanno terminazioni vuol dire che erano dannose, se continuano vuol dire che non avevano avuto effetto oppure hanno dato un miglioramento. 8 GENOMI I genomi dei virus hanno piccole dimensioni. In ordine di dimensioni ci sono i batteri, funghi piante, alghe anfibi e mammiferi. Il contenuto di DNA viene chiamato fattore C. gli anfibi hanno un fattore C maggiore degli uomini ma non sono più complessi. Questo dipende dal fatto che hanno assorbito DNA dall’ambiente molto più di noi. La quantità di DNA non corrisponde all’evoluzione. Il genoma procariotico è un'unica molecola di DNA circolare ( E coli K12 ha 4,6.10^6 coppie di basi, solo l’11% è intergenico, cioè si trova tra un gene e l’altro e serve alla regolazione genica) Gli operoni sono trascritti che hanno informazioni per più proteine e funzionano solo nei procarioti. Il nucleoide batterico ha al centro le proteine HU alle quali è legato il DNA superavvolto. GENOMI UMANI Noi abbiamo due genomi: nucleare e mitocondriale. Quello nucleare è formato da molte molecole di DNA lineari con 23 coppie di cromosomi e circa 23.000 geni. 46 cromosomi lineari, di cui 22 autosomici presenti in duplice coppia (genoma diploide) e 2 cromosomi sessuali (aploide). Il cariotipo è raccolto in metafase. Il cromosoma consente di contenere il DNA del nucleo. Evita che il DNA sia libero nella cellula e quindi instabile. Le nucleasi si possono attaccare al DNA e idrolizzano i legami. Durante la replicazione del DNA i singoli cromosomi omologhi si duplicano formando i cromatidi fratelli. Il genoma mitocondriale è formato da circa 17.000 bp e 37 geni, di cui 13 che codificano proteine, 22 tRNA e 2RNA, ed è circolare. 9 COME E’ FATTO IL GENOMA NUCLEARE UMANO Il genoma umano completo può essere diviso in geni (sequenze di DNA legate alla produzione di proteine o RNA) e sequenze correlate ai geni, di cui solo l’1% è composto da esoni, ovvero sequenze codificanti che andranno nell’mRNA maturo, mentre il 39% è formato da introni, pseudogeni (geni che inizialmente erano codificanti, ma con l’evoluzione hanno perso la capacita di diventare proteine), sequenze di regolazione dei geni ed RNA funzionale (transfer, ribosomiale, small nuclear RNA ecc.). Il 60% delle sequenze del genoma è formato da sequenze intergeniche, di cui il 20% sono sequenze a basso numero di copie e il 40% sequenze ripetitive. Sono 30% di elementi interspersi (trasposoni, ovvero elementi di DNA che si possono muovere nel genoma) e 10% ripetizione in tandem (DNA satellite, ripetizione di nucleotidi usati come impronta digitale del DNA di un individuo). La densità genica diminuisce con l’aumentare della complessità biologica. A parità di lunghezza nell’E coli ci sono 57 geni, mentre nell’uomo 2. La distribuzione dei geni non è uniforme. Ci sono delle regioni ad alta densità e delle zone dette deserti genici. Una sequenza di regolazione è necessaria alla trascrizione ma non verrà trascritta. mRNA è costituito solo da esoni I DNA delle persone delle persone differiscono solo dello 0,1%. 10 POLIMORFISMI Polimorfismo genetico: variante genetica presente in almeno l’1% della popolazione. Esistono diversi tipi di polimorfismi: Single-nucleotide polymorphisms (variabilità della sequenza): un individuo ha una variazione di un singolo nucleotide rispetto ad un altro individuo. Copy number polymorphisms (variabilità del numero di copie): variabilità tra numeri di ripetizioni di satelliti. Structural variants SVs (varianti strutturali): hanno differenze più grossolane. Si distinguono in delezione, inserzione e inversione. Copy number variations (CNVs): duplicazione in tandem o dispersa. Possono causare propensione a malattie ma non ne sono causativi MUTAZIONI Varianti riscontrate in rene > sistema endocrino > fegato MERRF (Myoclonic, epilepsy, ragged red fibers) È una encefalomiopatia mitocondriale di derivazione materna. Comporta epilessia mioclonica a causa di una mutazione del tRNA per lisina 98 FUNZIONI DEI MITOCONDRI 1. Serbatoio di calcio 2. Produzione di energia, sintesi di ATP 3. Metabolismo: a. β-ossidazione degli acidi grassi, b. ciclo dell’urea, c. biosintesi dell’eme, d. sintesi degli ormoni steroidei 4. Apoptosi La glicolisi avviene nel citosol; il piruvato, che ha dimensioni ridotte, attraversa le porine e viene decarbossilato L’ATP sintasi è fatta da 14 domini transmembrana. la parte Fo è la porzione associata alla membrana del mitocondrio e funge da rotore, F1 è lo statore. Si passa dall’energia chimica del gradiente protonico all’energia meccanica del rotore e di nuovo quella chimica. Ogni rotazione si producono 3 ATP. Quando manca il gradiente protonico, l’ATP sintasi idrolizza ATP per pompare H+ fuori dalla matrice. Il gradiente di pH determina un gradiente elettrico. Il trasportatore del piruvato dipende dal pH Quando un mitocondrio è metabolicamente molto attivo, gli elettroni posso uscire dalla catena generando ROS La superossido dismutasi (SOD) riesce a trasformare lo ione superossido in acqua ossigenata. L’acqua ossigenata può reagire con un'altra molecola di acqua ossigenata formando acqua e ossigeno oppure con due glutationi ridotti per formare due molecole di acqua grazie alla glutatione perossidasi I topi KO per mtSOD muoiono prematuramente, mentre quelli per la SOD citosolica durano di più. I topi transgenici esprimenti SOD mutata sviluppano tumori 99 OMEOSTASI DEL CALCIO NEI MITOCONDRI I mitocondri aiutano a mantenere bassi i livelli di Ca2+ nel citosol. Ci sono almeno tre enzimi del ciclo di Krebs la cui attività è stimolata dagli ioni calcio (concentrazoni sub-micromolari): Pyruvato deidrogenasi NAD-isocitrato deidrogenasi Ossoglutarato deidrogenasi Grazie ad una sonda fluorescente calcio dipendente (aequorina), indirizzata ai mitocondri, è stato possibile osservare il calcio all’interno dei mitocondri. L’intensità della fluorescenza dipende dalla quantità di calcio, sensibile anche in quantità submillimolare (nella cellula la quatità di calcio è molto bassa, ma nel reticolo endoplasmatico raggiunge i millimolare). CANALI E TRASPORTATORI COINVOLTINEI FLUSSI DI CALCIO NEI MITOCONDRI Ci sono stati studi elettrofisiologici che hanno individuato i trasportatori del calcio nei mitocondri. Nei mitocondri c’è un picco di corrente dovuta al calcio. I primi trasportatori mitocondriali individuati nei mitocondri riguardo il calcio sono stati degli antiporti Na+/Ca2+ oppure H+/Ca2+. Questi sono importanti e contribuiscono all’ingresso del calcio del mitocondrio, ma non giustificano il picco di corrente osservato sperimentalmente, anche perché sono tessuto-specifici (l’ antiporto Na+/Ca2+ è prevalente nel tessuto cardiaco mentre l’antiporto H+/Ca2+ nel rene e nel fegato). Si era quindi capito che dovesse esserci per forza un altro tipo di trasportatore dl calcio all’interno del mitocondrio. I mitocondri sono in grado di assorbire gli ioni di calcio attraverso l'uniporto di calcio mitocondriale (MCU), scoperto dal professor Rosario Rizzuto, un complesso di proteine che si trova nella membrana mitocondriale interna. Già negli anni ‘60 del 900 si ipotizzava la presenza di un uniporto del calcio sui mitocondri ma non si riusciva a identificarlo. Loro sono partiti con lo studiare l’uniporto del calcio negli organismi unicellulari e mettendo a confronto i geni responsabili con quelli dell’uomo sono riusciti a trovarlo. 100 Quando i livelli di calcio cellulare sono alti, gli ioni di calcio fluiscono nel mitocondri attraverso l'MCU (stimolabile anche, ad esempio, con istamina), portando ad un aumento della concentrazione di calcio mitocondriale. Questo aumento della concentrazione di calcio può stimolare la produzione di ATP e altre vie di segnalazione cellulare e svolge anche un ruolo nella regolazione del metabolismo mitocondriale. D'altra parte, il sovraccarico di calcio mitocondriale può portare al rilascio di fattori pro-apoptotici e contribuire alla morte. Ciò può verificarsi in condizioni di stress ossidativo, disfunzione mitocondriale e altri stati patologici, che possono portare all'apertura del poro di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTP) e al rilascio di calcio e altri fattori apoptotici. Questo esperimenti ci ha fatto anche capire che la captazione del calcio avviene dopo uno stimolo. Il reticolo endoplasmatico ha una serie di canali del calcio che rispondono a diversi stimoli chimici. L’istamina fa aprire i canali e fa passare il Ca2+ dal reticolo al citosol, e poi l’uniporto mitocondriale lo fa passare all’interno del mitocondrio. INTERAZIONI TRA RE E MITOCONDRI SONO IMPLICATI NELLA CAPTAZIONE DI CALCIO MITOCONDRIALE Il reticolo endoplasmatico fa da serbatoio di calcio, che fa fluire nel citosol il calcio. Per rientrare nel reticolo, il calcio passa attraverso una pompa calcio/ATPasi, mentre nel mitocondrio il trasporto è passivo. Dopo pochi secondi che c’è stato lo stimolo, il calcio entra nei mitocondri. Questa efficienza è dovuta dal fatto che mitocondri e reticolo sono in comunicazione. contatti chiusi tra re e mitocondri promuovono la captazione di calcio mitocondriale (trasporto passivo) Nei siti di contatto tra mitocondri e reticolo endoplasmatico liscio (membrane conctact site tra reticolo e mictocondrio)(70/80nm), le mitofusine hanno importante ruolo strutturale. Quando il calcio si innalza nel citosol, la cellula può anche sfruttare delle proteine che fanno da chelanti del calcio, che sequestrano il calcio dal citosol. 101 APOPTOSI L’apoptosi è la morte programmata della cellula, da non confondere con la necrosi, che è una morte accidentale. La cellula che va incontro ad apoptosi va incontro ad un grosso cambiamento morfologio, raggrinzendosi fino a diventare un dendrito cellulare (o corpo apoptotico). Inoltre c’è una condensazione del citoscheletro. Gli effettori molecolari che mediano l’apoptosi sono le caspasi (chiamate così perché hanno un residuo di cisteina che taglia sull’aspartato), che sono delle proteasi. Il processo di apoptosi è altamente regolato. Abbiamo due vie, una estrinseca e una intrinseca. La via estrinseca è determinata da segnali extracellulari che sono mediati da fattori come TNF, TRAIL, FAS (TNF: Tumor Necrosis Factor, mediatore dei processi infiammatori). Questi mediatori si legano a specifici recettori che hanno una particolarità, ovvero nel dominio citosolico (definito dominio di morte) attivano le caspasi. Le attivano perché in realtà le caspasi sono prodotte sottoforma di proenzimi. Si ha tanta apoptosi durante l’embriogenesi, perché serve per rimodellare l’organismo. Nell’embriogenesi è cruciale per la separazione delle dita della mano. La via intrinseca dipende da mancanza di O2, di nutrienti, di fattori di sopravvivenza, stress cellulare o danno del DNA. Trattando le cellule con raggi UV, induciamo l’apoptosi, perché il DNA si danneggia. Allora il mitocondrio emette il citocoromo c che stimola l’apoptosi. Inoltre il mitocondrio stesso si ingrandisce e si distrugge. Durante l’apoptosi la fosfatidilserina va dal lato esterno della membrana. Se mettiamo un colorante sulla fosfatidil serina possiamo osservare questo fenomeno. 102 I GENI DELLA FAMIGLIA BCL-2 SVOLGONO UN RUOLO CRITICO NEL PROCESSO DI APOPTOSI. Proteine anti-apoptotiche: Proteine pro-apoptotiche: Bcl-2, Bcl-xL e Bcl-w, Mcl-1 Bax, Bak, Bad, Bok, Bid, Bim Si è visto che ci sono proteine proapoptotiche e antiapoptotiche altamente conservate, che hanno domini chiamati BH. Questi sono domini di interazione proteina-proteina. Le proteine proapoptotiche sono essenziali. Le cellule di topo doppio KO per bax e bak non vanno in apoptosi. Gli stessi topi in KO solo per uno o per l’altro le cellule vanno in apoptosi. Questo dimostra che queste proteine proapoptotiche sono ridondanti ma indispensabili. Bak sta sulla membrana del mitocondrio, bax sta nel citosol. Quando arriva il segnale apoptotico le proteine oligomerizzano, sfruttando i domini di interazione tra proteine. Si forma il MAC (Mitocondrial apoptosis-Induced channel) che serve a far uscire il citocromo c. Ci sono due tipi di proteine coinvolte nel processo apoptotico: derepressori e attivatori diretti. I secondi agiscono direttamente su BAX favorendone il contatto con la membrana. I derepressori agiscono sulle bcl2 (che sono proteine che inibiscono l’apoptosi). 103 MECCANISMO MOLECOLARE DELLA VIA INTRINSECA Sulla membrana esterna del mitocondrio c’è Bax, che interagisce con Bcl-2 (B cell limphoma), la quale inibisce l’apoptosi. Quando arriva lo stimolo, Bad si defosforila, perdendo la zavorra della proteina 14-3-3, quindi si lega alle Bcl-2 inibendolo e quindi le Bax si aggregano e formano il canale. Esce il citocromo che attiva le caspasi. Quindi le stesse proteine regolatorie sono regolate trascrizionalmente o con modifiche post-traduzionali. Il citocromo c lega apaf1, che espone il dominio CARD, che consente ad altre 6 CARD di legarsi (in totale son 7 apaf),in modo da formare un apoptosoma. Se l’apoptosoma legano 7 procaspasi-9, esse si attivano a caspasi 9. Le caspasi 9 attivano le caspasi-3, che a loro volta attivano altre caspasi che vanno a frammentare le varie componenti cellulari. Il DNA è frammentato da specifiche nucleasi citosoliche, che sono tenute ferme da proteine che vengono distrutte dalle caspasi. Durante l’apoptosi il mitocondrio si riempie di Ca2+. Se il calcio supera i 100µM si apre il canale PTP (poro per la transizione di permeabilità). L’apertura del poro fa entrare l’acqua nel mitocondrio. Dal mitocondrio escono molte molecole che sostengono l’apoptosi come: citocromo c Smac (proteina attivatrice di apoptosi, anti IAP) Aif (proteina attivatrice di apoptosi, anti IAP) Ros (radicali liberi dell’ossigeno) Nucleotidi Alcune pro-caspasi L’apertura del PTP fa anche crollare il potenziale di membrana impedendo la sintesi di ATP 104 ATTENZIONE: l’apertura del canale PTP avviene temporalmente dopo l’apertura del canale MAC, quindi non è il PTP a far uscire il citocromo dal mitocondrio per l’apoptosi, ma dato che è un buco molto grande, consente lo stesso la fuoriuscita del citocromo Le IAP (inibitor apoptosis protein) legano le caspasi attive, inoltre ubiquitinano le caspasi inducendole alla degradazione. Se le IAP escono durante l’apoptosi, le anti-IAP escono dai pori , legando le IAP e inibendole. Le procaspasi subiscono taglio proteolitico (dall’apoptosoma) per attivarle a caspasi. Ma le caspasi sono legate con IAP finchè queste ultime non vengono inibite dalle anti-IAP. Le CAD sono nucleasi, ICAD è l’inibitore che non lo fa andare nel nucleo. 105 BIOGENESI DEGLI ORGANELLI CELLULARI Gli organelli sono gli stessi in tutte le cellule, differiscono in base alla loro abbondanza relativa nelle cellule. In particolare il citosol occupa il 54% del volume cellulare, mentre il nucleo circa il 6%. Questo è un rapporto molto simile tra tutte le cellule, mentre la percentuale degli altri organelli può essere anche molto diversa. Il rapporto citosol/nucleo è un parametro molto importante e può essere un indicatore della necessità della cellula di dividersi (alterato nelle cellule tumorali). Il resto di tale volume è occupato dagli altri organelli, di cui i mitocondri possono essere una gran parte (circa 22%). Generalmente l'abbondanza degli organelli varia da tessuto a tessuto, anche in gran misura. Tale abbondanza di organelli può variare anche nella stessa cellula in situazioni diverse a seconda di necessità e stimoli. Nel fegato la maggiore abbondanza di organelli è rappresentata dai mitocondri (vedi tabella), perché gli epatociti hanno il compiti di detossificare e quindi hanno bisogno di molto ATP. Nel pancreas il reticolo endoplasmatico rugoso è molto presente, perché il pancreas è una ghiandola esocrina che deve sintetizzare molte proteine. Ogni organello è composto da 2 principali componenti: 1. Membrana: è il classico bilayer più le proteine solitamente uno tralasciando i mitocondri. 2. Lume: costituito da proteine e altre molecole. Dopo l'effettiva biogenesi dell'organello, le molecole che lo compongono devono essere trasportate dal sito di sintesi a quello di destinazione, generando un vero e proprio traffico di proteine e lipidi (per i lipidi e vescicolare e indipendente, mediato da lipid transfer protein) 106 TRAFFICO PROTEICO La sintesi delle proteine comincia nel citosol, più precisamente nei ribosomi liberi, però alcune proteine devono migrare in luoghi, anche extracellulari, per maturare. Le proteine raggiungono il sito di destinazione finale tramite il riconoscimento di segnali di smistamento. A volte, a causa di problemi esterni, i segnali di smistamento possono non essere letti correttamente o possono esserci problemi meccanici durante lo smistamento. I segnali di smistamento posso essere: 1. Specifiche sequenze aminoacidiche: ovvero un'unica sequenza amminoacidica imputata al segnale 2. Modificazioni post-traduzionali 3. Struttura secondaria 4. Zone segnale (patches, cluster): ovvero più sequenze peptidiche imputate alla zona segnale Se tale segnale è mutato, il macchinario della cellula non può riconoscerlo. Potrebbe anche esserci una mutazione nel recettore che riconosce il segnale, facendo sviluppare patologie “dovute a disfunzione del traffico delle proteine". Il diabete insipido ne è un esempio, infatti le acqua porine sono funzionanti ma non riescono a raggiungere il domino apicale della membrana e va nei lisosomi, dove è inutile poiché non può assorbire acqua Sono state adottate diverse strategie per individuare le zone segnale: 1. Rimozione della sequenza 2. Mutazione della sequenza 3. Trasferimento della sequenza su un’altra proteina Questi segnali vengono riconosciuti da specifici recettori cellulari. I recettore fanno in modo che avvenga il trasporto della proteina dal sito di sintesi alla destinazione. I recettori sono di solito proteine che hanno anche attività enzimatica. Esistono delle sequenze amminoacidiche segnale. In queste solo alcuni amminoacidi e la loro distanza relativa sono cruciali per il riconoscimento del segnale. KDEL: Lys-Asp-Glu-Leu-COO- è la sequenza segnale per la vie di recupero delle proteine per il RER. 107 MECANISMI DI TRASPORTO Dopo che il segnale è stato riconosciuto, esistono 3 meccanismi di trasporto delle proteine negli organelli: 1. Diffusione (trasporto regolato) che è un tipo di diffusione che avviene attraverso i pori. 2. Traslocazione (trasporto attraverso membrana), che può essere: a. post-traduzionale, cioè a seguito della sintesi, come nel caso delle proteine che devono raggiungere mitocondri e perossisomi b. co-traduzionale, cioè durante la traslocazione, come nel caso delle proteine che vanno nel reticolo. 3. Trasporto vescicolare, mediante le vescicole. È quello che si attua tra il RE e l’apparato del golgi, che appartengono alla via secretoria. Le vescicole si formano per gemmazione dal compartimento donatore e per fusione si vanno ad unire al compartimento target. Il citosol è un compartimento plastico e dinamico con diverse strutture, funzioni e organelli. È formato al 20% da proteine, fa da deposito di lipidi, piccole molecole e metaboliti. Sono presenti citoscheletro e ribosomi, ed è la sede della glicolisi e delle reazioni biosintetiche come la traduzione delle proteine. 108 BIOGENESI DEI MITOCONDRI I mitocondri importano dal citosol quasi tutte le proteine attraverso un processo di traslocazione post-traduzionale. Esiste una specifica sequenza segnale di indirizzo ai mitocondri che ha una struttura α-elica anfipatica con cariche positive da un lato, caratterizzata da una pre sequenza (a seconda delle proteine può variare dai 20-70aa) e che si trova sul n-ter della proteina e vene rimossa durante la traslocazione. L'α-elica anfipatica è un segnale generale di importazione nel mitocondrio poiché il recettore ha proprio un dominio che la riconosce una volta entrata nel mitocondrio la proteina spesso rice altri segnali, che sono segnali idrofobici secondari che sono necessari per indirizzare la proteina al punto preciso del mitocondrio. Intervengono inoltre delle chaperon della famiglia delle HSP70 , che in questo caso aiutano l'entrata della proteina nel mitocondrio Esistono diversi tipi di proteine mitocondriali: 1. Quelle sulla membrana esterna 2. Quelle che rimangono nello spazio intermembrana 3. Quelle sulla membrana interna 4. Quelle nella matrice mitocondriale COMPLESSI TRASLOCATORI complesso proteico TOM (Traslocator Outer Membrane) con due recettori SAM (Sorting And Assemblig): distribuisce le proteine e le assiste nel ripiegamento TIM22 (traslocator inner membrane): media l’inserzione di una sottoclasse di proteine della membrana interna (proteine trasportatrici di ATD, ADP e fosfato) TIM23: trasporta proteine solubili nella matrice mitocondriale e aiuta ad inserire proteine transmembrana nella membrana interna OXA: media l’inserzione di proteine di membrana interna che sono sintetizzate nei mitocondri e l’inserzione di proteine di membrana interna (sintetizzate dai mitocondri), una volta importate, che sono prima trasportate nella matrice da altri complessi. 109 TRASPORTO CITOSOL-MATRICE Membrana esterna TOM Tom è un mega complesso proteico costituito dal più subunità assemblate insieme, una di questa è proprio quella in grado di riconoscere la sequenza segnale, mentre la restante parte funge da foro per la proteina.Tom è l'unico modo per far entrare la proteina nel mitocondrio Membrana interna TIM 23 Una volta attraversata la membrana esterna, la proteina arriva a TIM 23, un'altro complesso con più subunità che fungono da poro e permettono il passaggio da spazio intermembrana a matrice. TOM e TIM 23 non sono collegati ma molto vicini. La traslocazione avviene con la proteina non ripiegata, che viene legata dalle hsp 70 citosoliche: la legano all'esterno di Tom, entra non ripiegata e man mano che entra le hsp 70 si staccano mediante l'idrolisi dell'ATP. Passato TOM, la proteina deve arrivare a TIM 23, e ciò è aiutato dalle cariche positive: lo spazio intermembrana e ricco di protoni e le cariche positive presenti sulla proteina permettono la proteina di proseguire verso TIM 23. Una volta arrivata nella matrice la proteina si piega grazie ad una hsp 70 mitocondriale, che la tira all'interno usando ATP. A questo punto il segnale è tagliato da una peptidasi e la proteina, grazia chaperon come hsp 60, si ripiega. Tale processo è unidirezionale a causa del dispendio energetico. 110 TRASPORTO CITOSOL-MEMBRANA INTERNA Questo tipo di trasporto avviene attraverso due vie: 1. Trasporto diretto: la proteina passa in TOM e mentre sta passando in TIM 23 viene letto un secondo segnale di natura idrofobica che blocca il passaggio poiché si stabiliscono interazioni tra lo stesso segnale e aminoacidi idrofobici del poro. Tale blocco porta la proteina ad assumere una conformazione più aperta uscendo totalmente da TOM stabilizzandosi nella membrana interna. 2. Trasporto indiretto: la proteina passa in Tom e in TIM 23 ma in questo caso il segnale idrofobico e mascherato quindi la proteina entra immediatamente nella matrice. A questo punto una peptidasi taglia il primo segnale esponendo quello idrofobico. Interviene adesso OXA che riconosce tale segnale inserisce dalle proteine nella membrana mitocondriale interna. OXA è usato anche dalle proteine sintetizzate dai mitocondri che compongono ATP sintasi e catena respiratoria 3. trasportatori di metaboliti (caso particolare): i trasportatori di metaboliti hanno una caratteristica comune: la loro sequenza segnale è più all'interno e poi quando entrano nel mitocondrio sono legate da una serie di chaperon che le inseriscono nella membrana mitocondriale interna dove vi è TIM 22 che li aiuta a ripiegarsi, facendo formare più domini transmembrana. TRASPORTO CITOSOL-SPAZIO INTERMEMBRANA Allo stesso procedimento di una proteina della membrana interna, con aggiunta di uno step finale in cui la proteina viene tagliata e rilasciata nello spazio intermembrana. TRASPORTO DELLE PORINE NELLA MME Queste proteine bastano in Tom e arrivano nello spazio intermembrana, sono riconosciuti da chaperon che le portano a SAM, questa funziona come TIM 22: inserisce le proteine nella membrana mitocondriale esterna facendole però assumere un particolare ripiegamento a barile β. 111 BIOGENESI DEI PEROSSISOMI I perossisomi sono organelli plastici perciò si modificano in base alle esigenze metaboliche dell'organismo. Hanno tre funzioni principali: 1. detossificazione mediante ossidazione 2. beta ossidazione 3. sintesi di plasmalogeni Hanno funzioni ossidative svolte da enzimi che lavorano a pH basico, molto concentrati nella loro matrice. Usano ossigeno e deidrogenano i composti, producendo perossido di idrogeno, tossico per la cellula. Gli enzimi più presenti sono ossidasi e catalasi che funzionano in modo un po diverso: (ossidasi) RH2+O2→R+H2O2 L'ossidasi produce perossido idrogeno dall'ossidazione di un substrato facendo intervenire poi una catalasi che agisce in due modi diversi usando il perossido di idrogeno per ossidare altri substrati (catalasi) R’H+H2O2→R+2H2O (catalasi) 2H2O2→2H2O+O2 I perossisomi sono fondamentali nelle cellule epatiche, necessari per detossificare molecole tossiche nel sangue, andando ad ossidarle (etanolo ad acetaldeide). Tra le reazioni ossidative troviamo la beta ossidazione di acidi grassi a catena lunga. Oltre alle reazioni degradative svolgono reazioni di sintesi: sono infatti la sede di sintesi dei plasmalogeni che sono la componente lipidica più abbondante della membrana, cioè la guaina che avvolge gli assoni. Per questo motivo perossisomi sono molto abbondanti nel sistema nervoso. COMPLESSI TRASLOCATORI I perossisomi importano dal cito solo tutte le proteine attraverso un processo di traslocazione post- traduzionale. Esiste una specifica sequenza segnale di indirizzo perossisomi che cambia tra proteine luminali e proteine di membrana. Proteine luminali (2 tipi): 1. Tipo 1 (Il primo ad essere stato scoperto), al C-ter, il più presente: SKL (Ser-Lys-Leu-COOH) 2. Tipo 2, all’N-ter, sono due: a. NH2-Ala-His b. NH2-Cys-Arg Proteine di membrana: non si conosce ancora il segnale ma si conosce il macchinario che permette l'inserimento di tali proteine nella membrana. 112 TRASPORTO CITOSOL-PEROSSISOMA Le perossine (PEX) sono proteine che permettono il trasporto delle proteine perossisomiali all'interno di questi ultimi. Quelle coinvolte nel processo di trasporto delle proteine nei perossisomi sono 23. 6 di queste compongono il complesso traslocatore Le altre 17 hanno funzione recettoriale. Pex5 e Pex7 sono citosoliche e fungono da recettori: Pex5 riconosce il segnale di tipo 1 (PTS1) Pex7 riconosce il segnale di tipo 2 (PTS2). Riconosciute le proteine da importare, le portano sul bilayer dei perossisomi dove c'è il complesso trasportatore, formato da più Pex che formano il poro. In particolare conosciamo il ciclo di Pex5: Nel poro grazie al segnale SKL passa il complesso Pex più proteina, si stacca e PTS1 va nel lume, mentre Pex5 la troviamo momentaneamente sulla membrana del perossisoma e da qui può andare incontro a due destini. Può essere: Monoubiquitinato→torna nel citosol Poliubiquitinato→Viene indirizzata al proteosoma e degradata. La biogenesi degli organelli, quindi anche dei perossisomi, dipende molto dalle necessità dell'organismo; ad esempio beviamo molto alcol deve essere smaltito attiviamo biogenesi dei perossisomi che detossificano. Nei perossisomi, a differenza dei mitocondri, le proteine entrano ripiegate, mantenendo la loro struttura. La catalasi ad esempio entra nella sua forma funzionale tetramerica TRASPORTO CITOSOL-MEMBRANA Non conosciamo il segnale che permette questo trasporto, ma sappiamo che sono necessarie pex 19 e pex 3. In particolare Pex 19 funge da recettore citosolico, lega la proteina nel citosol e la trasporta alla membrana. 113 MECCANISMI DI BIOGENESI DEI PEROSSISOMI Che ruolo hanno pex 3, 15 e 19 in questo processo? La biogenesi nei perossisomi dipende da 2 meccanismi diversi: gemmazione dal RE (ex novo): ci sono regioni del RE da cui gemmano vescicole. Tali vescicole possono poi unirsi tra loro e formare i perossisomi, oppure fondersi con perossisomi già esistenti. In particolare nelle regioni del RE da cui originano le vescicole ci sono Pex3,15 e 19, che vanno a regolare l’attività dei perossisomi. Fissione: un perossisoma più grande si scinde in 2 più piccoli. Questo è un fattore importante anche per il turnover fisiologico degli organelli poiché non devono crescere troppo (più sono grandi e più sono difficili da degradare). SINDROME DI ZELLWEGER È un malattia autosomica recessiva con esordio neonatale. È una sindrome cerebro-epato-renale (più sensibili al malfunzionamento dei perossisomi) con dismorfismi cranio facciali. Porta alla morte poco dopo la nascita. È dovuta a mutazioni nei geni che codificano per Pex5 e Pex7, con una conseguente alterazione della biogenesi dei perossisomi. Si riscontrano problemi neurologici a causa di una mancata produzione di plasmalogeni, che costituiscono la mielina. La mutazione è più grave in Pex5 poiché non riconosce PTS1, che è il segnale più frequente. Questa patologia porta alla formazione di perossisomi vuoti. ADRENOLEUCODISTROFIA (X-ALD E X-CALD) È una malattia X-linked che può comparire con molta eterogeneità, dall’infanzia all’età adulta. Comporta una demielinizzazione e una disfunzione assonale che comportano paraplegia. Si ha poi una degenerazione dei neuroni con conseguente declino cognitivo. Si ha inoltre un’insufficienza surrenalica. È dovuta a mutazioni in ABCD1 (trasportatore di membrana)con un conseguente accumulo di acidi grassi a catena lunga in cellule e tessuti. La mancata degradazione degli acidi grassi a catena lunga comporta non solo un cambiamento di viscosità e composizione del citosol, ma anche una mancata produzione di energia. 114 BIOGENESI DEL NUCLEO Nel nucleo ci sono DNA, proteine, RNA, lipidi ecc. Citosol e nucleo hanno una stretta correlazione, ma ognuno ha una propria identità molecolare ed il trasporto tra i due è finemente regolato e controllato. La prova di tale separazione è stata data da un esperimento: sono state rotte le cellule mediante shock osmotico per separare il contenuto di nucleo e citosol, tramite successiva centrifugazione: supernatante = citosol sedimenti = nucleo con l’analisi westernblot si è avuta la conferma: le proteine citosoliche erano nel supernatante, mentre quelle nucleari nei sedimenti La membrana nucleare è formata da un doppio bilayer, il cui continuamento forma il reticolo endoplasmatico. I complessi dei pori nucleari costituiscono delle interruzioni della membrana nucleare e permettono una comunicazione con il citosol. La struttura dell'involucro nucleare è sostenuta da una fitta reteproteica, la làmina nucleare, costituita infatti da proteine chiamate lamìne. LAMINE NUCLEARI Le lamìne nucleari sono dei filamenti intermedi che danno forma all’involucro, quindi appartengono alla classe delle proteine del citoscheletro. Esse formano la làmina, che da struttura al nucleo e alla quale è associata la cromatina. Forma un reticolo fibroso che sostiene il nucleo, è costituita da proteine fibrose (lamine) da 60-80 KDa, le più comuni sono lamina A e lamina C , mentre la lamina B è più tessuto specifica. Sono codificate da 3 geni diversi: LMNA, LMNB1 e LMNB2. Le lamine si associano a formare strutture di ordine superiore: partono da una struttura a coiled-coil con 2 estremità globulari, che si associa ad una identica formare un dimero. I dimeri fanno associazione testa- coda a formare un polimero, che per associazione laterale forma una struttura di ordine superiore Esiste una associazione diretta con gli istoni H2A e H2B e la làmine. La lamina nucleare si lega all'involucro nucleare tramite interazione con proteine associate al bilayer (emerina o LBR) e conferisce stabilità strutturale al nucleo. Inoltre tale lamina si lega ai cromosomi organizzandoli in precisi territori cromosomali 115 DISTROFIA MUSCOURE DI EMERY-DREYFUSS Nella distrofia di Emery-Dreyfuss associata al cromosoma X comporta la mutazione in emerina. PROGERIA DI HUTCHINSON-GILFORD (HGPS) Le laminopatie sono dovute a mutazioni delle lamine, possono essere tessuto specifiche o sistemiche. Un esempio di la minopatia è la progeria di hutchinson-gilford (HGPS): è una patologia molto rara che comporta invecchiamento prematuro a insorgenza post natale. I segni fenotipici sono: Perdita di Capelli, Pelle Invecchiata, Problemi Articolari, Perdita di Grasso Sottocutaneo Problemi Cardiovascolari. La progeria è dovuta ad una mutazione della lamina A. Ciò provoca un'alterazione della struttura della lamina nucleare, che perde la sua funzione. L'HGPS è dovuta ad una delezione di 150 nt dall’esone 11 del gene della lamina A, ciò porta ad una proteina più corta mancante di un pezzo. La proteina sintetizzata viene, come nel caso di quella non mutata, modificata post traduzionalmente mediante l'aggiunta di un'ancora lipidica (farnesile) che dovrebbe essere poi tagliata. La parte mancante è proprio quella che dovrebbe subire il taglio proteolitico, ma ciò non può più avvenire nella proteina mutata , che rimane farnesilata e si ha la malattia. Le cellule dei soggetti HGPS mostrano: Alterata organizzazione della cromatina Difetti nella proliferazione Perdita del potenziale replicativo Alterazione nella segnalazione intracellulare (anche in cellule staminali) Perdita della capacità differenziativa in specifici tipi cellulari Aumento della frequenza del danno al DNA Alterata produzione della matrice extracellulare 116 PORI NUCLEARI (NPC) I pori nucleari appaiono come buchi con petali di un fiore all’esterno, e una sorta di canestro all’interno. Hanno un diametro di circa 9nm, e questa piccola grandezza li rende molto selettivi. Sono costituiti da più di 50 proteine diverse (500 isoforme), infatti si parla di NPC (Nuclear Pore Complex). Le porine costituiscono la parte del canale acquoso e hanno caratteristiche idrofiliche. Ne distinguiamo alcune: Nucleoporine del canale Nucleoporine dell’anello Nucleoporine filamentose, sia nel lato citosolico che in quello nucleare Ci sono poi dei piccoli filamenti proteici non strutturati (non hanno né α elica né β foglietto) che riempiono il poro che sono chiamati fibrille. Tale poro permette il passaggio a tutte le molecole 9nm (proteine,... ) hanno bisogno di trasportatori. Si è scoperto che più sono piccole le molecole e più passano velocemente attraverso il poro. Infine il trasporto attraverso il poro è bidirezionale Attraverso le porine entrano: Proteine: polimerasi, istoni, fattori di trascrizione, p. ribosomali, etc. Nucleotidi, etc. Attraverso le porine escono: rRNA, tRNA, mRNA, ribosomi, etc. TRASPORTO CITOSOL-NUCLEO I ricercatori hanno fatto esperimenti per capire i segnali smistamento nucleare della nucleoplasmina (antigene T, un antigene virale con localizzazione nucleare) 1. Hanno preso prima delle nucleoplasmine intere e hanno marcato la testa, e seguendole hanno visto che si localizzavano tutte nel nucleo. 2. Poi hanno preso solo le teste e hanno visto che rimanevano solo nel citosol. 3. Alla fine hanno preso solo le code e hanno visto che si localizzavano nel nucleo. Quindi hanno dedotto che la sequenza segnale si trova nella coda. Per capire quale fosse la sequenza specifica hanno eliminato amminoacido per amminoacido la sequenza della cosa per cambiarne la localizzazione. 117  Si è visto che la lisina 128 ha un ruolo critico nella localizzazione nucleare dell’antigene T, infatti quando si cambia con triptofano l’antigene rimane nel citosol. Ciò è dovuo principalmente alla variazione di carica. Con altri esperimenti è stato possibile capire che non conta tanto la sequenza in sè ma che essa abbia una carica positiva. Le sequenze segnale di localizzazione nucleare (NLS Nuclear Localization Signal), sono: sequenze ricche in amminoacidi basici PKKKRKV si trovano all’interno della proteina sono frequentemente bipartite (ci sono due regioni di aa basici più o meno distanti tra loro). Ci sono recettori specifici, detti importine, che riconoscono i segnali di importazione nucleare, mentre le esportine riconoscono i segnali di esportazione. Possono essere di 2 tipi: Legame diretto; si legano direttamente alla proteina cargo che devono trasportare mediante riconoscimento dell'NLS Legame indiretto; si legano ad una proteina adattatrice che si lega alla proteina cargo mediante riconoscimento dell'NLS. Il complesso cargo-importina passa attraverso i pori, anche se è più grande di 9nm INGRESSO DELLE PROTEINE NEL NUCLEO L'ingresso delle proteine nel nucleo avviene in diversi step, avviene lo formazione del complesso cargo importina che si attacca alla superficie del poro e inizia a "camminare" nel poro, saltando da una ripetizione FG (fenilalanina-glicina) all’altra, fino ad arrivare alla cavità centrale del poro, che viene diltata. Arrivata nel nucleo il complesso deve staccarsi, rilasciando così il cargo, questo è permesso dalla proteina RAN che lega l'importina e fa rilasciare il cargo idrolizzando GTP. 118 RAN Sono anche chiamate interruttori molecolari e si presentano in 2 conformazioni: RAN-GDP; Inattiva RAN-GTP; attiva Lo switch è regolato da GEF e GAP: GEF; attivano da RAN-GDP a RAN-GTP GAP; disattivano da RAN-GTP a RAN-GDP Sono legate alle RAN sottoforma di RAN-GAP e RAN-GEF ed hanno distribuzione diversa: RAN GEF si trova nel nucleo, dove attiva la RAN che potrà idrolizzare GTP e staccare il complesso; RAN GAP sitrova nel citosol, dove disattiva la RAN che tornerà poi nel nucleo per essere attivata. GEF e GAP sono ferme rispettivamente in nucleo e citosol, mentre le RAN si spostano tra nucleo e citosol. L'importina ha un sito di legame per il cargo e uno per RAN- GTP; in particolare l'importina usa un'elica per bloccare il cargo ma tale elica si sposta proprio quando avviene il legame con RAN-GTP, che infatti induce un cambio conformazionale TRASPORTO NUCLEO-CITOSOL I segnali di esportazione sono chiamati NES (Nuclear Export Signals) e sono delle specifiche sequenze amminoacidiche. L’export nucleare è mediato dalle esportine. La proteina che deve essere esportata si lega prima alla esportina, poi si lega Ran-GTP che ne stimola l’uscita attraverso il poro nucleare. Le esportine sono di tre tipi: 1. hnRNP A1 (38 residui amminoacidici) 2. hnRNP (k) 3. PK1 e Rev (ricche di leucina) Nel citosol la RAN GAP stimola l’idrolisi della GTP in GDP + P e la dissociazione di tutto il complesso. Importine ed esportine formano la classe delle carioferine. 119 REGOLZIONE DEL TRASPORTO Il trasporto è finemente regolato grazie ad un mascheramento del segnale mediante 2 meccanismi: Legame con proteine inibitorie; Fosforilazione; Le proteine, come i fattori trascrizionali, vengono ugualmente prodotti (per essere sempre disponibili in caso di necessità), ma il loro ingresso è regolato. Ciò rende molto veloce la risposta allo stimolo. Ad esempio NF-kB è bloccato dal legame del segnale NLS con il suo inibitore IKB, ciò impedisce che l'importina legga NLS e lo trasporti nel nucleo. In seguito a stimolo, che in questo caso è infiammatorio come il TNF (Tumor Necrosis Factor), viene degradata IKB Ciò è stato dimostrato formalmente grazie al frazionamento nucleo-citosol, prima (-TNF) e dopo (+TNF) lo stimolo. Nel caso degli ormoni steroidei ad esempio, recettori sono legati ad HSP90 che maschera il sito di legame: quando l'ormone arriva si lega al recettore che si stacca da HSP90 e fa smascherare il sito di legame. A questo punto il complesso ormone-recettore entra nel nucleo e attiva la trascrizione. Nel caso dei linfociti T ad esempio abbiamo un altro meccanismo: NF-AT, il fattore di trascrizione dei linfociti T, si trova fosforilato (inattivo), nel citosol, con l’NLS mascherato. Per essere attivato deve essere defosforilato da una fosfatasi, la calcineurina, Ca2+ dipendente. Perciò se il Ca2+ si innalza si attiva la calcineurina che defosforila e attiva NF-AT, smascherando NLS e mascherando NES (segnale di importazione). L'importina riconosce il segnale e li importa, NF-AT attiva la trascrizione genica, quando i livelli di Ca2+ si abbassano la calcineurina si stacca e NF-AT è fosforilato, in questo modo NES è smascherato ed NLS è coperto, così NF- AT viene portato fuori. Ciò è stato dimostrato marcando con uno fluoroforo NF-AT e osservando il movimento citosol nucleo. 120 BIOGENESI DEGLI ORGANELLI DELLA VIA SECRETORIA La via secretoria la possiamo definire una via fondamentale per lo scambio di materiale tra la cellula e l’ambiente extracellulare. Viene definita via perché è composta da una serie di organelli che fungono da starting point (RE), poi c’è l’apparato di golgi, dopo c’è un bivio, perché il viaggio può proseguire verso l’esterno della cellula alla membrana plasmatica o agli endosomi. Il trasporto è mediato da vescicole, e infatti noi parliamo di traffico vescicolare. Il traffico del cargo consente di trasportare proteine, mentre il traffico di membrane (vescicole di 70-80nm) permette di trasportare i lipidi. Circa un quarto del proteoma umano utilizza la via secretoria. Ci sta una piccolissima percentuale di proteine che non vengono secrete con dalla via secretoria ma hanno una “unconventional secretion”. Noi abbiamo due grossi flussi anterogrado e retrogrado. Questi due flussi opposti mantengono un equilibrio dinamico che può essere momentaneamente cambiato nel corso della vita cellulare. La traduzione avviene nel citosol, e questo vale pure per le proteine della via secretoria. Nel caso delle proteine della via secretoria abbiamo un meccanismo di traslocazione co-traduzionale Andando a coniugare una proteina con un anticorpo legato ad un fluoroforo verde, si osserva un reticolo che si estende dalla parte più interna della cellula. Ci sono delle regioni di questo reticolo che sono più schiacciati che sono chiamati ER sheets, che sono più appiattiti e hanno funzioni differenti. L’involucro nucleare è in connessione con i microtubuli del reticolo. Quando gli studiosi hanno usato la microscopia elettronica (), hanno scoperto che nell’ambito di questa rete di tubuli membranosi, ci sono alcuni più appiattiti di altri, e alcuni con puntini neri (ribosomi). Dall’analisi tomografica (→) del reticolo endoplasmatico, emergono zone più appiattite, alle quali sono annesse i ribosomi e altre che sono più lisce. 121 Isolando il reticolo, esso si frammenta in microsomi, che sono delle specie di vescicole più grandi (100- 200nm). Quelli che provengono dalla regione liscia rimangono liscie quelli ruvidi rimangono ruvidi. Mediante centrifugazione essi vanno in diverse regioni della provetta e attraverso le analisi si è capito che hanno composizione chimica diversa. Per esempio nei microsomi lisci è stata trovata la pompa calcio ATPasi. RETICOLO ENDOPLASMATICO LISCIO Nel REL avvengono: la sintesi dei lipidi attraverso enzimi citosolici sintesi di ormoni steroidei (ovviamente tessuto-specifiche), deposito di calcio, reazioni di detossificazione (specialmente nel fegato), attraverso citocromi della famiglia dei P450 metabolismo del glicogeno (attraverso proteine con domini transmembrana). RETICOLO ENDOPLASMATICO RUVIDO Nel RER avvengono: ripiegamento delle proteine, formazione di ponti disolfuro, oligomerizzazione delle proteine, glicosilazione (delle asparagine) rimodellamento delle catene oligosaccaridiche controllo di qualità. L’IMPORTAZONE DI PROTEINE NEL RETICOLO ENDOPLASMATICO AVVIENE CO- TRADUZIONALEMNTE Le proteine che devono entrare nella via secretoria, vengono prodotte dal ribosoma nel citosol. La prima parte tradotta è la sequenza segnale che viene intercettata dalla SRP, che riconosce il recettore sul reticolo endoplasmatico, il cui compito è quello di trasferire il la proteina dentro il RER mediante il traslocone. 122 5 ELEMENTI CHIAVE SONO COINVOLTI NELLA TRASLOCAZIONE CO-TRADUZIONALE 1. Peptide segnale 2. Particella srp 3. Recettore di srp 4. Traslocone 5. Peptidasi del segnale Il peptide segnale si trova all’N terminale, è lungo 15-45 aa ed è fortemente idrofobica. È molto variabile, ma nella regione centrale ci deve essere sempre una sequenza LLLVGILF (fortemente idrofobico). Questo peptide segnale ha anche un ruolo meccanico perché stabilirà delle interazioni idrofobiche con gli aa della regione di contatto con il traslocone. La SRP (signal recognition particle) è costituita da 1 RNA e 6 proteine. L’RNA ha una funzione di scaffolding e lo rende particolarmente flessibile, e questo gli permette di avere proteine spazialmente orientate. Tra queste proteine, le più importanti sono quella che possiede il sito di legame per il peptide segnale (che ha residui aa che ne stabilizzano l’interazione) e quella che ha il sito di legame per la subunità maggiore del ribosoma. La SRP blocca la subunità maggiore del ribosoma per mettere una pausa nella traduzione. Questo perché tra le due subunità, durante la traduzione, è quella maggiore che si spinge avanti per prima. Il recettore di SRP è localizzato sul RER. Dopo il riconoscimento il complesso può essere trasferito sul traslocone. Esso è Proteina transmembrana del RER Costituito da 2 subunita’ (SRα ed SRβ) Si distacca da SRP con idrolisi di GTP 123 Il traslocone (sec61) è un poro acquoso attraverso cui deve passare la proteina che deve entrare nel reticolo. Ha una α-elica che chiude e fa da tappo. Quando il traslocone non è impegnato si trova nella configurazione chiusa. Quando arriva il segnale peptidico, il traslocone si apre per il passaggio della proteina che sta nascendo, ma non si perde materiale del RE perché comunque il passaggio è bloccato dalla proteina nascente. Il traslocone è composto da 3 subunità. Nel 2021 è stato possibile isolare la struttura del traslocone attraverso la crioelettromicroscopia. È una struttura altamente complessa. Ci sono delle porzioni che individuano il peptide segnale proprio riconoscendone la lunghezza e instaurando delle interazioni idrofobiche. Si è anche visto perché a volte ci sono proteine che hanno peptidi segnali meno efficienti, che sono un problema per la cellula, perché potrebbero essere persi o andare da un'altra parte. La peptidasi del segnale è un complesso multiproteico luminale, che in maniera molto precisa riconosce la sequenza segnale e lo taglia. Il fatto che il peptide segnale è eliminato è stato scoperto pesando la proteina fuori e dentro la membrana. TAKE HOME MESSAGE Le proteine della via secretorie: 1. vengono sintetizzate 2. inizia la sintesi 3. si blocca la sintesi 4. viene riconosciuto il segnale 5. viene traslocata 6. viene inserita nel lume o nella membrana del RE TRASLOCAZIONE DI PROTEINE SOLUBILI Nella traslocazione di una proteina solubile il peptide segnale verrà rimosso TRASLOCAZIONE DI PROTEINE DI MEMBRANA Le proteine di membrana invece hanno il peptide segnale e anche un segnale di natura idrofobica che le permette di farla passare nella membrana e induce un ulteriore cambio conformazionale della proteina traslocatrice che le permette di entrare nel bilayer. 124 PROTEINE DI MEMBRANA CON SEGANLE INTERNO Esistono proteine della via secretoria che hanno un diverso orientamento, che viene acquisito nel reticolo. Alcune proteine, dove il peptide segnale è più interno e quindi non viene riconosciuto ne tagliato dalla peptidasi, possono orientarsi in due modi diversi nella membrana. L’orientamento dipende dalla sequenza amminoacidica: se ha amminoacidi carichi positivamente prima del peptide segnale interno ha orientamento classico, altrimenti sarà invertito Nella nomenclatura internazionale, le proteine della via secretoria con dominio transmembrana, possono essere di due tipi in base a dove hanno l’N-term: tipo 1: nel lume () tipo 2: nel citosol () È importante capire che l’orientazione della proteina nel passare dal RE all’apparato del Golgi rimane invariata, ma quando passa nella membrana plasmatica si inverte. Questo è importante perché una modificazione nel dominio luminale (per esempio una glicosidazione), avrà un corrispettivo nella zona extracellulare. TRASLOCAZIONE DI UNA PROTEINA DI MEMBRANA A PASSAGGI MULTIPLI Per quanto riguarda le proteine multipasso, ci saranno più sequenze segnale (sia segnale idrofobico che di stop della traduzione) per ogni passo. 125 TRASLOCAZIONE DI UNA PROTEINA GPI Le proteine che non hanno dominio transmembrana, ma sono legate lo stesso alla membrana attraverso glicosilfosfatidilinositolo, dopo il passaggio nel RE vengono: 1. tagliate 2. il segnale al C-terminale trasferisce la proteina grazie all’enzima GPI-transamidasi UNA PICCOLA PERCENTUALE DI PROTEINE ENTRANO NEL RE CON UN MECCANISMO DI TRASLOCAZIONE POST-TRADUZIONALE Poche proteine entrano con meccanismo post- traduzionale, perché non hanno nessuna particella idrofobica che può essere riconosciuta dalla particella SRP. Vengono sintetizzate nel citosol e quando la sequenza è terminata vengono inserite sfruttando il traslocone e altri fattori come Sec 62, 63, 71, 72 che riconoscono la sequenza segnale al C-terminale. La proteina entra grazie a Bip, che se la tira con idrolisi di ATP. MODIFICHE POST-TRADUZIONALI 1. Tutte le proteine devono essere ripiegate e per farlo vengono aiutate da chaperonine come BiP, GRP78, HSPA5. 2. Un’importante proteina residente nel RE è la proteina disolfuro isomerasi (PDI), che catalizza l’ossidazione di gruppi sulfidrilici (SH) liberi su cisteine per formare legami disolfuro (S–S). Quasi tutte le cisteine nei domini proteici esposti sullo spazio extracellulare o nel lume degli organelli della via secretoria e di quella endocitica formano legami disolfuro. I legami disolfuro non si formano invece nei domini esposti nel citosol a causa dell’ambiente riducente ivi presente. 3. Alcune proteine sono costituite da più subunità. Le subunità si associano nel RER e spesso l’oligomerizzazione è necessaria per farle uscre dal RER. Per esempio i linfociti b producono gli anticorpi nel RER. 126 N-GLICOSILAZIONE Quasi il 90% delle proteine vengono glicosidate. Nel reticolo endoplasmatico avviene la N-glicosidazione. Viene aggiunto un oligosaccaride al gruppo ammidico di una asparagina che si trova in una regione consenso. L’olicosaccaride è formato da 14 zuccheri: 2 N-acetilglucosammina 9 mannosio 3 glucosio. L’oligosaccaril trasferasi catalizza il trasferimento dell’oligosaccaride preformato sulla proteina, riconoscendo l’asparagina nella regione consenso (Asn-X-Ser o Asn-X-Thr). La N-glicosilazione avviene co-traduzionalmente L’oligosaccaride è già formato e ancorato alla membrana del RE grazie ad un lipide (dolicolo). È formato attraverso reazioni sequenziali nel citosol da specifici enzimi, poi una flippasi fa invertire il dolicolo e l’oligosaccaride viene trasferito nel lume del RE dove finisce la sintesi. A volte questo processo può avvenire cotraduzionalmente. Stesso nel RE queste proteine glicosidate subiscono un rimodellamento. Perdono 3 glucosi e 1 mannosio, grazie a glucosidasi e mannosidasi. Solo a quel punto le proteine possono uscire dal reticolo. 127 CONTROLLO DI QUALITA’ Il reticolo endoplasmatico aiuta le proteine a ripiegarsi grazie alle chaperon, le quali possono anche trattenere nel reticolo le proteine piegate male. Se la proteina è ben ripiegata, i glucosi rimossi inducono la proteina a entrare in vescicole per essere esportata. Le proteine mal ripiegate, invece, vengono riconosciute dalle glucosiltrasferasi, che invece rimettono i glucosi e ne impediscono l’esportazione. Il glucosio aggiunto nuovamente è riconoscibile da calnessina (proteina di membrana) o da calreticulina (proteina nel reticolo) grazie al loro dominio lectinico che le aiutano a ripiegarsi. Il reticolo endoplasmatico è ricco di chaperone, come: Bip (che riconosce le proteine mal ripiegate, riconoscendo gli amminoacidi idrofobici esposti nel citosol), Calnexina e Calreticulina (che riconoscono l’oligosaccaride), Hsp70 Erp57. Per le proteine che continuano ad essere mal ripiegate, il RE non solo controlla, ma riesce anche a liberarsene attraverso un complesso di retro traslocazione. Le proteine mal ripiegate vengono legate dagli chaperone come Bip, le simil- calnexine e calnecticuline (delle lectine) e le cedono al complesso traslocatore. Le AAA-ATPasi idrolizzano ATP e portano nel citosol le proteine. Le ubiquitin ligasi le indirizzano ai proteosomi. 128 L’“OROLOGIO MOLECOLARE”. La distinzione tra una proteina non funzionante ed un intermedio di ripiegamento è fondamentale per evitare di degradare proteine funzionanti. Tale distinzione è fatta in 2 modi: 1. Aggiunta di glucosio: avviene mediante glucosil-trasferasi e poi viene riconosciuta da calnexina o calreticulina che tentano di ripiegarla nel modo corretto. Questa struttura oligosaccaridica viene riconosciuta dalle simil lectine luminali. Le proteine ben ripiegate se ne devono uscire dal reticolo e quindi non riusciranno ad essere substrato da queste mannosidasi. 2. Rimozione di un mannosio: avviene mediante una mannosidasi che rimuove un mannosio dalle proteine che non riescono a ripiegarsi (orologio molecolare), viene poi riconosciuta da lectina che porta al complesso retrotraslocatore Entrambe queste modifiche sono quindi apportate a proteine mal ripiegate e quindi non funzionanti. L’accumulo di proteine mal ripiegate scatena la UPR (Unfolded Protein Respose) in risposta allo stress del RE stesso. Tale rispostaè necessaria per ritornare all’equilibrio. Ci sono 3 attori molecolari proteine della membrana del RE che in generale portano ad un aumento delle chaperone che mediano il ripiegamento: IRE 1: regola lo splicing di un mRNA nel citosol (al posto che nel nucleo) attivando la trascrizione di chaperone nel nucleo. Si attiva dopo dimerizzazione. PERK: ha un dominio chinasico mediante il quale si autofosforila dimerizza e si attiva e inattiva mediante fosforilazione i fattori di inizio della traduzione e quindi blocca temporaneamente la sintesi proteica, riducendo il numero di proteine ATF 6: lascia il reticolo e se ne va nel golgi, dove incontra una proteasi. Subisce un taglio proteolitico sul dominio citosolico, che andrà nel nucleo aumentando la trascrizione dei geni delle chaperone. Se questi sistemi non funzionano in modo corretto si ha lo sviluppo di malattie, come per la fibrosi cistica, in cui si ha un accumulo di proteine nel RER. 129 130 TRASPORTO MEDIANTE VESCICOLE Le proteine solubili possono essere secrete da vescicole, le quali poi si dovranno fondere con il bilayer dell’organello target. Il traffico vescicolare è altamente regolato. La regolazione avviene a livello: della selezione del cargo, nella formazione e gemmazione della vescicola, nel trasporto della vescicola stessa nella fusione con l’organello bersaglio. Esistono diversi tipi di vescicole. Esse hanno più o meno le stesse dimensioni (70nm), ma hanno forme diverse perché hanno rivestimenti diversi. Attorno al bilayer della vescicola ci sono delle proteine che le rivestono come clatrina, COPI e COPII. Inoltre vescicole diverse mediano trasporto di proteine diverse. Le vescicole rivestite da COPII mediano il trasporto anterogrado dal RE all’apparato di golgi Le COPI fanno il movimento opposto (retrogrado). Le vescicole rivestite da clatrina fanno muovere le vescicole dal TGN, ovvero il sottocompartimento del Golgi, le cui vescicole andranno verso la membrana plasmatica o verso il sistema endolisosomiale. Le vescicole di clatrina possono essere trovate pure sulla membrana plasmatica dove mediano l’endocitosi. 131 IL RIVESTIMENTO È COMPOSTO DA UN GRANDE COMPLESSO MULTIPROTEICO Clatrina, COPI e COPII sono complessi multiproteici che formano delle gabbie proteiche intorno alle vescicole. Delle proteine favoriscono il reclutamento del rivestimento sul compartimento giusto (ARF). Sono delle GTPasi monomeriche, in cui lo stato attivo è legato a GTP mentre quello inattivo è GDP legato.Il cambio conformazionale è mediato da GEF e GAP specifiche. Il rivestimento serve a formare la vescicola (curvando i lipidi, che autonomamente non avrebbero la forza per farlo) e a selezionare il cargo. DINAMINE La gemmazione o pinch off delle vescicole richiede dinamina e altre proteine ad essa associate. Le dinamine sfruttano il dominio GTPasico per avvolgersi attorno al collo della vescicola fino a strozzarlo. Il mutante shibire (mutazione della dinamina) non permette alla vescicola di staccarsi: la vescicola diventa sempre più grande senza mai staccarsi. mutante shibire 132 LE PROTEINE RAB SONO GTPasi MONOMERICHE Per fare in modo che le vescicole raggiungano il compartimento giusto, intervengono le proteine RAB, che sono delle GTPasi monomeriche. Nelle nostre cellule ci sono più di 50 RAB (alcune delle quali sono isoforme specifiche), ognuna con la propria precisa localizzazione: le Rab, come i fosfoinositidi, identificano a livello molecolare i vari organelli. Anche queste proteine nascono come citosoliche, ma quando si attivano smascherano il dominio GTPasico e si legano allo specifico organello. Ogni Rab attiva degli effettori che hanno il loro ruolo nella cellula. Gli effettori possono essere: motori proteici (proteine che permettono il movimento attraverso i microtubuli) proteine di thetering snare. 133 TETHERING Il tethering è l’attracco della vescicola all’organello. Le proteine t-SNARE (uno degli effettori delle Rab) aiutano l’avvicinamento della vescicola. La direzionalità della vescicola è data dalle Rab. L’ultimo controllo è fatto dall’accoppiamento t-snare / v-snare. Queste sono proteine con domini elicoidali. Le v-snare (sulle vescicole) hanno un unico dominio, le t-snare (sulla membrana dell’organello) ne hanno 3. Se il riconoscimento è quello corretto, si ha un legame stretto tra questi domini, che elimina l’acqua tra i due bilayer, in modo da far fondere i due bilayer. La NSF (N-ethylmaleimide sensitive fusion protein, proteina di fusione sensibile al N-etilmaleimide) mediano il distacco delle snare dalla membrana dell’organello target con consumo di ATP. 134 I TAPPA: DAL RE AL GOLGI Ci sono dei specifici sottodomini dei RE da cui gemmeranno le vescicole, chiamati ER Exit Sites (ERES). In che modo avviene la selettività del cargo? Esistono due diversi meccanismi. 1. Uno di assorbimento selettivo mediato da specifici segnali (Selective Uptake) 2. l’altro è bulk flow (non mediata dal segnale). La prima condizione per tutte le proteine per uscire dal RE è il corretto ripiegamento: le chaperon trattengono le proteine nel lume del RE finché non vengono ripiegate correttamente. MECCANISMO MOLECOLARE Il processo selettivo è più efficiente, perché il cargo è concentrato negli ERES. Le proteine transmembrana vengono riconosciute direttamente da SEC 24 perché mostrano il segnale direttamente nel citosol. Le proteine solubili vengono legate dal recettore del cargo, che riconosce da un lato la proteina e dall’altro SEC24 (che seleziona il cargo e recluta la COP). Quando un recettore riconosce il segnale ne favorisce l’accumulo nella regione e quindi le proteine vengono smistate più efficientemente. COPII riconosce il segnale. Sono stati trovati segnali diversi e meccanismi diversi di uscita quindi non è possibile trovare un meccanismo generale. La COPII forma una sfera attorno alla vescicola, che permette di curvare il bilayer lipidico. Il COPII è fatto da due tratti: Quello più vicino al bilayer lipidco è formato da Sec23/24 quello più esterno è formato da Sec13/31. 135 Come fanno queste Sec ad essere reclutate? Attraverso la Sar1, che ha un dominio GTPasico. Quando SAR1 si lega alla GEF (che si trova sulla membrana del RE) avviene lo scambio di GDP con GTP, che fa esporre la coda idrofobica di SAR che le permette di legarsi alla membrana. Già soltanto l’inserzione di SAR1 favorisce il curvamento della membrana, che viene accentuato da dal reclutamento di Sec13/31. La selezione del cargo è mediata da Sec24, che ha binding sites per la proteina. Per tutte le vescicole, il rivestimento, dopo la fusione dei bilayer, si perde. Il disassemblaggio avviene grazie all’idrolisi di SAR1, che si stacca dalla vescicola. Il distacco di SAR1 (che recluta) fa destabilizzare il complesso, ma il disassemblaggio è ulteriormente mediato da fattori sull’apparato del Golgi. SEC24 SEC24 è la proteina importante nella selezione del cargo. Nei mammiferi abbiamo 4 isoforme di sec24 (A,B,C,D), ognuna delle quali ha diversi siti di legame, aumentando la pletora di cargo che possono essere riconosciuti. Le proteine adattatrici aumentano la recezione del cargo e a mantenere il legame. Il topo KO Per SEC24C e D muore. Per sec24B nasce ma muore subito e ha una cranio rachischisi (il suo tubo neurale non si forma in maniera corretta). Per SEC24A, vivono con una sopravvivenza paragonabile ai topi wt, ma hanno una riduzione del 40% del colesterolo del plasma (perché il recettore delle LDL non può essere esportato e quindi il colesterolo viene assorbito in maniera eccessiva). 136 VESCICOLE TUBULARI Come fanno cargo grandi (come ad esempio il procollagene) ad essere inglobati nelle vescicole? Queste vescicole vengono formate lo stesso da COPII, ma si forma una vescicola tubulare. Ci sono dei fattori che aumentano il tempo di stabilità di sar1 sulla vescicola, che fa aumentare il reclutamento di proteine che formano COPI e che inibiscono il processo di fissione. Un esempio di questi fattori è tango, la cui alterazione porta ad una malformazioni del tessuto scheletrico e cartilagineo. MUTAZIONI NEL GENE SARA2 CODIFICANTE PER SAR1B SONO ASSOCIATE A TRE DISORDINI DELL'ASSORBIMENTO DEI LIPIDI CMRD: Chylomicron retention disease CMRD-MSS: CMRD associate a Marinesco–Sjogren syndrome AD: Anderson Disease 137 CHE FINE FANNO LE PROTEINE CHE RISIEDONO NEL RE? Ci sono due diversi meccanismi 1. Ritenzione: attraverso clustering (aggregazione fisiologica delle proteine), o in base alla lunghezza del dominio transmembrana non escono mai dal RE 2. Recupero («retrieval»): Una quota di Bip si trova anche all’interno del golgi. Questo vuol dire che ci sono delle proteine che escono dal reticolo e poi ritornano attraverso vescicole se hanno delle sequenze segnale come: a. KDEL, presente nelle proteine solubili b. KKXX, presente sulle proteine di membrana ERGIC (ER Golgi Intermediate Compartment) Il recupero è fatto sia direttamente dal golgi che dall’ERGIC (ER Golgi Intermediate Compartment, compartimento intermedio tra ER e Golgi), dove arrivano sia le proteine che devono andare all’apparato del golgi sia al RE. In questo ERGIC ci sono recettori che riconoscono le proteine che sono fuggite, ma anche proteine che sono malripiegate e che sono sfuggite al sistema di controllo. Per esempio sono state trovate IgM monomeriche nell’ERGIC dei linfociti, il cui destino è quello di essere riparate Ci sono proteine che gemmano dal RE, grazie al rivestimento di COPII altre che risiedono nel reticolo, e che, dal compartimento intermedio tornano indietro in vescicole rivestite con COPI grazie ad un recettore che riconosce il segnale KDEL. 138 COP1 COPI è fatta da tante proteine così come la II, ma queste 7 proteine, già a livello citosolico formano un complesso eptamerico chiamato coatomero. Queste stanno in una formazione non attiva. Grazie ad ARF, vanno in una conformazione più aperta che aiuta il reclutamento. Saranno tanti di questi coatomeri che aiutano la formazione della vescicola Il disassemblaggio di COP1 è molto più veloce di COPII e l’idrolisi di ARF1 da parte della sua GAP induce il disassemblaggio del coatomero 139 APPARATO DEL GOLGI Una parte del complesso di Golgi è fatto da cisterne membranose molto appiattite e impilate l’uno sull’altro come pancake. Sono strettamente vicine le une alle altre. Inoltre ha una precisa curvatura. La zona concava guarda la membrana plasmatica (trans o TGN) e la zona convessa guarda il reticolo (cis o CGN). TGN e CGN sono le zone più dinamiche. Il golgi è fatto da più pile o golgi stack (dalle 4 alle 6) che sono tenute insieme dal golgi ribon. Nelle cellule umane il golgi si trova in zona perinucleare, formando una periluna.(↓) In una cellula vegetale ci sono tanti spot del golgi perché non c’è il golgi ribbon. Questo può succedere nelle cellule animali durante la mitosi e la meiosi. Questo permette all’apparato del golgi di essere distribuito alle cellule figlie. PROTEINE GRASP La struttura cosi peculiare è mantenuta una da una famiglia di proteina chiamata GRASP, che fanno parte della matrice del golgi. Queste hanno il ruolo tenere le pile spazialmente vicine e una legata all’altra. GRASP65 unisce la zona cis e mediale, GRASP55 unisce la mediale con la trans. Facendo topo KO di un una o l’altra GRASP, il golgi si disassembla solo parzialmente, mentre facendolo doppio KO il Golgi si disassembla completamente GOLGINE Le golgine formano una struttura filamentosa coiled-coil fuori dal golgi e hanno domini di interazione con il citoscheletro, legando microtubuli e vescicole. Fanno da ponte sia con il citoscheletro sia con le proteine RAB (che stanno sulla vescicola) per mantenere le vescicole al golgi 140 CISTERNE DEL GOLGI Ogni cisterna dell’apparato del golgi ha la sua identità molecolare. Se noi andiamo ad eseguire delle colorazioni usando diverse molecole come osmio o una nucleoside fosfatasi, non tutte le cisterne si vanno a colorare, perché molecole diverse hanno diverse affinità con composti diversi. Si è cercato anche di guardare meglio anche a livello 3d ed è stato possibile trovare uno stack di golgi a livello tridimensionale. Associando l’analisi tridimensionale della tomografia con la microscopia elettronica è possibile creare un modello 3d. Mediante centrifugazione differenziale si possono separare i vari organelli dal citosol delle cellule, mentre usando il gradiente del saccarosio è possibile frazionare l’apparato del Golgi. Facendo l’analisi molecolare è stato possibile studiare tutte le funzioni delle varie cisterne dell’apparato del golgi. (vedi figura) Nell’apparato del golgi avvengono: rimodellamento dei glicani, o-glicosilazione, fosforilazione, solfatazione/acilazione. 141 GLI N-GLICANI SONO RIMODELLATI NELL’APPARATO DI GOLGI Grazie al rimodellamento nell’apparato nel golgi dell’oligosaccaride vicino la proteina (proteina-specifico), le proteine potranno avere un oligosaccaride ad alto mannosio, oppure altri tipi di modifiche fino a creare un oligosaccaride complesso. Possono essere aggiunti: N-acetil glucosammina, acido sialico galattosio. Il golgi è ricco di questi enzimi che trasferiscono questi zuccheri, ma ogni cellula avrà concentrazioni diverse di questi enzimi per glicosidare differentemente le proteine specifiche di quel tessuto. Questo ovviamente influisce il differenziamento cellulare. Le varie tappe della glicosilazione avvengono in diverse zone del golgi. 1. Un primo rimodellamento avviene nel RE che aggiunge il polisaccaride. 2. Nella cisterna cis vengono rimossi 3 mannosi. Ovviamente le proteine ad alto mannosio si fermeranno qui. 3. Mano a mano che le proteine transitano, esse incontrano N-acetilglucosammina trasferasi, mannosidasi ecc. Con un test tramite l’enzima Endo H, si è visto che le proteine che transitano dal medial al trans golgi subiscono un completamento del rimodellamento. ESPERIMENTO CON ENDO H Prendiamo le nostre cellule e le lisiamo. Una parte del substrato lo trattiamo con endo H e una parte senza. Quello che viene trattato perde alcuni zuccheri e quindi il peso della proteina diminuisce. Noi sappiamo che questo enzima funziona soltanto su determinati zuccheri che vengono aggiunti soltanto in alcune zone del golgi, e quindi questo esperimento è utile per seguire il processo di maturazione della proteina. 142 O-GLICOSILAZIONE La o-glicosilazione avviene sui gruppi OH di Ser e Thr. Nel golgi ci sono altre glicosil- trasferasi che aggiungono uno zucchero alla volta. La glicosilazione ha diversi ruoli. Le mucine per esempio, che vengono secrete dagli epiteli, servono a formare i muchi. I proteoglicani sono componenti della matrice extracellulare. Ovviamente la glicosilazione aumenta il PM delle molecole. Le cisterne del golgi hanno una serie di antiporti che servono a far scorrere gli zuccheri, in particolare fanno entrare UDP-galattosio e fanno uscire UMP. Il gruppo fosfato perso esce attraverso specifiche permeasi. SOLFATAZIONE Un'altra modifica è la solfatazione, che avviene attraverso la PAPS (fosfoadenosinafosfosolfato). L’APPARATO DI GOLGI È UN IMPORTANTE SITO DI SINTESI/MODIFICA DI LIPIDI Non soltanto le proteine in transito sono bersaglio delle modifiche nel Golgi, ma anche i lipidi che fanno parte delle membrane. I glicosfigolipidi, e le sfingomieline, a partire dal ceramide prodotto dal RE, vengono modificati per formare gangliosidi o cerebrosidi. COME LE PROTEINE SI MUOVONO TRA LE CISTERNE DELL’APPARATO DI GOLGI Il trasporto di molecole attraverso l’apparato del golgi non si conosce ancora: Alberto Luini: le vescicole mantengono la loro identità molcolare. Le varie cisterne maturano grazie al trasporto retrogrado degli enzimi presenti nelle cisterne successive. Rothman: ci sta un flusso continuo di vescicole sia anterogrado (frecce rosse) che retrogrado (frecce blu). In realtà probabilmente entrambe le teorie sono valide: ci sono evidenze che le confermano entrambe. 143 LE PROTEINE LISOSOMIALI ARRIVANO DAL TGN Le proteine prodotte dal golgi dovranno essere selettivamente impacchettate per raggiungere le varie destinazioni. Il TGN è proprio il centro di smistamento di queste proteine, che possono andare al sistema endolisosomiale, oppure verso la membrana plasmatica per integrarsi alla membrana o per essere secrete. Ovviamente le proteine che devono rimanere nel golgi non vengono secrete. Il meccanismo non è chiaro ma forse dipende dalla lunghezza del dominio transmembrana, che le rende più stabili in associazione della membrana del compartimento in cui si trovano. Abbiamo due diverse vie che portano alla membrana pasmatica: 1. Via costitutiva (o di default), che non è mediata da nessun segnale. Non è chiaro come si formino queste vescicole, ma le zattere lipidiche hanno un ruolo fondamentale nella formazione delle vescicole, insieme ovviamente alle proteine. 2. Via regolata, in cui c’è un segnale (come un cluster di proteine) Se il macchinario molecolare dello smistamento è mutato, si avrebbe un traffico disordinato. Per esempio nel diabete nefrogenico, una delle mutazioni individuate, è proprio un segnale di smista